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문제 정의
- 본 연구에서는 다양한 물리적 자극(온도자극 및 전기자극)에 초점을 맞추어 복합적 자극을 인가할 수 있는 시스템을 제작하여 예쁜꼬마선충의 야생형과 돌연변이 개체의 물리적 자극에 대한 반응을 분석하였다. 본 연구에서는 초기 연구로 온도 자극과 전기 자극을 우선적으로 인가하여 선충의 반응을 분석하였으며, 야생형과 각각의 자극에 대하여 정상적인 반응을 나타내지 않는 돌연변이 개체의 실험을 수행하여 비교, 분석하였다.
- 본 연구에서는 물리적 자극을 인가할 수 있는 미세유체시스템을 구성하여 예쁜꼬마선충에 온도와 전기장 두 가지 자극을 각각 인가하고, 이러한 자극에 대한 야생형, 돌연변이 예쁜꼬마선충의 반응을 비교, 분석하였다. 실험 결과로부터 본 시스템이 예쁜꼬마선충의 물리적 자극에 대한 행동 분석에 적합한 효율적인 시스템이라는 것을 검증하였다.
- 반대로 전기 주성에 대해 결함을 나타내는 돌연변이 개체인 unc-6은 전기장을 따라 움직이지 못하므로 야생형 개체에 비해 상대적으로 자유롭게 전 채널에 분포하여 방향성 및 일관적인 반응을 나타내지 않을 것으로 추측하였다. 본 연구에서는 이와 같은 집단의 행동 양상을 한 번에 확인할 수 있는 단순한 시스템을 구현하였다. 본 연구에서 개발한 전기 주성 인가 미세유체시스템을 이용한 실험 결과는 Fig.
가설 설정
- 0℃의 온도구배를 제작하였다. 해당 온도는 열전대를 이용하여 측정하였고, 온도구배는 선형으로 가정할 수 있었다. 낮은 온도인 13.
제안 방법
- 예쁜꼬마선충의 물리적 자극에 대한 반응을 분석하기 위한 미세유체시스템은 soft-lithography 공정으로 제작하였다. silicon wafer위에 패턴이 있는 몰드(mold)를 제작하고 몰드 위에 생체 적합 물질인 PDMS(polydimethylsiloxane)를 응고시켜 패턴이 찍힌 PDMS 디바이스를 제작하였다. 최종적인 미세유체시스템은 PDMS 디바이스를 플라즈마 공정을 통해 slide glass와 접합하여 제작하였다.
- 현미경으로 실시간으로 예쁜꼬마선충의 움직임을 촬영하고 이미징 소프트웨어를 이용하여 비디오로 기록하였다. 각 종류의 예쁜꼬마선충으로 5세트의 실험을 진행하며 각 세트의 실험은 온도구배를 가하고 20분간 기록을 하는 것으로 진행하였다.
- 해당 온도는 열전대를 이용하여 측정하였고, 온도구배는 선형으로 가정할 수 있었다. 낮은 온도인 13.5℃에서부터 같은 간격으로 A, B, C, D 구역으로 나누어 시간에 따른 예쁜꼬마선충의 분포 정도를 분석하였다. 실험에 사용한 예쁜꼬마선충은 YA(예쁜꼬마선충의 일생 중 Young Adult 시기)이고 해당 예쁜꼬마선충은 15℃에서 배양하였다.
- 실제 제작된 채널의 규격은 전체 길이 1 cm, 폭 300 ㎛, 높이 100 ㎛이며, 전기장을 인가하기 위한 부속채널의 폭은 25 ㎛이다. 또한 전극을 삽입하기 위한 각 부속 채널 간의 간격은 2 mm이며 최대 8개의 전극을 동시에 삽입할 수 있도록 하였다. 전체적인 디바이스의 크기는 슬라이드 글라스 크기로 맞추어 제작되었다.
- 본 연구에서는 다양한 물리적 자극(온도자극 및 전기자극)에 초점을 맞추어 복합적 자극을 인가할 수 있는 시스템을 제작하여 예쁜꼬마선충의 야생형과 돌연변이 개체의 물리적 자극에 대한 반응을 분석하였다. 본 연구에서는 초기 연구로 온도 자극과 전기 자극을 우선적으로 인가하여 선충의 반응을 분석하였으며, 야생형과 각각의 자극에 대하여 정상적인 반응을 나타내지 않는 돌연변이 개체의 실험을 수행하여 비교, 분석하였다. 이와 같은 일련의 실험을 통해 본 연구에서 개발된 시스템을 이용하여 충분히 효과적으로 서로 다른 두 가지의 자극을 인가하고 그에 대한 반응을 분석할 수 있음을 보였다.
- 이를 이용하여 채널에 고르게 전기장을 인가하기 위하여 KEITHLEY 6478 picoammeter/voltage source를 사용하였다. 선행연구에서 예쁜꼬마선충이 반응한다고 검증된 4V/cm 세기의 전기장을 고르게 인가하였으며, 매 실험 세트마다 전압을 측정하여 검증하고 실험을 수행하였다.
- 예쁜꼬마선충의 물리적 자극에 대한 반응을 분석하기 위한 미세유체시스템은 soft-lithography 공정으로 제작하였다. silicon wafer위에 패턴이 있는 몰드(mold)를 제작하고 몰드 위에 생체 적합 물질인 PDMS(polydimethylsiloxane)를 응고시켜 패턴이 찍힌 PDMS 디바이스를 제작하였다.
- 온도구배시스템은 펠티어 소자(LAIRD TECHNOLOGES, 12*12*3.6mm)로 제작하였다. 펠티어 소자는 펠티어 원리에 근거한 것으로 한 면은 발열하고 다른 한 면은 흡열하게 된다.
- 온도주성 비교실험에서 펠티어 소자를 이용하여 13.5 – 20.0℃의 온도구배를 제작하였다.
- 이렇게 배양된 예쁜꼬마선충은 egg preparation을 거쳐 같은 나이, 같은 크기로 키우게 된다. 이 과정을 synchronization이라고 하며 이 과정을 거쳐서 자란 예쁜꼬마선충으로 실험을 진행하였다. 이는 예쁜꼬마선충이 stage에 따라 신경 발달 정도가 다르므로 신뢰도 높은 결과를 얻기 위해 반드시 필요한 과정이다.
- 각 종류의 예쁜꼬마선충을 각각 다른 미세유체시스템에 넣고 표면에 명칭을 주기하였다. 이때 온도구배시스템을 작동시키고 온도구배시스템의 양끝단의 온도(두 펠티어 소자 표면의 온도)가 13.5℃, 20℃에서 안정화되면 미세유체시스템을 올려놓았다. 현미경으로 실시간으로 예쁜꼬마선충의 움직임을 촬영하고 이미징 소프트웨어를 이용하여 비디오로 기록하였다.
- 최소 10세트의 실험을 수행하여 평균 분포 비율을 얻었다. 전기장에 대한 야생형과 돌연변이 개체의 반응을 비교, 분석하기 위하여 전기주성 결함 돌연변이(unc-6)와 속도가 느린 근육 결함 돌연변이(unc-54)를 이용한 실험도 수행하였다.
- 이 때 형성되는 전기장은 채널을 크게 세 부분으로 나누었을 때(zone A, B, C) A와 C 구역에만 형성된다. 전기장의 방향은 가운데 구역인 B 구역을 향하도록 하였으며, 전기장을 인가하기 전 분포와 전기장을 인가한 후 1분 간격으로 전체 마리 수에 대한 각 구역의 선충의 비를 계산하여 전기주성 결과를 분석하였다. 최소 10세트의 실험을 수행하여 평균 분포 비율을 얻었다.
- 온도주성 실험과 동일하게 egg preparation 과정을 거쳐 동일한 세대로 배양된 예쁜꼬마선충을 사용하였다. 준비된 예쁜꼬마선충을 미세유체시스템에 주입하고 부속채널에 삽입된 전극에 전압을 인가하여 전기장을 형성하였다. 이 때 형성되는 전기장은 채널을 크게 세 부분으로 나누었을 때(zone A, B, C) A와 C 구역에만 형성된다.
- 5℃, 20℃에서 안정화되면 미세유체시스템을 올려놓았다. 현미경으로 실시간으로 예쁜꼬마선충의 움직임을 촬영하고 이미징 소프트웨어를 이용하여 비디오로 기록하였다. 각 종류의 예쁜꼬마선충으로 5세트의 실험을 진행하며 각 세트의 실험은 온도구배를 가하고 20분간 기록을 하는 것으로 진행하였다.
대상 데이터
- Egg preparation 과정을 통해 같은 세대로 배양 된 예쁜꼬마선충을 준비하였다. 제작된 미세유체시스템을 플라즈마 처리를 통해 표면이 친수성을 띠게 하고 M9 buffer를 주입하였다.
- , 총 5 종류로 CGC (Caenorhabditis Genetics Center)에서 구매하여 실험실 인큐베이터에서 15℃ 및 20℃에서 배양하였다. 배양 시에는 일반적인 프로토콜에 따라 제작된 NGM(nematode growth media)배지를 사용하였다. 이렇게 배양된 예쁜꼬마선충은 egg preparation을 거쳐 같은 나이, 같은 크기로 키우게 된다.
- 최종적인 미세유체시스템은 PDMS 디바이스를 플라즈마 공정을 통해 slide glass와 접합하여 제작하였다. 실제 제작된 채널의 규격은 전체 길이 1 cm, 폭 300 ㎛, 높이 100 ㎛이며, 전기장을 인가하기 위한 부속채널의 폭은 25 ㎛이다. 또한 전극을 삽입하기 위한 각 부속 채널 간의 간격은 2 mm이며 최대 8개의 전극을 동시에 삽입할 수 있도록 하였다.
- 실험에 사용된 예쁜꼬마선충은 N2(야생형), PR678(tax-4)7), IK589(ttx-7)8), CB78(unc-6)9), BC347(unc-54)10), 총 5 종류로 CGC (Caenorhabditis Genetics Center)에서 구매하여 실험실 인큐베이터에서 15℃ 및 20℃에서 배양하였다. 배양 시에는 일반적인 프로토콜에 따라 제작된 NGM(nematode growth media)배지를 사용하였다.
- 5℃에서부터 같은 간격으로 A, B, C, D 구역으로 나누어 시간에 따른 예쁜꼬마선충의 분포 정도를 분석하였다. 실험에 사용한 예쁜꼬마선충은 YA(예쁜꼬마선충의 일생 중 Young Adult 시기)이고 해당 예쁜꼬마선충은 15℃에서 배양하였다.
- 온도주성 실험과 동일하게 egg preparation 과정을 거쳐 동일한 세대로 배양된 예쁜꼬마선충을 사용하였다. 준비된 예쁜꼬마선충을 미세유체시스템에 주입하고 부속채널에 삽입된 전극에 전압을 인가하여 전기장을 형성하였다.
데이터처리
- 전기장의 방향은 가운데 구역인 B 구역을 향하도록 하였으며, 전기장을 인가하기 전 분포와 전기장을 인가한 후 1분 간격으로 전체 마리 수에 대한 각 구역의 선충의 비를 계산하여 전기주성 결과를 분석하였다. 최소 10세트의 실험을 수행하여 평균 분포 비율을 얻었다. 전기장에 대한 야생형과 돌연변이 개체의 반응을 비교, 분석하기 위하여 전기주성 결함 돌연변이(unc-6)와 속도가 느린 근육 결함 돌연변이(unc-54)를 이용한 실험도 수행하였다.
성능/효과
- 1) 가장 큰 특성은 인간과 60~80%의 유전자를 공유하고 있다는 점이다.2) 최근, 전 세계적으로 동물 실험 기반의 검증 시스템에 대한 요구는 높아지고 있으나 윤리적인 문제가 대두되어 점차 동물 실험에 대한 규제가 강화되고 있다.
- 약 5분 지난 후, 야생형과 마찬가지로 B구역에 주로 분포함을 알 수 있었다. B구역으로 느리게 집중되는 근육결함 돌연변이도 전기 주성을 나타낼 수 있도록 시스템이 충분히 긴 시간동안 전기장이 안정적으로 유지하는 것을 검증하였다. 마지막으로 전기주성 결함 돌연변이인 unc-6의 경우, 전기주성을 나타내는 다른 개체와는 달리 눈에 띄는 경향을 나타내지 않으며(Fig.
- 5 B). 근육 결함 돌연변이인 unc-54의 경우 야생형에 비하여 상대적으로 이동 속도가 느리지만 전기 주성은 정상적으로 나타내는 것을 확인하였다(Fig.5 C). 약 5분 지난 후, 야생형과 마찬가지로 B구역에 주로 분포함을 알 수 있었다.
- 따라서 이 두 돌연변이는 비정상적인 온도주성을 가지는 것을 알 수 있다. 본 실험을 통해 예쁜꼬마선충의 야생형과 돌연변이 개체가 서로 다른 온도주성을 나타낸다는 것을 알 수 있으며 이 미세유체시스템이 예쁜꼬마선충의 온도주성을 쉽게 비교분석 할 수 있음을 검증하였다.
- 5 D), 결과적으로 전 채널에 고르게 분포함을 알 수 있었다. 본 실험을 통해 예쁜꼬마선충의 야생형과 돌연변이 개체가 전기자극에 대해 서로 다른 반응을 나타냄을 검증하였으며, 본 미세유체시스템이 예쁜꼬마선충의 온도주성 뿐만이 아니라 전기주성을 효과적으로 검증할 수 있음을 보였다.
- 본 연구에서는 물리적 자극을 인가할 수 있는 미세유체시스템을 구성하여 예쁜꼬마선충에 온도와 전기장 두 가지 자극을 각각 인가하고, 이러한 자극에 대한 야생형, 돌연변이 예쁜꼬마선충의 반응을 비교, 분석하였다. 실험 결과로부터 본 시스템이 예쁜꼬마선충의 물리적 자극에 대한 행동 분석에 적합한 효율적인 시스템이라는 것을 검증하였다. 본 시스템은 매우 간단하고 다른 시스템과의 결합이 용이하다.
- 본 연구에서는 초기 연구로 온도 자극과 전기 자극을 우선적으로 인가하여 선충의 반응을 분석하였으며, 야생형과 각각의 자극에 대하여 정상적인 반응을 나타내지 않는 돌연변이 개체의 실험을 수행하여 비교, 분석하였다. 이와 같은 일련의 실험을 통해 본 연구에서 개발된 시스템을 이용하여 충분히 효과적으로 서로 다른 두 가지의 자극을 인가하고 그에 대한 반응을 분석할 수 있음을 보였다.
- 본 연구에서 개발된 시스템은 다음과 같은 장점이 있다. 첫 번째로, 시스템의 구성이 매우 간단하다. 간단한 구성으로도 예쁜꼬마선충의 반응을 효과적으로 분석할 수 있다.
후속연구
- 3), 4), 5) 이는 실제 생물체가 살아가는 복합적인 자극이 동시에 인가되는 환경을 충분히 모사하지 못하므로 그 결과를 얻는데 분명한 한계점이 있다.
- 간단하게 효과적으로 미세채널을 구축하여 화학물질의 농도 구배를 형성할 수 있음을 보인 선행연구를 기반으로 이것을 응용하면 이와 같은 연구를 통해서 물리적 자극과 화학적 자극이 결합되었을 경우의 예쁜꼬마선충의 행동 변화 분석을 진행할 수 있는 초석을 다질 수 있다. 따라서 본 연구에서 개발한 예쁜꼬마선충의 행동 특성을 분석할 수 있는 플랫폼은 다양한 기초연구에 응용될 수 있으며 더 나아가 단일 자극을 동시에 인가하는 실제 환경을 모사한 복합자극에 대한 연구로 발전할 수 있다. 인간을 비롯한 모든 생물체는 항상 다양하고 복잡한 자극에 노출되고 있으므로 인간과 많은 부분의 유전자를 공유하고 있는 예쁜꼬마선충에 대한 연구를 단일 자극분석으로부터 복합적 자극분석으로 확장하면 인간의 자극과 반응에 대한 보다 심도 깊은 이해가 가능할 것으로 기대된다.
- 본 시스템은 매우 간단하고 다른 시스템과의 결합이 용이하다. 따라서 하나의 자극에 국한되지 않고 본 시스템을 플랫폼으로 이용하여 다른 물리적 자극뿐 만 아니라 화학적 자극에 대한 실험을 수행할 수 있다. 본 시스템에 화학적 농도 구배를 형성할 수 있는 채널을 추가적으로 구성한 후에 전기장 인가 또는 온도 구배를 형성하여 동일한 실험을 수행할 수 있다.
- 두 번째로 반응을 분석할 때 일반적으로 쓰이는 생화학적인 물질을 사용하지 않으므로 예쁜꼬마선충이 물리적 자극 외에는 다른 영향을 받지 않는다. 마지막으로 본 시스템에서 두 가지 물리적 자극을 효과적으로 인가하였으므로 향후 다른 자극을 인가할 수 있는 플랫폼으로 응용이 가능함을 검증하였다.
- 따라서 하나의 자극에 국한되지 않고 본 시스템을 플랫폼으로 이용하여 다른 물리적 자극뿐 만 아니라 화학적 자극에 대한 실험을 수행할 수 있다. 본 시스템에 화학적 농도 구배를 형성할 수 있는 채널을 추가적으로 구성한 후에 전기장 인가 또는 온도 구배를 형성하여 동일한 실험을 수행할 수 있다. 간단하게 효과적으로 미세채널을 구축하여 화학물질의 농도 구배를 형성할 수 있음을 보인 선행연구를 기반으로 이것을 응용하면 이와 같은 연구를 통해서 물리적 자극과 화학적 자극이 결합되었을 경우의 예쁜꼬마선충의 행동 변화 분석을 진행할 수 있는 초석을 다질 수 있다.
- 따라서 본 연구에서 개발한 예쁜꼬마선충의 행동 특성을 분석할 수 있는 플랫폼은 다양한 기초연구에 응용될 수 있으며 더 나아가 단일 자극을 동시에 인가하는 실제 환경을 모사한 복합자극에 대한 연구로 발전할 수 있다. 인간을 비롯한 모든 생물체는 항상 다양하고 복잡한 자극에 노출되고 있으므로 인간과 많은 부분의 유전자를 공유하고 있는 예쁜꼬마선충에 대한 연구를 단일 자극분석으로부터 복합적 자극분석으로 확장하면 인간의 자극과 반응에 대한 보다 심도 깊은 이해가 가능할 것으로 기대된다.
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