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문제 정의
- 본 논문에서는 고로쇠나무 심재로부터 분리된 7종의 페놀성 화합물의 화학구조를 보고하고, 그 중 주요 물질인 2종의 coumarinolignan 화합물을 적용하여 제조된 β-CD 포접화합물 및 이복합체를 바탕으로 얻어진 해당 coumarinolignan 화합물 2종의 암세포 독성 효능에 대해 기술하고자 한다.
제안 방법
-
결과 및 고찰
고로쇠나무 심재에 존재하는 화합물의 분리를 위해 해당 원재료에 대한 MeOH 추출물을 제조하였고, 이를 대상으로 용매 극성에 따른 분획을 시행하여 n-hexane, EtOAc, n- BuOH 및 H2O 등 4종의 분획물을 획득하였다. 이어 EtOAc 분획물에 silica gel chromatography, HPLC 등을 적용하여 총 6종의 화합물을 분리하였다 (Fig.
- 기기 및 시약 −1D 및 2D를 포함한 NMR 스펙트럼은 1Varian사의 INOVA 500MHz NMR( H: 499.998 MHz)과1VNMRS 600 MHz NMR spectrometer( H: 600.006 MHz) 를 이용하여 측정하였다. MS는 Varian 320-MS TQ mass spectrometer를 이용하여 negative electrospray ion(ESI) mode에서 측정하였으며, CD(circular dichroism) 스펙트럼은 JASCO J-810 spectrometer를 이용하였다.
- 의해 평가되었다. 사람 유래 HCT116 대장암세포 (HCT116 colon cancer cells)와 암-연관 섬유아세포(cancer- associated fibroblasts)를 10% FBS와 1% penicillin/strepto-omycin이 첨가된 DMEM 배지에 분주하고 37 C로 유지되는 5% CO2 배양 기 내에서 유지하였다. 그 후 각 세포를 963well plate에 동일하게 분주하고(6×10 cells/well), 24시간 동안 배양하였다.
- 58g) 분획물을 얻었다. 심재 EtOAc 분획물 일부를 silica gel 60 chromatography에 적용하고 CHCl3-MeOH(0.5% formic acid 함유) 조건으로 극성을 증대(24:1→20:1→15:1 →10:1→6:1→3:1→1:1, 100% MeOH)시키면서 용출하여 총 12종의 분획(F01-12)을 획득하였다. 화합물 분리 정제를 위해 최종적으로 각 분획에 대하여 semi-preparative HPLC를 적용하였고, 그 결과, MeCN-0.
- 고속 진동 마쇄를 통해 얻은 물질을 증류수에 1mg/mL 농도로 녹이고, 8000g에서 10분 동안 원심분리(Hanil Science Industrial, MICRO 17TR) 하여 포접되지 않은 free cleomiscosin을 제거하였다. 이 과정을 추가 반복하여 상등액을 취합하고 동결 건조하였으며(Samwon Engineering, SFDSM12), 제조된 입자의 모양과 표면전하를 SEM 및 ELS-Z의 zeta-potential 모드에서 각각 측정하여 확인하였다. 입자의 hydrodynamic size를 검사하기 위하여 동결건조된 시료를 물에 녹이고 ultra-sonication을 1분 동안 실시(Sonics and Materials Inc.
- 것이 발견되었다. 이는 친수성(親水性) 배지 환경에서두 화합물의 극도로 낮은 용해성이 해당 생리활성의 결과획득에 장애가 된 것으로 판단되었으며, 이에 난용성 coumarinolignan 화합물 1 및 2의 가용화를 위해 β- cyclodextrin을 이용하여 포접화합물을 제조하고, 이 포접화합물을 세포에 적용하여 암세포 증식 억제 효능을 측정하였다. β-Cyclodextrin(β-CD)은 7개의 D-glucopyranose가 α (1→4)-glycosidic bond를 형성하여 만들어진 환상(環狀) 올리고당으로서 내측에 소수성(疏水性)의 공강(空腔)과 외측에 친수성(親水性)이 있는 수산기가 배열된 원통(cylinder) 형의 구조를 지니고 있다.
- 세포배지 환경에서 화합물 1과 2 는 극도로 낮은 용해성으로 인해 세포배지 환경에서 다시 석출되어 세포막에 침전을 형성하는 현상을 일으켰으며, 이는 MTT법의 장애요소로 나타났다. 이를 개선하기 위하여 cleomiscosin C(1)와 D(2)가 로딩된 β-cyclodextrin(β-CD) 나노입자를 제조하였으며, 이 복합체는 고속진동마쇄계(high- speed vibration milling system)에서 β-CD와 함께 고체상 반응(solid-state reaction)에 의해 생성되었다. 상기 방법을 거쳐 생성된 각 cleomiscosin-CD 포접화합물에 함유되어 있는 cleomiscosin의 함유량(percentage compound content)은 UV spectroscopy에 의해 15.
- O 등 4종의 분획물을 획득하였다. 이어 EtOAc 분획물에 silica gel chromatography, HPLC 등을 적용하여 총 6종의 화합물을 분리하였다 (Fig. 1). 효율적인 성분분석을 위해 각 화합물의 HPLC profile과 UV spectra가 DAD (diode array detector)를 바탕으로 190-400 nm에서 스캔하여 수집되었다.
- 그 후 각 세포를 963well plate에 동일하게 분주하고(6×10 cells/well), 24시간 동안 배양하였다. 이어 기존의 culture media를 제거하고 serum-free media로 교체한 후, cleomiscosin과 β-CD 포접복합체를 일정 농도로가하여 48시간 동안 배양하였다. 세포의 활성도(cell viability %)를 측정하기 위하여 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 용액(1mg/mL)을 가 하고 3시간 동안 더 배양하였다.
- 이 과정을 추가 반복하여 상등액을 취합하고 동결 건조하였으며(Samwon Engineering, SFDSM12), 제조된 입자의 모양과 표면전하를 SEM 및 ELS-Z의 zeta-potential 모드에서 각각 측정하여 확인하였다. 입자의 hydrodynamic size를 검사하기 위하여 동결건조된 시료를 물에 녹이고 ultra-sonication을 1분 동안 실시(Sonics and Materials Inc., Model VC 750) 한 후, ELS-Z를 이용하여 DLS (dynamic light scattering) 모드에서 검정하였다. 생성된 포접복합체에서 cleomiscosin 화합물의 부하율(loading efficiency)은 UV- Vis spectroscopy(Hitachi spectrometer U-2000)를 통해 확인되었다.
- 5% formic acid 함유) 조건으로 극성을 증대(24:1→20:1→15:1 →10:1→6:1→3:1→1:1, 100% MeOH)시키면서 용출하여 총 12종의 분획(F01-12)을 획득하였다. 화합물 분리 정제를 위해 최종적으로 각 분획에 대하여 semi-preparative HPLC를 적용하였고, 그 결과, MeCN-0.1% formic acid 함유 H2O을이용, 13:87→50: 50조건에서 50분 동안 용출하여 분획 F03 에서 화합물 1과5를, 분획F04에서 화합물 2를, F09에서 화합물 3을 획득하였으며, 분획F10 (MeCN-0.1% formic acid 함유 H2O 조건, 13:87→40:60, 50분)에서 화합물 6을, F11 분획(MeCN-0.1% formic acid 함유 H2O 조건, 20:80 →25:75, 40분)에서 화합물 4를 획득하였다.
대상 데이터
- MS는 Varian 320-MS TQ mass spectrometer를 이용하여 negative electrospray ion(ESI) mode에서 측정하였으며, CD(circular dichroism) 스펙트럼은 JASCO J-810 spectrometer를 이용하였다. HPLC는 DAD (diode array detector)가 장착된 Agilent사의 HP1100 seriesTM를 이용하였으며, column으로 Waters사의 SunFire C18TM(4.6×150mm, 5µm) 및 SunFire Prep C18 OBD(5µm, 19×150mm)를 이용하였다. Column chromatography는 Merck사의 silica gel 60(70-230 mesh)을 적용하였다.
- 006 MHz) 를 이용하여 측정하였다. MS는 Varian 320-MS TQ mass spectrometer를 이용하여 negative electrospray ion(ESI) mode에서 측정하였으며, CD(circular dichroism) 스펙트럼은 JASCO J-810 spectrometer를 이용하였다. HPLC는 DAD (diode array detector)가 장착된 Agilent사의 HP1100 seriesTM를 이용하였으며, column으로 Waters사의 SunFire C18TM(4.
- 실험재료−본 실험에 이용된 고로쇠나무(Acer mono Maximowicz)는 2009년 4월에 전남 광양에서 채취되었으며, 목포대학교 약학대학 김현정 교수가 감정한 후 줄기 껍질과 심재를 분리하여 음건하였다. 표본(No.
- 추출 및 분리−고로쇠나무 심재4.30 kg을 잘게 분쇄하고 25 L의 MeOH로 상온에서 3회 추출한 후 감압농축하여 134.0 g의 추출물을 획득하였다. 이 추출물을 증류수에 현탁한 후n-hexane, EtOAc, n-BuOH를 이용, 순차적으로 분획하여 각각 n-hexane(8.
- 1). 효율적인 성분분석을 위해 각 화합물의 HPLC profile과 UV spectra가 DAD (diode array detector)를 바탕으로 190-400 nm에서 스캔하여 수집되었다. 화합물 1, 2 및 5의 UV 스펙트럼을 확인한 결과, 이 화합물들은 330nm 근처에서 강한 흡수 피크를 보여주었으며, 이는 해당 화합물들이 coumarin 유도체임을 시사하였다.
데이터처리
- 상등액을 제거한 후, 생성된 formazan을 DMSO 200µL로 녹여내고 microplate reader(BioRad, Versamax) 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복 실시하여 평균값 (means±SD)을 구하였으며, DMSO 대조군의 흡광도 값을 기준으로 세포 생존율을 비교하였다.
이론/모형
- 고로쇠나무 심재로부터 나온 주요 coumarinolignoid 성분이자, 난용성화합물인 cleomiscosin C(1)와 D(2)에 대한 암세포증식 억제 효능이 사람 유래 대장암 세포 HCT116에서 MTT법으로 평가 되었다. 세포배지 환경에서 화합물 1과 2 는 극도로 낮은 용해성으로 인해 세포배지 환경에서 다시 석출되어 세포막에 침전을 형성하는 현상을 일으켰으며, 이는 MTT법의 장애요소로 나타났다.
- 암세포 증식 억제 활성 평가 −세포의 증식 및 생존율은 MTT법에 의해 평가되었다. 사람 유래 HCT116 대장암세포 (HCT116 colon cancer cells)와 암-연관 섬유아세포(cancer- associated fibroblasts)를 10% FBS와 1% penicillin/strepto-omycin이 첨가된 DMEM 배지에 분주하고 37 C로 유지되는 5% CO2 배양 기 내에서 유지하였다.
- 밝혀졌다. 이중 주요 coumarinolignoid 성분이 자 난용성 화합물인 cleomiscosin C(1)와 cleomiscosin D(2)의 암세포 증식 억제 효능을 HCT116 대장암세포주를 이용하여 MTT법으로 평가하였다. 이는 화합물의 수용성 증대를 목표로 β-cyclodextrin을 이용한 cleomiscosin-CD 포 접화합물을 제조한 후 in vitro assay 계에 적용함으로써 성공리에 이루어졌으며, 세포 활성 결과는 cleomiscosin D(2)가 HCT116 암세포에 대한 선택적인 증식억제효능을 나타냄을 증명하였다.
성능/효과
- 2µg/mL의 cleomiscosin D 가 농도의존적으로 암세포의 증식을 억제함을 보여주었다. 더구나 해당 동일 농도에서 cleomiscosin D는 암-연관 섬유아세포(cancer-associated fibroblasts)에 세포 증식 억제 효능을 나타내지 않는 것으로 확인되었으며, 이 결과로 판단컨대 이 화합물이 HCT116 대 장암세포에 대한 세포 독성만을 선택적으로 나타냄을 시사하였다.
- 두 coumarinolignan 물질은 circular dichroism spectroscopy에서 흡수 밴드를 나타내지 않았다. 또한 HPLC 크로마토그램상에서 보인 각 성분의 분리행태, 즉, retention time(tR)의 차이(cleomiscosin C > cleomiscosin D)가 이들의 congeners인 cleomiscosin A와 B의 결과 (cleomiscosin A > cleomiscosin B)와 동일한 양식으로 나타남이 확인되었다.
- 80)가 존재함을 드러내었고, 그 결합 위치는 (E)-resveratrol aglycone의 C-5임을 HMBC를 통해 확인할 수 있었다. 또한 각 aglycone에 결합된 당의 종 5)류와 위치는 2D NMR과 문헌비교를 통해 이루어졌는데, 화합물 3과 6에 존재하는 당은 하나의 β-D-glucopyranose로 규명되었으며, 화합물 4에는 이 당류인 β-D-apiofuranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranose가 존재함을 알 수 있었다. 각 당의 결합 위치는 HMBC 스펙트럼에서 당의 anomeric proton 과 aglycone의 carbon 사이에 나타나는 correlation 피크를 토대로 C-3 위치로 규명하였다.
- 이를 개선하기 위하여 cleomiscosin C(1)와 D(2)가 로딩된 β-cyclodextrin(β-CD) 나노입자를 제조하였으며, 이 복합체는 고속진동마쇄계(high- speed vibration milling system)에서 β-CD와 함께 고체상 반응(solid-state reaction)에 의해 생성되었다. 상기 방법을 거쳐 생성된 각 cleomiscosin-CD 포접화합물에 함유되어 있는 cleomiscosin의 함유량(percentage compound content)은 UV spectroscopy에 의해 15.6%로 확인되었다.
- 각 당의 결합 위치는 HMBC 스펙트럼에서 당의 anomeric proton 과 aglycone의 carbon 사이에 나타나는 correlation 피크를 토대로 C-3 위치로 규명하였다. 상기분석을 바탕으로 화합물 3, 4와 6의 구조는 5-O-methyl-(E)-resveratrol-3-O-β-D- glucopyranoside(3), 5-O-methyl-(E)-resveratrol-3-O-β-D-apiofu- ranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside(4)와 (E)-resveratrol-3-O- β-D-glucopyranoside(6)로 판명되었다. 기존 연구된 고로쇠나무(A.
- 평가 되었다. 세포배지 환경에서 화합물 1과 2 는 극도로 낮은 용해성으로 인해 세포배지 환경에서 다시 석출되어 세포막에 침전을 형성하는 현상을 일으켰으며, 이는 MTT법의 장애요소로 나타났다. 이를 개선하기 위하여 cleomiscosin C(1)와 D(2)가 로딩된 β-cyclodextrin(β-CD) 나노입자를 제조하였으며, 이 복합체는 고속진동마쇄계(high- speed vibration milling system)에서 β-CD와 함께 고체상 반응(solid-state reaction)에 의해 생성되었다.
- 46 ppm) 에서 관찰되었다. 이 결과는 기존 보고된 문헌과 비교되었으며, 이를 토대로 화합물 2의 구조가 cleomiscosin D임을 확인할 수 있었다. 두 coumarinolignan 물질은 circular dichroism spectroscopy에서 흡수 밴드를 나타내지 않았다.
- 이중 주요 coumarinolignoid 성분이 자 난용성 화합물인 cleomiscosin C(1)와 cleomiscosin D(2)의 암세포 증식 억제 효능을 HCT116 대장암세포주를 이용하여 MTT법으로 평가하였다. 이는 화합물의 수용성 증대를 목표로 β-cyclodextrin을 이용한 cleomiscosin-CD 포 접화합물을 제조한 후 in vitro assay 계에 적용함으로써 성공리에 이루어졌으며, 세포 활성 결과는 cleomiscosin D(2)가 HCT116 암세포에 대한 선택적인 증식억제효능을 나타냄을 증명하였다. 이에 본 연구 결과는 고로쇠나무의 성분 분석 및 생리활성연구의 기초자료로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 천연물 유래 난용성 화합물의 생물 활성평가를 수월하게 진행할 수 있는 방법의 예시 중 하나로 제시될 수 있으리라 사료된다.
- 화합물임을 시사해 주었다. 이중 화합물 3과 4는 한 개의 methoxyl기(δH ~3.80)가 존재함을 드러내었고, 그 결합 위치는 (E)-resveratrol aglycone의 C-5임을 HMBC를 통해 확인할 수 있었다. 또한 각 aglycone에 결합된 당의 종 5)류와 위치는 2D NMR과 문헌비교를 통해 이루어졌는데, 화합물 3과 6에 존재하는 당은 하나의 β-D-glucopyranose로 규명되었으며, 화합물 4에는 이 당류인 β-D-apiofuranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranose가 존재함을 알 수 있었다.
- 천연물 기원의 생리활성 2차대사 산물을 탐색하는 연구의 일환으로, 본 연구실은 고로쇠나무 심재의 EtOAc 추출물에 대한 성분조사 및 분리실험을 진행하였고, 그 결과 2종의 주요 coumarinolignan 성분, cleomiscosin C(1) 및 cleomiscosin D(2)와 더불어 3종의 stilbene 배당체, 5-O-methyl-(E)- resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside(3), 5-O-methyl-(E)-resve- ratrol-3-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside(4) 및 (E)-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside(6), 그리고 1종의 coumarin 물질인 scopoletin(5)이 규명되었다.
- 한편, 고로쇠나무 심재의 주요 화합물 coumarinolignan 성분 1과 2의 암세포 증식억제 효능을 세포주를 이용하여 평가하는 중, 두 화합물이 세포배지에서 용해되지 않고 석출되는 것이 발견되었다. 이는 친수성(親水性) 배지 환경에서두 화합물의 극도로 낮은 용해성이 해당 생리활성의 결과획득에 장애가 된 것으로 판단되었으며, 이에 난용성 coumarinolignan 화합물 1 및 2의 가용화를 위해 β- cyclodextrin을 이용하여 포접화합물을 제조하고, 이 포접화합물을 세포에 적용하여 암세포 증식 억제 효능을 측정하였다.
- 효율적인 성분분석을 위해 각 화합물의 HPLC profile과 UV spectra가 DAD (diode array detector)를 바탕으로 190-400 nm에서 스캔하여 수집되었다. 화합물 1, 2 및 5의 UV 스펙트럼을 확인한 결과, 이 화합물들은 330nm 근처에서 강한 흡수 피크를 보여주었으며, 이는 해당 화합물들이 coumarin 유도체임을 시사하였다. 특히 화합물 1과2는 동일한 UV 흡수 스펙트럼을 나 타내었으며, 이는 두 화합물이 구조적으로 이성체임을 드러내었다.
- 화합물 1과2는 모두 백색의 파우더 형태로 분리되었다. 화합물 1의 H-NMR 스펙트럼은 δH 6.35 및 7.97(각 1H, d, J=9.5 Hz)과 δH 6.92(1H, s)에서 coumarin 모핵에 해당하는 proton signals과 더불어 δH 6.75(2H, s)에서 두 개의 aromatic protons을, δH 4.96(1H, d, J=8.0 Hz)과 δH 4.37(1H, ddd, J=8.0, 4.3, 2.0 Hz)에서 두 개의 oxymethine 기를 확인하였고, δH 3.66(1H, dd, J=12.5, 2.0 Hz)과 δH 3.39(1H, dd, J=12.5, 4.3 Hz)에서 hydroxymethylene기를, δH 3.79(3H, s) 및 δH 3.77(6H, s)에서 세 개의 methoxyl기13를 보여주었다. 이 화합물의 C-NMR 스펙트럼 또한 coumarin의 구성요소인 α, β-unsaturated lactone을 δC 160.
- 특히 화합물 1과2는 동일한 UV 흡수 스펙트럼을 나 타내었으며, 이는 두 화합물이 구조적으로 이성체임을 드러내었다. 화합물 3, 4 및 6또한 서로 유사한 UV 흡수 형태를 보여주었으며, 307 및 320 nm에서 나타나는 전형적인 흡수 피크는 이 화합물들이 stilbene 유도체임을 시사하였다(Fig. 2).
- 화합물 3, 4와 6은 NMR spectrum에서 모두 (E)-resveratrol aglycone에 해당하는 1, 3, 5-trisubstituted aromatic ring과 1, 4-disubstituted aromatic ring, 그리고 trans-olefinic bond (J=~16Hz)의 signals을 보여주었으며, 동시에 당(糖)에 대응 1 13하는 전형적인 H- 및 C-NMR 피크를 나타내어 3종 모두 배당체 화합물임을 시사해 주었다. 이중 화합물 3과 4는 한 개의 methoxyl기(δH ~3.
후속연구
- 이는 화합물의 수용성 증대를 목표로 β-cyclodextrin을 이용한 cleomiscosin-CD 포 접화합물을 제조한 후 in vitro assay 계에 적용함으로써 성공리에 이루어졌으며, 세포 활성 결과는 cleomiscosin D(2)가 HCT116 암세포에 대한 선택적인 증식억제효능을 나타냄을 증명하였다. 이에 본 연구 결과는 고로쇠나무의 성분 분석 및 생리활성연구의 기초자료로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 천연물 유래 난용성 화합물의 생물 활성평가를 수월하게 진행할 수 있는 방법의 예시 중 하나로 제시될 수 있으리라 사료된다.
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