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문제 정의
- 본 연구에서는 스트립 분석법과 HPLC 분석법을 비교하기 위하여 7가지의 물시료를 가지고 정량분석실험을 진행하였다. 7가지 물시료에는 마이크로시스틴 RR과 마이크로시스틴 LR이 각각 포함되어 있다.
제안 방법
- 적정배율로 희석된 물 시료에 검출용액(마이크로시스틴 항체-형광물질 결합체와 Biotin-BSA-형광물질 결합체가 들어있음)을 가하여 스트립에 적하시키면 물시료는 크로마토그래피 작용으로 시험선과 기준선을 통과하게 되며 물 시료에 포함된 마이크로시스틴의 농도에 따라 시험선에서 얻어지는 형광값이 달라진다. 7가지 물시료에 대해 스트립의 시험선과 기준선에서 얻어지는 형광값 면적을비교함으로서 시료에 포함된 전체 마이크로시스틴을 정량하였다(Fig. 4).
- 마이크로시스틴은 5% 초산 수로 추출할 때 추출효율이 좋으며, 남조류에 존재하는 색소류는 거의 추출되지 않는 장점이 있다. 그 후가능한 한 불순물을 제거하고 목적물을 농축하기 위해 ODS(octadecyl silica) 카트리지를 이용한다. 5% 초산 수로 추출한 용액을 ODS 카트리지에 가한 다음에 불필요한 성분을 제거하기 위해 20% 메탄올수로 세정한다.
- 5-5000 µg/mL이다. 따라서 시료의 농축이나 희석없이 두 가지 방법을 직접 비교하는 것은 불가능하기에 본 논문에서는우선 시료의 농축이나 희석없이 HPLC 분석법을 사용하여 7가지 물 시료들에 포함된 남조류독소를 정량하고 그 뒤 7가지 물시료들을 일정 비율로 희석하여 스트립분석법을 시행하였다.
- 본 연구에서는 7가지의 물시료를 가지고 스트립분석법과 HPLC 분석법을 각각 시행하여 정량분석 실험 결과를 비교하였다. 7가지 물시료에는 마이크로시스틴 RR과 마이크로시스틴 LR이 각각 포함되어 있었다.
- 7가지 물시료에는 마이크로시스틴 RR과 마이크로시스틴 LR이 각각 포함되어 있었다. 스트립 분석법과 HPLC 분석법은 측정가능 농도 범위가 각각 0.2-5.0 ng/mL, 0.5-5000 µg/mL 이어서 시료의 농축이나 희석없이 두 가지 방법을 직접 비교하는 것은 불가능하기에 본 논문에서는먼저 HPLC 분석법을 사용하여 7가지 물시료들에 포함된 남조류독소를 정량하고 그 뒤 7가지 물시료들을 일정 비율로 희석하여 스트립분석법을 시행하였다. 정량분석결과 두 분석법이 매우 잘 일치하는 결과를 보여주었으며 이는 저희 실험실에서 개발된 항원-항체 면역 크로마토그래피 원리를 이용하여 수중 마이크로시스틴을 간편하고 빠르게 미량 측정할 수 있는 스트립분석법이 현재 세계에서 가장 많이 사용되는 HPLC 분석법과 비교했을 때 거의 같은 정량분석결과를 얻는다는 것을 확인 시켜 주었다.
- 스트립 분석법과 HPLC 분석법을 비교하기 위해 7 가지의 서로 다른 물시료를 가지고 정량분석 실험을 진행하였다. HPLC 분석법은 ODS 카트리지를 통과시킨 후 별도의 농축과정 없이 컬럼에 주입하였으며, 스트립 분석법은 측정가능 농도범위가 HPLC에 비해 현저히 낮아 물시료를 희석하여 사용하였다.
- 스트립 분석법을 이용하여 남조류독소를 정량하기 위해서는 남조류독소인 마이크로시스틴의 항체가 필요한데 이러한 항체개발은 마이크로시스틴-BSA 결합체를 실험용 쥐에 주사시켜 생체내에서 항체가 생성되도록 하는 방법을 통하여 이루어졌다. 태어난지 6-8 주 되는 쥐에게 3-4주 간격으로 4-5차례 마이크로시스틴-BSA 결합체를 주입시키 후 쥐의 혈액으로부터 마이크로시스틴 항체를 분리해내었다.
- 위의 HPLC에서 사용한 물시료들을 스트립분석법으로 분석하기 위해서 시료들을 8, 000 배-800, 000 배로 희석시켜 사용하였다. 이 이유는 남조류독소 마이크로시스틴을 정량분석할 때스트립 분석법의 정량측정범위가 0.
- 이러한 배경하에서 최근 저희 실험실에서 마이크로시스틴의 단일클론항체를 사용하여 수중 마이크로시스틴을 간편하고 빠르게 미량 측정할 수 있는 면역학적 분석법의 일종인 스트립분석법26을 개발하였으며, 본 논문에서는 이러한 스트립 분석법과 HPLC 분석법과의 비교를 시도하였다.
- 이렇게 다른 농도의 마이크로시스틴을 함유한 7가지 물시료를 각각 HPLC 분석법과 스트립분석법으로 정량분석을 시행하였다. 그 결과는 Table 1에 나타내었다.
- 하는 방법을 통하여 이루어졌다. 태어난지 6-8 주 되는 쥐에게 3-4주 간격으로 4-5차례 마이크로시스틴-BSA 결합체를 주입시키 후 쥐의 혈액으로부터 마이크로시스틴 항체를 분리해내었다.
대상 데이터
- 진행하였다. 7가지 물시료에는 마이크로시스틴 RR과 마이크로시스틴 LR이 각각 포함되어 있다. 스트립 분석법과 HPLC 분석법은 측정가능 농도 범위가 각각 0.
- 비교하였다. 7가지 물시료에는 마이크로시스틴 RR과 마이크로시스틴 LR이 각각 포함되어 있었다. 스트립 분석법과 HPLC 분석법은 측정가능 농도 범위가 각각 0.
- Streptavidin, biotine Kem-En-Tec(Copenhagen, Denmark) 사로부터 구입하였다. 7가지의 물 시료는 본 실험실의 남조류배양용기에서 얻었으며, 여기에는 마이크로시스틴 RR과 마이크로시스틴 LR이 각각 상당량 포함되어 있다.
- 마이크로시스틴 RR, LR 표준품은 Enzo(Lausen, Switzerland) 사로부터 구입하여 사용하였다. Streptavidin, biotine Kem-En-Tec(Copenhagen, Denmark) 사로부터 구입하였다. 7가지의 물 시료는 본 실험실의 남조류배양용기에서 얻었으며, 여기에는 마이크로시스틴 RR과 마이크로시스틴 LR이 각각 상당량 포함되어 있다.
- 사로부터 구입하였다. 마이크로시스틴 RR, LR 표준품은 Enzo(Lausen, Switzerland) 사로부터 구입하여 사용하였다. Streptavidin, biotine Kem-En-Tec(Copenhagen, Denmark) 사로부터 구입하였다.
- 이렇게 용출된 용액은 역상형태의 HPLC를 사용하여 분석하게 된다. 사용한 HPLC 기기는 Jasco PU-980 이었다. 컬럼은 Waters Spherisorb S5 ODS2 4.
- HPLC 분석법은 ODS 카트리지를 통과시킨 후 별도의 농축과정 없이 컬럼에 주입하였으며, 스트립 분석법은 측정가능 농도범위가 HPLC에 비해 현저히 낮아 물시료를 희석하여 사용하였다. 시료 1은 10, 000 배, 시료 2, 3은 8, 000 배, 시료 4는 55, 000배, 시료 5, 6은 140, 000 배, 시료 7은 800, 000 배로 희석하여 사용하였다. 두 분석법을 이용한 측정결과치들은 3번의 측정실험을 통하여 얻어졌으며 평균값과 표준편차를 Table 1에 나타내었다.
- 실험에 사용한 메탄올, acetonitrile 등의 용매는 HPLC 등급의 용매를 사용하였으며 Aldrich(Milwaukee, WI) 사로부터 구입하였다. 마이크로시스틴 RR, LR 표준품은 Enzo(Lausen, Switzerland) 사로부터 구입하여 사용하였다.
- 사용한 HPLC 기기는 Jasco PU-980 이었다. 컬럼은 Waters Spherisorb S5 ODS2 4.6×150 mm을 사용하였고, 검출기는 Jasco UV-2075, 238 nm를 사용하였다. 이동상은 [methanol+ acetonitrile] : 0.
이론/모형
- HPLC 분석법은 ODS 카트리지를 통과시킨 후 별도의 농축과정 없이 컬럼에 주입하였으며, 스트립 분석법은 측정가능 농도범위가 HPLC에 비해 현저히 낮아 물시료를 희석하여 사용하였다. 시료 1은 10, 000 배, 시료 2, 3은 8, 000 배, 시료 4는 55, 000배, 시료 5, 6은 140, 000 배, 시료 7은 800, 000 배로 희석하여 사용하였다.
- 다수의 논문에서 등용매 용리(isocratic methods)를이용해 마이크로시스틴을 측정하였다. Azevedo16등은 semipreparative HPLC(Bondapack C18, 300mm×19 mm I.
성능/효과
- 그 결과는 Table 1에 나타내었다. Table 1을 보면 시료 1에 대해서 HPLC 분석법으로는 29.29 µg/mL 스트립분석법으로는 29.92 µg/ mL이 얻어졌고, 시료 2에 대해서 HPLC 분석법으로는 32.04 µg/mL 스트립분석법으로는 31.36 µg/mL이 얻어졌고, 시료 3에 대해서 HPLC 분석법으로는 37.69 µg/mL 스트립분석법으로는 38.80 µg/mL이 얻어졌으며, 시료 7에 대해서는 HPLC 분석법으로는 1317 µg/mL 스트립분석법으로는 1296 µg/mL이 얻어졌다. 이러한 두 개의 서로 다른 분석법으로 측정한 측정치들을 상관분석을 통하여 통계분석한 결과 r 값은 0.
- Cremer와 그의 동료들13, 14은 silica로부터 유래한 C2와 C18 (15 µm particle size)를고정상으로 충진한 PepRPC HR 16/10 컬럼을 사용하여 마이크로시스틴-LR 혼합물을 분리, 정제하였다. 기울기 용리(gradients)와 이온쌍 시약 (ion pair reagents) 을 사용하면 분리도를 증진시킬 수 있음을 확인하였다. Craig15 등은 분석용 컬럼 대신 Vydac C18 column을 고정상으로 이용하고 0.
- 5-5000 µg/mL 이어서 시료의 농축이나 희석없이 두 가지 방법을 직접 비교하는 것은 불가능하기에 본 논문에서는먼저 HPLC 분석법을 사용하여 7가지 물시료들에 포함된 남조류독소를 정량하고 그 뒤 7가지 물시료들을 일정 비율로 희석하여 스트립분석법을 시행하였다. 정량분석결과 두 분석법이 매우 잘 일치하는 결과를 보여주었으며 이는 저희 실험실에서 개발된 항원-항체 면역 크로마토그래피 원리를 이용하여 수중 마이크로시스틴을 간편하고 빠르게 미량 측정할 수 있는 스트립분석법이 현재 세계에서 가장 많이 사용되는 HPLC 분석법과 비교했을 때 거의 같은 정량분석결과를 얻는다는 것을 확인 시켜 주었다.
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