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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 선행 연구들에서 면역증강제로서 효능이 입증된 프로바이오틱스, 레반을 혼합하여 신바이오틱스성 면역증강제를 제작하고, 양식어가에서 일반적으로 사용되고 있는 일반 해삼사료, 해삼용 영양제 배합사료 및 면역증강제 배합사료를 급여 하였을 경우 홍해삼 치삼의 성장율, 생존율 및 생리활성을 각각 비교분석 하고자 하였다.
제안 방법
- 홍해삼 치삼 성장도 분석은 사육수조로부터 개체를 전량 회수한 후 계측하였으며, 실험 시작일로부터 4주 마다 반복 측정되었다. 12주의 실험 종료 후 증체율 일간 성장률 및 생존율을 계산하였다. 일간 성장률은 Specific growth rate (%)=(loge final wt-loge initial wt)/days와 같이 계산되었으며, 증체율은 Weight gain (%)=(final weight-initial weight)×100 /initial weight으로 계산되었다.
- 96 well plate에 체강액 15 μL와 phospate buffer (pH 6.0) 150 μL를 넣고, 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (LDOPA, sigma, USA)를 150 μL 넣어준 후 25℃ 에서 25분 동안 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하고 5분 후에 동일한 파장에서 재 측정한 후 전후 값을 비교하여 사용하였다.
- Lysozyme 활성은 체강액을 15 μL씩 96 well plate에 분주한 후, 150 μL Micrococcus lysodeikticus solution (0.2 mg/mL, 0.1M PBS, pH=6.8)를 넣고 25℃ 에서 5 분간 반응 후 540 nm에서 흡광도를 측정 하고, 다시 5분 간 반응 시킨 뒤 동일한 파장에서 흡광도를 측정하여 lysis 전 후의 흡광도 차를 비교하여 측정하였다.
- 8)를 넣고 25℃ 에서 5 분간 반응 후 540 nm에서 흡광도를 측정 하고, 다시 5분 간 반응 시킨 뒤 동일한 파장에서 흡광도를 측정하여 lysis 전 후의 흡광도 차를 비교하여 측정하였다. Penoloxydase (PO) 활성은 Ashida and Dohke (1980)의 방법을 응용하여 측정하였다. 96 well plate에 체강액 15 μL와 phospate buffer (pH 6.
- 3 m3 크기로, 조도는 100 lux 이하였다. 각 실험수조에는 동일한 개수의 은신처를 설치 하였으며, 실험환경 변화를 측정하기 위하여 실험이 진행되는 동안 4주에 한 번씩 수질측정기(YSI, YSI Incorporated, Ohio, USA)를 이용하여 수온, 염분, 용존산소(Dissolved oxygen, D.O) 및 pH 변화를 측정하였다(Table 1).
- CD사료 성분은 사료표준분석방법에 의하여 분석되었으며 그 결과는 Table 2와 같다. 각각의 실험 사료는 12주간 하루 1회 30 g씩 오전에 급이 하였다.
- 다당성 물질인 레반 섭이 후 홍해삼 치삼의 체내 다당류 함량변화를 파악하기 위하여 체조직의 다당류 분석을 실시하였다. 홍해삼 치삼을 -70℃에서 3일 이상 동결한 후 냉동건조기를 사용하여 72시간 동안 동결건조 하였다.
- 레반을 섭이한 홍해삼의 면역 활성을 확인하기 위해 체강액내 단백질 함량, lysozyme 및 penoloxydase (PO) 활성을 측정 하였다. 체강액 내의 단백질 측정결과 CD군은 56.
- 체내의 다당류 분석은 홍해삼 치삼 건조분말을 2 M TFA(trifluoroacetic acid)로 산가수분해하고 여과(0.2 µm) 및 희석하여 전처리 한 후 HPAEC-PAD system (Dionex, USA)을 이용하여 중성단당류 분리· 동정을 실행하였다.
- 프로바이오틱스와 레반의 혼합 급이가 홍해삼 치삼의 성장과 생존증진에 도움을 주는지 확인하기 위하여 신바이오틱스성 면역증강제를 제작하여 급이 후 4주 간격으로 12주간 생존율과 성장률을 측정하였다. 생존율 실험 결과 CD군은 73.
- 홍해삼 치삼 성장도 분석은 사육수조로부터 개체를 전량 회수한 후 계측하였으며, 실험 시작일로부터 4주 마다 반복 측정되었다. 12주의 실험 종료 후 증체율 일간 성장률 및 생존율을 계산하였다.
- 다당성 물질인 레반 섭이 후 홍해삼 치삼의 체내 다당류 함량변화를 파악하기 위하여 체조직의 다당류 분석을 실시하였다. 홍해삼 치삼을 -70℃에서 3일 이상 동결한 후 냉동건조기를 사용하여 72시간 동안 동결건조 하였다. 건조된 홍해삼 치삼은 분쇄하고 밀봉하여 분석 전까지 4℃에서 냉장보관 하였다.
- 홍해삼에는 다당류가 많이 함유되어 있는 것으로 알려졌으며 (Mourão et al., 1996; Yu et al., 2015) 실험에 사용된 레반이체내 다당류성분에 영향을 미치는지 확인하기 위해 홍해삼을 동결 건조하여 체벽 내에 존재하는 fructose와 glucose의 함량을 분석하였다.
대상 데이터
- 면역 활성 분석을 위하여 각 실험군의 홍해삼 치삼을 실험사료 급이 후 10마리씩 무작위로 선별하여 실험에 사용하였다. 체강액은 1 mL 주사기로 채취하여 1.
- 실험동물은 홍해삼(S. japonicus) 치삼을 이용하였으며, 홍해삼 치삼은 각 수조 당 182마리로 평균 무게는 2.4±0.1 g 이었다.
- 실험사료는 다시마를 주 원료로 한 일반 홍해삼 사료(common diet, CD)와 CD사료에 비타민 등이 포함된 중국산 일반 영양제(sanyihao/yantai, duolai feed co., Ltd.)를 1 kg당 2% 첨가한 사료(nutrition diet, ND)와 1 kg당 스피루리나 15%, 프로바이오틱스(Bacillus polyfermenticus) 3×109 CFU 및 레반 0.1%로 구성된 면역증강제를 배합한 사료(immunity diet, ID)를 사용하였다.
- 실험은 2014년 10월 27일부터 2015년 1월 27일까지 총 12주간 제주도 내 홍해삼 양식장에서 진행되었으며, 양식장 내의 수조 3개를 이용하였다. 실험동물은 홍해삼(S.
- 2 µm) 및 희석하여 전처리 한 후 HPAEC-PAD system (Dionex, USA)을 이용하여 중성단당류 분리· 동정을 실행하였다. 실험조건은 이동상은 18 mM NaOH, 칼럼은 CarboPacTM PA1을 사용하였다.
데이터처리
- 결과의 통계처리는 SPSS version 12 (SPSS Inc., USA)를 활용하여 One-way ANOVA- test 로 통계 분석되었으며 데이터 값의 평균 유의차는 Duncan’s multiple test 사후분석을 통해 P<0.05에서 각 그룹간 유의성을 판단하였다.
이론/모형
- 홍해삼 치삼의 체강액 내 단백질 함량은 Lowry et al. (1952) 의 방법에 따라 측정되었으며, Bovin serum albumin (BSA, sigma, USA)을 사용하여 standard 검량선을 그린 후 750 nm 에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. Lysozyme 활성은 체강액을 15 μL씩 96 well plate에 분주한 후, 150 μL Micrococcus lysodeikticus solution (0.
성능/효과
- Glucose 분석결과 CD군은9.20±2.0 mg/100 mL, ND군은 8.21±0.95 mg/100 mL 및 ID군은 10.04±1.85 mg/100 mL로 나타났다(Fig. 2B).
- PO 활성을 측정한 결과, CD군에서 14.7±6.5 U/mg, ND군은 17.2±8.0 U/mg 및 ID군은 16.2±3.8 U/mg로 CD군에 비하여 ND군과 ID군에서 약간의 차이는 나타났으나 유의적인 차이는 없었다(Fig. 4B, P>0.05).
- , 2015). 그러나 본 연구에서는 면역증강제 배합사료를 급이 한 ID군이 가장 좋은 성장율과 생존률을 나타냈음에도 불구하고 12주 후 측정된 lysozyme 활성은 유의적으로 낮은 수치를 나타내었다. 이와 같은 현상을 이전의 연구들에서는 면역증강제에 의한 lysozyme 활성이 초기에 증가하였다가 지속적인 면역 자극이 오지 않는 경우에는 시간이 지날수록 체내에서 안정화 되는 현상을 나타내는 것으로 추정하고 있다.
- 따라서 본 실험 결과에서 각 실험군의 체강액 내 단백질 함량이 유의적으로 증가하지는 않았지만(P>0.05) ND군과 ID군에서 다소의 높은 수치를 나타낸 것은 이러한 비특이적 면역 활성과 관계 및 생존율과 연관이 있을 것으로 여겨진다.
- (2015)의 연구에서도 마찬가지로 염분스트레스에 따른 c-type lysozyme 유전자 발현 역시 초기에는 증가하다가 시간이 지난 후에는 낮은 경향을 나타내었다. 따라서 본 실험에서 ID군에서 장기간의 사육에 따라 lysozyme이 낮은 수치를 나타낸 결과와 ID군에서 높은 생존율과 성장율을 보인 결과를 종합하여 보면, ID군의 낮은 수치의 lysozyme은 해삼의 사육 안정화에 따른 결과로 보인다. 추후 외부스트레스 자극에 의한 lysozyme 활성변화 등의 연구를 통하여 경시적인 변화를 분석하게 되면 보다 정확한 상관관계를 파악할 수 있을 것으로 기대된다.
- , 2006). 따라서 본 실험에서는 면역자극을 유발하는 요인이 적어 PO 활성이 실험군간 유사한 수치를 나타낸 것으로 판단된다.
- 본 연구에서도 신바이오틱스를 사용한 ID군에서 성장율 및 생존율이 모두 높게 관찰되었으며, 이는 레반이 프로바이오틱스의 활성을 증진시키는 것을 돕고 이를 통하여 스피루리나와 해조류 분말과 같은 섬유성 물질의 장내 소화와 흡수에 기인했기 때문이라고 여겨진다. 따라서 홍해삼 치삼에게 신바이오틱스성 면역증강제를 첨가하여 급이하게 되면 생존율과 성장률을 높여줄 것으로 판단된다.
- , 2015). 본 연구에서도 신바이오틱스를 사용한 ID군에서 성장율 및 생존율이 모두 높게 관찰되었으며, 이는 레반이 프로바이오틱스의 활성을 증진시키는 것을 돕고 이를 통하여 스피루리나와 해조류 분말과 같은 섬유성 물질의 장내 소화와 흡수에 기인했기 때문이라고 여겨진다. 따라서 홍해삼 치삼에게 신바이오틱스성 면역증강제를 첨가하여 급이하게 되면 생존율과 성장률을 높여줄 것으로 판단된다.
- 생존율 실험 결과 CD군은 73.1±0.84%, ND군은 70.9±0.32%, ID군은 76.9±0.5%가 생존하였으며 ID군에서 가장 높은 생존율을 나타내었다(Fig. 1A, P<0.05).
- 성장률 조사에서는 각 실험군의 초기무게는 2.4±0.1 g로 유사하였으나, 최종무게는 CD군 4.6±0.5 g, ND군 5.3±0.62 g이었으며 ID군의 경우 6.1±0.53 g으로 유의적으로 높게 성장하였다(Fig. 1B, P<0.05).
- 일간 성장률 역시 CD군은 0.21±0.03%, ND군은 0.27±0.08%, ID군은 0.34±0.05%로 ID군이 성장률, 증체율, 일간성장률에서 모두 유의적으로 높은 성장을 나타내었다(P<0.05, Table 3).
- 증체율은 실험시작 시에는 모든 실험군이 유사하게 2.4±0.1 g 이었으나 CD군의 경우 12주후 91.67±17.2%, ND군의 경우 118.75±35.2% 및 ID군은 155.6±31.7%으로 증가하였다(Table 3, P<0.05).
- 체강액 내의 단백질 측정결과 CD군은 56.0±10 mg/ mL, ND군은 66.1±24 mg/mL 및 ID군은 66.5±19 mg/mL 로 나타났으며(Fig. 3), CD군에 비하여 ND군과 ID군에서 높아지는 경향성을 보였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다 (P>0.05).
- 한편, 해삼 체강액 내의 lysozyme 활성 실험 결과 CD군은 29.54±9.2 U/mg, ND군은 49.52±7.2 U/mg, ID군은 14.09±3.2 U/mg으로 ID군에서 유의적으로 낮은 수치를 나타내었다(Fig. 4A, P<0.05).
- 해삼과 같이 주로 해조류를 섭이하는 전복 Haliotis midae 또한 프로바이오틱스를 사용 하였을 경우 해조류의 소화를 도와 성장을 증진시키는 것으로 나타났다. 이것은 프로바이오틱스가 해조류의 복잡한 다당류 성분을 빠르게 흡수가능 한 작은 단위로 가수분해 해주는 역할을 하기 때문으로 보고되어졌다 (Erasmus et al.
후속연구
- , 2007; Rehm, 2009), 본 연구결과에서 ID군에서 다소 높은 수치를 나타낸 것은 장내에서 체벽으로 흡수되는 양이 미미하여도 체내 성분에 영향을 미친 것으로 추정된다. 이러한 레반의 급이와 홍해삼 체내의 다당류 변화에 대한 상관관계는 성장의 편차가 적어지는 시기인 중간양성시기의 홍해삼을 대상으로 추가적인 실험이 진행되면 보다 명확하게 밝혀질 것으로 기대된다.
- 이상의 연구의 결과를 종합 해보면, 신바이오틱스성 면역증강제 급이를 통해 홍해삼 치삼의 증체율, 일간 성장률 및 생존율이 증가됨을 확인하였으며, 면역 활성의 경우 안정화 되는 경향을 나타내었으나 추가 실험을 통해 면역 활성을 검증해 볼필요가 있을 것으로 판단된다. 이후 추가적인 보충실험을 통하여 본 연구에서 개발된 면역증강제가 홍해삼의 성장증대와 친환경적인 질병제어에 있어 양식어가에 도움을 줄 수 있을 것으로 여겨진다.
- 이상의 연구의 결과를 종합 해보면, 신바이오틱스성 면역증강제 급이를 통해 홍해삼 치삼의 증체율, 일간 성장률 및 생존율이 증가됨을 확인하였으며, 면역 활성의 경우 안정화 되는 경향을 나타내었으나 추가 실험을 통해 면역 활성을 검증해 볼필요가 있을 것으로 판단된다. 이후 추가적인 보충실험을 통하여 본 연구에서 개발된 면역증강제가 홍해삼의 성장증대와 친환경적인 질병제어에 있어 양식어가에 도움을 줄 수 있을 것으로 여겨진다.
- 이러한 결과는 실험에 사용된 홍해삼 치삼의 경우에 초기 같은 무게로 시작하였으나 양성과정에서 같은 그룹 내에서도 개체간의 차이가 크게 나타났기 때문으로 여겨진다. 추후 보다 큰 개체인 중간양성단계의 홍해삼을 이용하여 면역증강제 섭이에 따른 체강액 내의 단백질 함량을 분석하게 되면 더욱 명확히 면역증강제와 체강액 내 단백질의 상관관계를 파악할 수 있을 것이라 사료된다. 따라서 본 실험 결과에서 각 실험군의 체강액 내 단백질 함량이 유의적으로 증가하지는 않았지만(P>0.
- 따라서 본 실험에서 ID군에서 장기간의 사육에 따라 lysozyme이 낮은 수치를 나타낸 결과와 ID군에서 높은 생존율과 성장율을 보인 결과를 종합하여 보면, ID군의 낮은 수치의 lysozyme은 해삼의 사육 안정화에 따른 결과로 보인다. 추후 외부스트레스 자극에 의한 lysozyme 활성변화 등의 연구를 통하여 경시적인 변화를 분석하게 되면 보다 정확한 상관관계를 파악할 수 있을 것으로 기대된다.
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