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문제 정의
- 본 연구에서는 곽향이 가지고 있는 미온한 성질과 더불어 폐의 입하는 곽향의 귀경이 기존에 보고된 항염증 효과와 연관되므로 천식에서도 효과가 있을 것으로 보여 우리나라 곽향과 유사약재인 광곽향의 물 추출물을 제조하여 비만세포에서의 탈과립(mast cell degranulation)과 histamine 유리 억제 효과 및 난알부민(ovalbumin)에 의해 천식이 유도된 마우스(asthmatic mouse)에서의 개선효능을 확인하였다.
- 본 연구에서는 사람의 비만세포인 HMC-1 세포와 난 알부민(ovalbumin) 유도 기관지 천식 마우스에서 곽향과 광 곽향 추출물의 효과를 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 광곽향은 대한약전, 중화인민공화국약전, 일본 약국방외 생약규격에 수재되어 있고, 본래는 인도원산인 파초리를 광동에서 재배하여 향신료로 사용하였으나 곽향의 대용으로 사용하기 시작하여 지금은 완전히 대체된 상태이고, 현재 중화인민공화국 약전에는 곽향이 수재되어 있지 않다22). 이에 본 연구에서는 국내에서 혼용되어 널리 사용되고 있는 곽향과 광곽향이 비만세포의 탈과립과 히스타민 유리억제에 대하여 각각 어떠한 효능을 나타내는지 평가하였다.
제안 방법
- 이를 H&E 염색하기 위해 hematoxylin으로 5분간 염색한 후 eosin으로 3분간 염색하고 Permount 하였다. H&E 염색된 폐 조직 슬라이드에서의 기관지 상피세포층의 손상정도, 기관지와 폐포 주위 염증세포 침윤 등을 광학현미경(Leica Co.)으로 관찰하였다. 또한 PAS 염색을 위해 폐 조직 슬라이드를 1% periodic acid용액으로 10분간 산화시킨 후 Schiff 용액으로 37℃에서 30분간 염색하였다.
- ① 정상군(생리식염수, Normal):난알부민 용액 대신 생리식염수 0.3 ㎖을 실험시작 0일, 7일, 14일 3회에 걸쳐 생쥐의 복강 내 주사하였으며, 마지막 복강 내 주사 7 일 후 생쥐를 50×15×50 ㎝ 크기의 상자 안에 넣고 생리식염수를 분사하였다.
- ② 대조군(천식 유발군, OVA-Control):난알부민 용액 0.3 ㎖을 실험시작 0일, 7일, 14일 3회에 걸쳐 생쥐의 복강 내 주사하였으며, 마지막 복강주사 7일 후 천식 증상을 유발하기 위하여 생쥐를 상자 안에 넣고 0.2% 난 알부민 용액을 격일간격으로 5회 분사하여 감작하였다.
- 실험군(곽향 물 추출물 투여군, AH W Ex.):대조군과 동일한 방법으로 생쥐에게 복강 내 감작을 마친 후 아크릴 상자 내에서 감작하는 동안 매일 1회 곽향 물 추출물(100, 300 ㎎/㎏ body weight, bw)을 경구 투여하였다.
- ④ 약물대조군(대조약물 투여군, Ketotifen):대조군과 동일한 방법으로 생쥐에게 복강 내 감작을 마친 후 아크릴 상자 내에서 감작하는 동안 매일 1회 항 히스타민제인 Ketotifen(10 ㎎/㎏ bw)을 경구 투여하였다.
- 각 군으로부터 폐 조직을 수집하여 4% formaldehyde 용액에서 24시간 고정시킨 후 파라핀으로 포매함으로써 블록을 제작하고 조직절편기(microtome)을 이용하여 3 ㎛ 두께의 연속절편을 제작하였다.
- 추출방법은 다음과 같다. 각 한약재 200 g에 각각 정제수 2 L를 가하여 열탕추출기에서 3시간동안 가열한 후 추출물을 3겹 거즈 및 와트만(Wh atman No.1) 여과지로 여과하고, 남은 약재에 다시 정제수 2 L를 가하여 동일한 조건에서 재 가열한 후 여과하였다. 이를 회전식 감압농축기를 이용하여 감압농축한 후 동결 건조함으로써 최종 추출물을 획득하였다.
- 곽향 및 광곽향의 물 추출물(AH-W, PH-W)의 HMC-1 세포에 대한 독성정도(cytotoxicity)를 평가하기 위해서 다양한 농도(0.1~1 ㎎/㎖)의 각 추출물을 HMC-1 세포에 24시간 처리한 후 MTT assay를 수행하였다.
- 난알부민 최종 감작(OVA challenge) 후 모든 동물을 희생시키고 심장을 통해 생리식염수로 관류함으로써 혈액을 제거하였다. 각 군으로부터 폐 조직을 수집하여 4% formaldehyde 용액에서 24시간 고정시킨 후 파라핀으로 포매함으로써 블록을 제작하고 조직절편기(microtome)을 이용하여 3 ㎛ 두께의 연속절편을 제작하였다.
- 난알부민 최종 감작(OVA challenge) 후 모든 동물을 희생하고 심장으로부터 혈액을 수집하여 혈청을 분리하였으며, 혈청으로부터 난알부민-특이 IgE 항체의 농도를 측정하기 위해 ELISA 방법을 수행하였다. 먼저 96-well flat-bottom ELISA plate에 0.
- 난알부민(ovalbumin, OVA) 감작(sensitization/challenge) 으로 알레르기성 천식이 유도된 마우스에 곽향의 물 추출물을 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏ 용량으로 경구 투여한 후 폐 조직에서의 염증반응과 구조적 손상을 H&E 염색으로 확인하였다. 그 결과, 정상군은 세기관지 주변으로 염증세포의 침윤이나 수적 증가가 관찰되지 않았으며, 세기관지 내부 상피 세포층 손상과 비후로 인한 기도 면적이 좁아지는 병리 구조적 변화가 나타나지 않았다.
- 난알부민(ovalbumin, OVA) 감작(sensitization/challenge) 으로 알레르기성 천식이 유도된 마우스에 곽향의 물 추출물을 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏ 용량으로 경구 투여한 후 폐 조직에서의 점액(mucin) 분비 억제효과를 PAS 염색으로 확인하였다.
- 난알부민(ovalbumin, OVA) 감작(sensitization/challenge) 으로 알레르기성 천식이 유도된 마우스에 곽향의 물 추출물을 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏ 용량으로 경구 투여한 후 혈청 내 난알부민-특이 IgE(OVA-specific IgE) 생성에 대한 억제 효과를 효소면역반응법(ELISA)으로 확인하였다.
- 난알부민(ovalbumin, OVA) 감작(sensitization/challenge) 으로 알레르기성 천식이 유도된 마우스에 곽향의 물추출물을 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏ 용량으로 경구 투여한 후 혈청 내 알레르기성 면역반응 유도 핵심 사이토카인인 Th2 사이토카인인 IFN-γ 분비에 대한 억제 효과를 효소 면역반응법(ELISA)으로 확인하였다.
- 난알부민(ovalbumin, OVA) 감작(sensitization/challenge) 으로 알레르기성 천식이 유도된 마우스에 곽향의 물추출물을 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏ 용량으로 경구 투여한 후 혈청 내 알레르기성 면역반응 유도 핵심 사이토카인인 Th2 사이토카인인 IL-4 분비에 대한 억제 효과를 효소면역반응법(ELISA) 으로 확인하였다.
- 이러한 효과는 유사 약재인 광곽향 추출물에서도 관찰되었으나, 동일 처리 농도에서 비교하였을 때 곽향이 광곽향 보다 효과적인 것으로 나타났으며 이는 국산에서 재배되는 곽향의 항알레르기 활성이 광곽향보다 더 우수함을 의미한다. 따라서 난알부민 감작으로 유도된 천식 마우스에서의 효능평가는 효과가 더 우수한 곽향만을 선정하여 실험을 진행하였다.
- 3 ㎖씩 실험 시작일로부터 7일 간격으로 하루에 1번 0일, 7일, 14일에 마우스에게 복강으로 주사하였다. 또한 마지막 복강 주사 7일 후인 21일부터 마우스를 50×15×50 ㎝ 크기의 아크릴상자 안에 넣고 2㎎/㎖ OVA용액을 뉴블라이저(nebulizer)기기를 이용하여 격일 간격으로 1일 3회(각 15분씩 3회) 21, 23, 25, 27, 29일에 분사함으로써 호흡을 통한 천식을 유발하였다(Fig. 1).
- Schiff(PAS) 염색을 실시하였다. 먼저 조직염색을 위해 폐 조직 슬라이드를 60℃에서 30분 동안 조직을 말린 다음 xylene으로 15~20분 간 탈파라핀(deparaffinazation) 시키고 100%, 95%, 80%, 75% 알코올 순서대로 함수시켰다. 이를 H&E 염색하기 위해 hematoxylin으로 5분간 염색한 후 eosin으로 3분간 염색하고 Permount 하였다.
- 다시 plate를 5회 세척한 다음 각 well에 기질용액인 TMB를 넣어 10분 동안 암실상태에서 반응시킴으로써 발색을 유도하였다. 반응이 끝난 후 각 well에 정지액을 50 ㎕씩 넣어 효소반응을 정지시킨 후 microplate reader의 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 혈청 내 IgE 의 농도는 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
- 각 well에 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 50 ㎕ 씩 넣어 4시간 동안 배양하면서 환원 반응을 유도한 후 반응액을 제거하고 100 ㎕의 DMSO 용액 첨가하여 보라색의 formazan 결정을 완전히 용해하였다. 발색 정도를 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성정도는 세포만 배양한 대조군의 100% 생존도를 기준으로 상대적인 세포생존도(cell viability; %)를계산하였다.
- 비만세포 탈과립에 따른 히스타민 유리에 대한 곽향과 광곽향 물 추출물의 억제효과를 비교하기 위해 각 추출물을 처리한 후 compound 48/80로 탈과립을 유도하고 세포배양액으로부터 histamine의 농도를 효소면역반응법(EIA)으로 측정하였다.
- 비만세포 활성화에 따른 탈과립 유도에 대한 곽향과 광 곽향 물 추출물의 억제효과를 비교하기 위해 각 추출물을 처리한 후 히스타민 유리야기 물질인 compound 48/80로 탈과립을 유도한 후 현미경으로 비만세포의 탈과립 형태를 관찰하였다.
- 비만세포로부터 분비되는 히스타민의 양을 측정하기 위해 HMC-1 세포(1×105 cells/㎖)를 24-well plate에 하룻밤 배양한 후 여러 농도의 약물을 1시간 처리하였다. 여기에 compound 48/80(10 ㎍/㎖)을 처리하여 30분 동안 배양한 다음 세포배양액을 수거하였다.
- 비만세포의 탈과립(degranulation) 현상을 관찰하기 위하여 HMC-1 세포(2×105 cells/㎖)를 6-well culture plate에 하룻밤 배양한 다음 여러 농도의 곽향 및 광곽향 물 추출물을 처리하고 60분간 배양하였다. 여기에 compound 48/80(10 ㎍/㎖)을 처리하여 30분 동안 배양한 다음 탈과립 현상을 광학현미경으로 관찰하였다.
- 사람의 비만세포주인 human mast cell-1(HMC-1) 세포는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 넣은 Iscove's Modified Dulbecco's Media(IMDM) 세포 배양액으로 5% CO2가 공급되는 배양기에서 37℃ 조건으로 배양하였다.
- 알레르기성 천식 동물모델을 제작하기 위해 먼저, 난알부민(ovalbumin, chicken egg albumin; OVA) 1 ㎎을 PBS와 수산화알루미늄 겔[Al(OH)3 gel]을 1:1 비율로 혼합한 용액을 0.3 ㎖씩 실험 시작일로부터 7일 간격으로 하루에 1번 0일, 7일, 14일에 마우스에게 복강으로 주사하였다. 또한 마지막 복강 주사 7일 후인 21일부터 마우스를 50×15×50 ㎝ 크기의 아크릴상자 안에 넣고 2㎎/㎖ OVA용액을 뉴블라이저(nebulizer)기기를 이용하여 격일 간격으로 1일 3회(각 15분씩 3회) 21, 23, 25, 27, 29일에 분사함으로써 호흡을 통한 천식을 유발하였다(Fig.
- 60분간 배양하였다. 여기에 compound 48/80(10 ㎍/㎖)을 처리하여 30분 동안 배양한 다음 탈과립 현상을 광학현미경으로 관찰하였다.
- 또한 PAS 염색을 위해 폐 조직 슬라이드를 1% periodic acid용액으로 10분간 산화시킨 후 Schiff 용액으로 37℃에서 30분간 염색하였다. 염색된 조직 슬라이드에서의 점액분비를 광학현미경으로 관찰하였다.
- 1) 여과지로 여과하고, 남은 약재에 다시 정제수 2 L를 가하여 동일한 조건에서 재 가열한 후 여과하였다. 이를 회전식 감압농축기를 이용하여 감압농축한 후 동결 건조함으로써 최종 추출물을 획득하였다. 이때 곽향의 수율은 11.
- 즉, HMC-1 세포(5×104 cells/well)를 96-well culture plate 에 100 ㎕ IMDM 배지와 함께 하룻밤 37℃, 5% CO2 조건으로 배양한 다음, 여러 농도의 곽향 및 광곽향 물 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 각 well에 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 50 ㎕ 씩 넣어 4시간 동안 배양하면서 환원 반응을 유도한 후 반응액을 제거하고 100 ㎕의 DMSO 용액 첨가하여 보라색의 formazan 결정을 완전히 용해하였다.
- 즉, 현미경의 40배 배율에서 세포 형태가 원형 또는 난원형이거나 세포 윤곽이 뚜렷하고 세포질 내에 과립들로 채워진 상태를 정상세포로 보았으며, 세포질 한쪽 극이 볼록해지는 수 포상 비만세포, 세포질 중간이 잘록한 표주박형 비만세포 및 세포 형태는 구형 또는 난형이지만 핵의 위치가 한쪽으로 치우쳐 있는 비만세포를 모두 변형된 비만세포로 관찰하였으며, 핵의 이동 없이 세포 윤곽이 불분명하고 세포질 내 과립이 세포표면으로 표출되거나 주위에 흩어져 있는 경우를 탈 과립형 비만세포로 간주하였다.
- 폐 조직의 구조적 변화와 기관지에서의 점액(mucin) 분비 정도를 관찰하기 위해 Hematoxylin & Eosin(H&E)와 Periodic Acid Schiff(PAS) 염색을 실시하였다. 먼저 조직염색을 위해 폐 조직 슬라이드를 60℃에서 30분 동안 조직을 말린 다음 xylene으로 15~20분 간 탈파라핀(deparaffinazation) 시키고 100%, 95%, 80%, 75% 알코올 순서대로 함수시켰다.
대상 데이터
- 곽향과 광곽향의 물 추출물은 식품의약품안전처 한약재 품질 표준화연구 사업단으로부터 제공받았다. 추출방법은 다음과 같다.
- USA)을 사용하였다. 또한 효능 평가를 위해서 OVA-specific IgE Kit(BD Biosciences, San Diego, CA, USA), murine IL-4, IFN-γ ELISA Kits(Peprotech, , Rocky Hill, NJ, USA), H&E 염색 시약(Seoulin Biosciences Co., Seoul, Korea), PAS 염색 시약(Muto, Kyoto, Japan) 등을 사용하였고, 실험기기로는 Nebulizer(Devilbiss, PA, USA), microplate reader(Asys, Eugendorf, Austria), microscope(LEICA, Wetzlar, Germany) 등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 곽향(Agastachis Herba; AH)은 배초향 (Agastache rugosa)의 지상부로써 경주(한국)에서 재배한 것이며, 광곽향(Pogostemon cablin)은 파당(인도네시아)에서 재배한 것으로써 식품의약품안전처 한약재 품질 표준화연구 사업단으로부터 제공받아 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 시약 중 세포 배양용 시약으로는 Iscove's Modified Dulbecco's Media(IMDM), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin(P/S)은 GenDEPOT (USA)사에서 구입하였으며, 비만세포 탈과립 평가를 위해 Compound 48/80, 3-4, 5-dimethylthazol- 2-yl-2, 5-tetera zolium bromide(MTT) (Amresco, USA), Histamine release assay kit(Cayman Chemical, MG, USA)를 사용하였고, 동물모델 제작을 위해 ovalbumin(OVA)(Sigma-Aldrich, St Louice, CA, , USA), Al(OH)3 gel(Invivogen, San Diego, USA)을 사용하였다. 또한 효능 평가를 위해서 OVA-specific IgE Kit(BD Biosciences, San Diego, CA, USA), murine IL-4, IFN-γ ELISA Kits(Peprotech, , Rocky Hill, NJ, USA), H&E 염색 시약(Seoulin Biosciences Co.
- 본 실험에 사용된 실험동물은 6주령 BALB/c계 수컷 마우스(20±2 g)로 (주)샘타코(경기도, 한국)로부터 구입하였으며, 고형사료와 물을 제한 없이 공급하면서 온도(23±2℃)와 습도(55±5%)를 일정하게 유지하면서 12시간 낮, 12시간 밤의 생활리듬으로 1주일 동안 순화시킨 후 모델제작에 사용하였다. 모든 실험동물은 동물보호법 13조 및 동국대학교 동물실험 윤리위원회 규정에 따라 관리하였다.
- 실험군은 설정은 다음과 같으며, 각 군당 10마리의 마우스를 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 GraphPadprism 5.0 통계 프로그램 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 이용하여 각 실험군의 평균과 표준편차(mean±SD)를 이용하여 계산하였으며, 각 그룹 간 비교를 위해 t-test와 one-way ANOVA를 실시하고, p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- HMC-1 세포에 대한 곽향 및 광곽향 물 추출물의 독성 정도를 평가하기 위해서 MTT assay를 수행하였다. 즉, HMC-1 세포(5×104 cells/well)를 96-well culture plate 에 100 ㎕ IMDM 배지와 함께 하룻밤 37℃, 5% CO2 조건으로 배양한 다음, 여러 농도의 곽향 및 광곽향 물 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다.
- 여기에 compound 48/80(10 ㎍/㎖)을 처리하여 30분 동안 배양한 다음 세포배양액을 수거하였다. 세포배양액 내 히스타민의 양을 효소면역반응법(enzyme-immuno assay; EIA)으로 측정하였으며, 표준용액의 정량곡선을 기준으로 히스타민의 양을 계산하였다.
- 혈청으로부터 Th2 사이토카인인 IL-4와 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 농도를 측정하기 위해 ELISA 방법을 수행하였다. 즉, 96-well flat-bottom ELISA plate에 혈청을 100 ㎕씩 넣고 plate sealer를 덮고 빛을 차단한 상태로 실온에서 2시간 반응시킨 후 washing buffer로 3회 세척한 다음 detection antibody(IL-4 or IFN-γ) 100 ㎕를 각 well에 넣고 plate sealer를 덮고 빛을 차단한 상태로 실온에서 2시간 반응시킨다.
성능/효과
- 1. 곽향과 광곽향 추출물은 HMC-1 세포에서 compound 48/80에 의한 탈과립 현상을 억제함으로써 히스타민 분비를 유의적으로 감소시켰다.
- 2. 곽향추출물은 난알부민-유도 천식 마우스의 혈청 내 난 알부민-특이 IgE의 생성을 유의적으로 억제시켰다.
- 3. 곽향추출물은 난알부민-유도 천식 마우스의 혈청 내 Th2 사이토카인인 IL-4와 Th1 사이토카인인 IFN-γ 분비 조절에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
- 4. 곽향추출물은 난알부민-유도 천식 마우스의 폐 조직에서의 염증세포 침윤과 수적 증가 및 세기관지 점막의 상피세포층 손상과 술잔세포 증가에 따른 점액 분비 증가를 효과적으로 감소시켰다.
- 결론적으로 곽향의 추출물은 compound 48/80에 의해 유도된 비만세포 탈과립을 억제함으로써 세포막 안정화를 통해 히스타민 분비를 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 곽향 추출물은 난알부민 감작과 유발로 천식이 유도된 마우스에서 혈청 내 난알부민 특이-IgE의 생성을 감소시키고, 폐 조직에서의 염증과 세기관지 손상, 비후 및 점액분비 증가를 억제시킴으로써 폐를 보호하는 것으로 나타났다.
- 또한 곽향 추출물은 난알부민 감작과 유발로 천식이 유도된 마우스에서 혈청 내 난알부민 특이-IgE의 생성을 감소시키고, 폐 조직에서의 염증과 세기관지 손상, 비후 및 점액분비 증가를 억제시킴으로써 폐를 보호하는 것으로 나타났다. 곽향과 유사 약재인 광곽향 역시 동물모델에서 천식 개선의 효능을 확인하지는 못하였지만 비만세포 탈과립 억제를 통한 세포막 안정화와 히스타민 분비를 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 이는 과거 곽향과 광곽향이 혼용되어 사용하였듯이 두 약재 간의 효능이 상이하지 않고 유사하다고 할 수 있으며, 다만 약성의 강(强), 약(弱) 차이라고 할 수 있다.
- 그 결과 Compound 48/80를 30분간 처리한 비만세포에서는 Compound 48/80에 의해 탈과립이 유도됨으로써 세포의 형태적 파괴와 세포 주위로 과립구들이 흩어져 있는 형태를 관찰 할 수 있었다. 반면에 곽향(AH-W)과 광곽향(PH-W) 추출물을 처리한 세포에서는 탈과립 현상이 억제됨으로써 세포의 형태가 정상 세포와 유사하게 보존되는 것을 확인하였다.
- 그 결과 세포만 배양한 무처리군의 세포 생존율은 103.53± 4.99%였으며, 곽향 추출물은 0.1 ㎎/㎖, 0.2 ㎎/㎖, 0.5 ㎎/ ㎖, 1 ㎎/㎖ 농도에서 각각 93.53±0.75%, 97.12±1.58%, 105.14±1.82%, 101.12±0.45%로 측정되어 1 ㎎/㎖ 농도까지 독성이 없는 것으로 나타났다(Fig. 2A). 또한 광 곽향 추출물은 0.
- 그 결과, compound 48/80(10 ㎍/㎖)을 처리한 비만세포에서는 히스타민의 농도가 370.88±27.18 nM/㎖로 정상 세포에 비해 유의적으로 증가되었다. 또한 곽향 추출물(AH W)을 0.
- 그 결과, 정상군(11.43±1.62 ng/㎖)에 비하여 천식 유발 군의 혈청에서 난알부민 특이-IgE의 농도가 유의적으로 증가하였다(108.11±13.55 ng/㎖). 또한 천식 유발군에 곽향 추출물을 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏ 용량으로 투여하였을 때 혈청 내 난알부민 특이-IgE의 농도는 각각 74.
- 그 결과, 정상군(125.28±26.69 pg/㎖)에 비하여 천식 유발 군의 혈청에서 IFN-γ의 농도가 유의적으로 증가하였다 (198.09±18.63 pg/㎖), . 또한 천식 유발군에 곽향 추출물을 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏ 용량으로 투여하였을 때 혈청 내 IFN-γ의 농도는 각각 199.
- 그 결과, 정상군(90.52±10.72 pg/㎖)에 비하여 천식 유발 군의 혈청에서 IL-4의 농도가 유의적으로 증가하였다 (626.62±20.66 pg/㎖). 또한 천식 유발군에 곽향추출물을 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏ 용량으로 투여하였을 때 혈청 내 IL-4의 농도는 각각 570.
- 확인하였다. 그 결과, 정상군은 세기관지 주변으로 염증세포의 침윤이나 수적 증가가 관찰되지 않았으며, 세기관지 내부 상피 세포층 손상과 비후로 인한 기도 면적이 좁아지는 병리 구조적 변화가 나타나지 않았다. 반면, 천식 유발군에서는 세기관지 주변으로 염증세포 침윤과 수적 증가를 관찰할 수 있었고 세기관지 내부 상피세포층 손상과 세기관지 비후에 의한 기도 면적 좁힘현상이 관찰되었다(Fig.
- 그 결과, 정상군의 폐 조직에서는 세기관지 내부 상피 세포층 손상과 더불어 술잔세포 증식에 의한 점액 분비가 관찰되지 않는 반면, 천식 유발군에서는 세기관지 내부 상피 세포층 손상과 함께 술잔세포(goblet cell) 증식에 따른 점액분비 증가로 PAS에 의해 붉게 염색되는 부분이 관찰되었으며, 세기관지 좁힘 현상도 관찰되었다(Fig. 9).
- 62 pg/㎖로 측정됨으로써 천식 유발 군에 비해 유의적인 감소를 나타내지 않았다. 따라서 곽향 추출물은 천식 유발에 따른 IFN-γ의 증가를 감소시키지 못하는 것으로 나타났다.
- 33 pg/㎖로 측정됨으로써 천식 유발군에 비해 유의적인 감소를 나타내었다. 따라서 곽향 추출물은 천식 유발에 따른 IL-4의 증가는 감소시키지 못하는 것으로 나타났다.
- 따라서 곽향 추출물은 천식 유발에 따른 폐 조직 내 세기관지 상피세포층 손상과 이에 따른 점액증가를 억제함으로써기도 확장을 통해 천식 개선 효능이 있는 것으로 나타났다.
- 따라서 곽향추출물은 비만세포에서의 탈과립과 히스타민 분비 억제 및 폐 조직에서의 염증 손상을 억제함으로써 천식을 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다.
- 한편, 대조약물인 Ketotifen (10 ㎎/㎏) 투여군에서도 곽향추출물과 유사하게 폐 조직 손상이 개선되는 것을 확인하였다. 따라서 곽향추출물은 천식 유발에 따른 폐 조직의 염증과 기관지 손상을 막아 줌으로써 천식 개선 효능이 있는 것으로 나타났다.
- 27 ng/ ㎖로 측정되어 천식 유발군에 비해 유의적인 감소를 나타내었다. 따라서 곽향추출물은 투여 용량에 의존적으로 천식 유발 군에 비해 난알부민 특이-IgE의 생성을 억제함으로써 알레르기 면역반응을 조절할 수 있는 것으로 나타났다.
- 18 nM/㎖로 정상 세포에 비해 유의적으로 증가되었다. 또한 곽향 추출물(AH W)을 0.2 ㎎/㎖와 0.5 ㎎/㎖ 농도로 처리하였을 때 각각 427.70±11.31 nM/㎖, 121.50±7.80 nM/㎖로 측정되었고, 광곽향 추출물(PH W)을 0.2 ㎎/㎖와 0.5 ㎎/㎖ 농도로 처리하였을 때 각각 279.82±9.93 nM/㎖, 214.17±1.34 nM/㎖로 측정되어 곽향과 광곽향 추출물 0.5 ㎎/㎖ 농도에서 유의적으로 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 또한 곽향 추출물은 난알부민 감작과 유발로 천식이 유도된 마우스에서 혈청 내 난알부민 특이-IgE의 생성을 감소시키고, 폐 조직에서의 염증과 세기관지 손상, 비후 및 점액분비 증가를 억제시킴으로써 폐를 보호하는 것으로 나타났다. 곽향과 유사 약재인 광곽향 역시 동물모델에서 천식 개선의 효능을 확인하지는 못하였지만 비만세포 탈과립 억제를 통한 세포막 안정화와 히스타민 분비를 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 곽향추출물을 투여한 군에서는 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏ 용량 모두 천식 유발군에 비해 세기관지 주변의 염증세포 감소 및 침윤 억제, 상피세포층 손상 억제 및 세기관지 내부의 비 후가 감소되는 것을 확인하였다. 한편, 대조약물인 Ketotifen (10 ㎎/㎏) 투여군에서도 곽향추출물과 유사하게 폐 조직 손상이 개선되는 것을 확인하였다.
- 63 pg/㎖), . 또한 천식 유발군에 곽향 추출물을 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏ 용량으로 투여하였을 때 혈청 내 IFN-γ의 농도는 각각 199.59±27.15 pg/㎖, 197.28± 34.08 pg/㎖로 천식 유발군에 비해 유의적 감소를 나타내지 않았다(Fig. 7). 또한 대조약물인 Ketotifen(10 ㎎/㎏)을 투여한 군에서는 215.
- 55 ng/㎖). 또한 천식 유발군에 곽향 추출물을 100 ㎎/㎏와 300 ㎎/㎏ 용량으로 투여하였을 때 혈청 내 난알부민 특이-IgE의 농도는 각각 74.05±22.08 ng/㎖, 58.34±21.00 ng/㎖로 측정되어 천식 유발군에 비해 유의적으로 감소하였다(Fig. 5). 또한 대조약물로써 항히스타민제인 Ketotifen (10 ㎎/㎏)을 투여한 군에서도 76.
- 할 수 있었다. 반면에 곽향(AH-W)과 광곽향(PH-W) 추출물을 처리한 세포에서는 탈과립 현상이 억제됨으로써 세포의 형태가 정상 세포와 유사하게 보존되는 것을 확인하였다. 특히 곽향 추출물을 0.
- . 본 실험에서 곽향 추출물은 난 알부민 감작과 유발로 천식이 유도한 마우스의 폐 조직에서 천식 발생에 따른 세기관지 주변으로의 염증세포 침윤과 수적증가를 감소시키고, 세기관지 점막의 상피세포층 손상에 따른 비 후와 기도면적의 좁아짐 등을 개선시키는 것으로 나타났다. 한편, 1992년 Huber와 Koessler에 의해 처음 보고된 기도개형(airway remodeling)은 천식으로 사망한 환자의 기도 벽과 기관지 평활근이 심하게 두꺼워져있음을 확인44)함으로써 증명되었으며 특히 기도 점막 상피세포에서의 염증물질이나 TGF-β 등의 성장인자 분비로 인한 상피세포 탈락, 술잔 세포증가, 점액선 증가, 점막 섬유화, 평활근 비후, 신생혈관 증가, myofibroblast 증식, 기저막 콜라겐 침착 등 다양한 병리적 증상이 나타날 수 있고 이로 인해 비가역적 기도폐쇄 및 심각한 폐 기능 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다13).
- 비만세포 내 커다란 과립형태로 저장되어있는 화학매개물질들 중 하나인 히스타민은 아직 생리학적 중요성이 완전히 밝혀지지 않았으나 주로 모세혈관의 이완과 투과성 증가, 내장에 분포하는 근육의 수축, 위산 분비 촉진, 심장 박동 수의 증가, 이물질에 의한 상처나 외부 감염에 대한 신체의 방어반응인 염증, 알레르기, 아낙필락시스 등 알레르기 면역반응에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다27). 본 실험에서 곽향 추출물은 사람의 비만세포에서의 compound 48/80에 의한 탈과립을 효과적으로 억제함으로써 세포막 안정화를 통해 히스타민 분비를 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 유사 약재인 광곽향 추출물에서도 관찰되었으나, 동일 처리 농도에서 비교하였을 때 곽향이 광곽향 보다 효과적인 것으로 나타났으며 이는 국산에서 재배되는 곽향의 항알레르기 활성이 광곽향보다 더 우수함을 의미한다.
- 즉 천식 뿐 아니라 만성 기관지염, 폐기종, 기관지 확장증, 낭포성 섬유증 등 기도 질환에서 관찰되는 점액(객담) 의 과다 분비는 이러한 질환의 예후를 악화시키는 주요 요인으로 알려져 있다. 본 실험에서 곽향추출물은 난알부민 감작과 유발에 의한 기도 내 염증반응(염증세포 수)과 기도 재형성의 대표적 지표인 기도상피 술잔세포의 과다형성 및 기저막하 부의 섬유화 정도를 현저히 억제시킴을 확인할 수 있었다. 이는 곽향이 기관지 천식에 의한 기도의 생리적 이상(염증)을 개선시킴으로써 폐 기능 장애로부터 기관지를 보호할 수 있음을 의미한다.
- 알레르기 질환 진단을 위해 우선적으로 측정하는 것이 혈청 내 총 IgE의 농도이며, 직접적 원인을 확인하는 방법으로 혈청 알레르겐 특이 IgE를 측정하는 것이다. 본 실험에서도 곽향의 알레르기 면역반응 조절 효능을 평가하기 위해 혈청 내 난알부민(알레르겐)-특이 IgE의 농도를 측정하였으며, 곽향 추출물이 난알부민 감작과 유발로 증가된 난 알부민-특이 IgE의 생성을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이는 곽향이 기관지 천식에서 알레르기 면역반응 유발 핵심 인자인 알레르겐-특이 IgE의 합성과 분비를 막아줌으로써 체내 항상성 조절 회복을 통해 천식을 근본적으로 치료할 수 있음을 의미한다.
- 본 실험에서 곽향 추출물은 사람의 비만세포에서의 compound 48/80에 의한 탈과립을 효과적으로 억제함으로써 세포막 안정화를 통해 히스타민 분비를 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 유사 약재인 광곽향 추출물에서도 관찰되었으나, 동일 처리 농도에서 비교하였을 때 곽향이 광곽향 보다 효과적인 것으로 나타났으며 이는 국산에서 재배되는 곽향의 항알레르기 활성이 광곽향보다 더 우수함을 의미한다. 따라서 난알부민 감작으로 유도된 천식 마우스에서의 효능평가는 효과가 더 우수한 곽향만을 선정하여 실험을 진행하였다.
- 반면에 곽향(AH-W)과 광곽향(PH-W) 추출물을 처리한 세포에서는 탈과립 현상이 억제됨으로써 세포의 형태가 정상 세포와 유사하게 보존되는 것을 확인하였다. 특히 곽향 추출물을 0.5 ㎎/㎖ 농도 처리하였을 때 광곽향 추출물 보다 효과적으로 비만세포의 안정화가 관찰되었다 (Fig. 3).
- 감소되는 것을 확인하였다. 한편, 대조약물인 Ketotifen (10 ㎎/㎏) 투여군에서도 곽향추출물과 유사하게 폐 조직 손상이 개선되는 것을 확인하였다. 따라서 곽향추출물은 천식 유발에 따른 폐 조직의 염증과 기관지 손상을 막아 줌으로써 천식 개선 효능이 있는 것으로 나타났다.
후속연구
- 이는 과거 곽향과 광곽향이 혼용되어 사용하였듯이 두 약재 간의 효능이 상이하지 않고 유사하다고 할 수 있으며, 다만 약성의 강(强), 약(弱) 차이라고 할 수 있다. 본 논문에서는 곽향과 광곽향의 항알레르기 효능을 비교평가 하였으며 두 약재가 널리 이용되는 처방에 따른 효능에 대한 연구가 추가적으로 필요할 것으로 사료되며, 이러한 근거를 바탕으로 각 처방에 보다 더 약성이 우수한 약재를 사용한다면 치료 효율성을 높일 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 기도에 영향을 미쳐 천식 발생에 관여하는 것으로 생각되기도 한다42). 본 실험에서 곽향 추출물은 혈청 내 IL-4와 IFN-γ의 분비에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났으며 이는 향후 기관지폐포세척액(bronchoal.,eolar lavage; BAL fluid)에서의 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13 및 Th1 사이토카인인 IFN-γ 분비에 대한 효능평가가 필요할 것으로 보인다. 그 이유는 난알부민 감작을 진행할 때 마우스의 호흡과정에서 알레르겐이 호흡기를 통하여 기관지 혹은 폐에 흡입되었기 때문이며, 혈청 내의 사이토카인 보다 기관지폐포세척액에서의 염증세포 및 사이토카인들이 천식에 더 직접적인 악영향을 미치기 때문에 천식 개선 효능을 평가하는 데에 있어서 혈청보다는 기관지폐포세척액이 더 중요하다고 할 수 있기 때문이다.
- 이에 기존 천식 치료제의 단점을 극복하고 근본적인 치료를 위한 대안으로 다양한 성분과 기전을 보유하고 있는 천연물에 대한 관심이 증가하고 있으며, 국내 제약회사들을 중심으로 국산 한약재를 이용한 새로운 치료제 개발 연구가 이루어지고 있다. 특히 한방임상에서 오랜 사용 경험이 있는 한약재들의 천연복합성분에 의한 다면적 약리작용으로 천식의 다양한 발생기전을 차단함으로써 천식의 효과적 제어 뿐 아니라 장기 복용에도 안전하여 천식 환자들에게 많은 도움이 될 것으로 기대하고 있다.
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