본 연구에서 배아의 생식세포 동결에 가장 흔히 쓰이고 있는 두 가지 동결 보호제, 즉 DMSO와 EG의 독성을 비교하고자 생쥐 수정란 모델을 이용한 실험을 하였다. 생후 6주령의 암컷 생쥐 $F_1$ hybrid mice에 10 IU의 PMSG를 복강 주사하여 과배란을 유도하고, 2-세포기 배아를 획득하고 DMSO와 EG 각각 노출시킨 후, 배양을 하였다. 배반포의 전체 세포수는 2-세포기 단계에서 DMSO($68.1{\pm}24.1$)로 EG($81.2{\pm}27.0$) 혹은 control($99.0{\pm}18.3$)(p<0.001) 처리구에 비해서 유의적으로 낮았다. DMSO 처리구가 EG 처리구에 비해 세포수가 적었다. DMSO($15.4{\pm}1.5$)와 EG($10.2{\pm}1.4$) 두 처리구는 대조구($6.1{\pm}0.9$, p<0.0001)와 비교해서 배반포에서 세포사 비율이 더 높음을 확인했다. 또한, DMSO 처리구는 EG 처리구(p<0.001)보다 더 많은 세포사멸된 세포가 확인되었다. DMSO 또는 EG 처리군과 대조군 사이에는 배아 부화율에 있어서 차이가 있었으며, 이는 배아에 대한 동결 보호제의 잠재적인 독성을 확인한 결과였다. 이번 연구에서 장기간 처리했을 때 EG 처리군보다 DMSO 처리군에서 배아발달과 세포수가 저하된 것은 DMSO의 독성이 더 높을 것으로 사료된다.
본 연구에서 배아의 생식세포 동결에 가장 흔히 쓰이고 있는 두 가지 동결 보호제, 즉 DMSO와 EG의 독성을 비교하고자 생쥐 수정란 모델을 이용한 실험을 하였다. 생후 6주령의 암컷 생쥐 $F_1$ hybrid mice에 10 IU의 PMSG를 복강 주사하여 과배란을 유도하고, 2-세포기 배아를 획득하고 DMSO와 EG 각각 노출시킨 후, 배양을 하였다. 배반포의 전체 세포수는 2-세포기 단계에서 DMSO($68.1{\pm}24.1$)로 EG($81.2{\pm}27.0$) 혹은 control($99.0{\pm}18.3$)(p<0.001) 처리구에 비해서 유의적으로 낮았다. DMSO 처리구가 EG 처리구에 비해 세포수가 적었다. DMSO($15.4{\pm}1.5$)와 EG($10.2{\pm}1.4$) 두 처리구는 대조구($6.1{\pm}0.9$, p<0.0001)와 비교해서 배반포에서 세포사 비율이 더 높음을 확인했다. 또한, DMSO 처리구는 EG 처리구(p<0.001)보다 더 많은 세포사멸된 세포가 확인되었다. DMSO 또는 EG 처리군과 대조군 사이에는 배아 부화율에 있어서 차이가 있었으며, 이는 배아에 대한 동결 보호제의 잠재적인 독성을 확인한 결과였다. 이번 연구에서 장기간 처리했을 때 EG 처리군보다 DMSO 처리군에서 배아발달과 세포수가 저하된 것은 DMSO의 독성이 더 높을 것으로 사료된다.
This study was carried out to evaluate the effects of embryonic stage and toxicities of cryoprotectant on the rates of survival and development of the cryopreserved mouse early embryo and finally to establish the cryopreservation method of surplus embryos obtained during assisted reproductive techno...
This study was carried out to evaluate the effects of embryonic stage and toxicities of cryoprotectant on the rates of survival and development of the cryopreserved mouse early embryo and finally to establish the cryopreservation method of surplus embryos obtained during assisted reproductive technology. Toxicities of two cryoprotectants, dimethyl sulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) were investigated using a murine embryo model. Female F-1 mice were stimulated with gonadotropin, induced ovulation with hCG and mated. Two cell embryos were collected and cultured after exposure to either DMSO or EG. Embryo development was evaluated up to the blastocyst stage. The total cell count of blastocysts that were treated with DMSO ($68.1{\pm}24.1$) at the 2-cell stage was significantly lower than that were treated with EG ($81.2{\pm}27.0$) or the control ($99.0{\pm}18.3$) (p<0.001). On comparison of two cryoprotectant treated groups, the DMSO treated group showed a decreased cell count compared with the EG treated group (p<0.05). Both DMSO ($15.4{\pm}1.5$) and EG ($10.2{\pm}1.4$) treated groups showed higher apoptosis rates of cells in the blastocyst compared with the control ($6.1{\pm}0.9$, p<0.0001). In addition, the DMSO treated group showed more apoptotic cells than the EG treated group (p<0.001). The potential toxicity of cryoprotectants was uncovered by prolonged exposure of murine embryos to either DMSO or EG at room temperature. When comparing two cryoprotective agents, EG appeared to be less toxic than DMSO at least in a murine embryo model.
This study was carried out to evaluate the effects of embryonic stage and toxicities of cryoprotectant on the rates of survival and development of the cryopreserved mouse early embryo and finally to establish the cryopreservation method of surplus embryos obtained during assisted reproductive technology. Toxicities of two cryoprotectants, dimethyl sulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) were investigated using a murine embryo model. Female F-1 mice were stimulated with gonadotropin, induced ovulation with hCG and mated. Two cell embryos were collected and cultured after exposure to either DMSO or EG. Embryo development was evaluated up to the blastocyst stage. The total cell count of blastocysts that were treated with DMSO ($68.1{\pm}24.1$) at the 2-cell stage was significantly lower than that were treated with EG ($81.2{\pm}27.0$) or the control ($99.0{\pm}18.3$) (p<0.001). On comparison of two cryoprotectant treated groups, the DMSO treated group showed a decreased cell count compared with the EG treated group (p<0.05). Both DMSO ($15.4{\pm}1.5$) and EG ($10.2{\pm}1.4$) treated groups showed higher apoptosis rates of cells in the blastocyst compared with the control ($6.1{\pm}0.9$, p<0.0001). In addition, the DMSO treated group showed more apoptotic cells than the EG treated group (p<0.001). The potential toxicity of cryoprotectants was uncovered by prolonged exposure of murine embryos to either DMSO or EG at room temperature. When comparing two cryoprotective agents, EG appeared to be less toxic than DMSO at least in a murine embryo model.
본 연구는 생식세포 동결에 가장 흔히 쓰이고 있는 두가지 동결 보호제, 즉 DMSO 그리고 EG의 독성을 비교하고자 생쥐 수정란 모델을 이용해 포배기까지 배아 발생을 시키면서 나타나는 세포 사멸의 정도와 배아 발달 지연현상을 비교 및 검토하였다. 생식능력보존의 새로운 기술인 난소조직 동결 보존술은 아직 초기 단계이어서 그 효율성이 확실하지는 않고 문제점도 많지만, 사람에게 무엇보다 성공적인 동결보존의 핵심요소는 동결 보호제의 선택에 있는 것으로 추정된다.
제안 방법
본 연구에서는 DMSO와 EG 간의 독성의 확립을 위해 생쥐 2-세포기 배아를 장기간(60분) 동결 보호제에 노출시킨 후 포배기까지 배 발생을 시키면서 나타나는 세포 사멸의 정도와 배 발달 지연현상을 각각 비교 및 조사하였다.
대상 데이터
배양액은 glutamine(0.1 mM/ml)이 포함된 KSOM을 사용하였고, 동결 보호제의 비교 대상인 DMSO와 EG는 1.5M Leibovitz-L15(Gibco BRL, UK)를 기본 배양액으로 사용하였다. 본 실험에 이용된 그 외 시약들은 Sigma(St Louis, Mo, USA)사 제품을 구매하여 사용하였다.
본 연구에 사용된 실험동물은 일본 도쿄대학교 수의과학대학 동물실험 윤리위원회의 A-10-1214 승인 하에 진행하였으며, 항온 및 항습이 유지되면서 낮 12시간, 밤 12시간이 조절되는 실험동물 사육실에서 생쥐 제 1세대 잡종(C57BL ♀ × CBA ♂)으로 생후 6주된 암컷과 6~8주된 생식력이 확인된 수컷에게 충분한 사료와 물, 공간을 제공하면서 사육하였다.
데이터처리
본 시험에서 얻어진 모든 자료들의 통계적 유의성은 배 발달율 분석은 χ2 test로 하였고, 그 이외는 Student's t-test를 사용하였으며, P값이 0.05보다 낮은 경우를 유의하다고 정의하였다.
이론/모형
hCG 주사 후, 48시간째에 교배가 확인된 개체만을 경추탈골 방법으로 죽인 후, 외과적 수술 방법으로 난관을 떼어내었다. 그리고 인슐린 주사기를 이용하여 난관 관류법으로 2-세포기의 배아를 획득하였다.
성능/효과
배반포 세포 수는 DMSO 처리군(68.1±24.1)과 EG 처리군(81.2±27.0) 모두 대조군(99.0±18.0)에 비해 유의적으로 낮은 값을 나타냈다(p<0.0001). 처리군 간에는 DMSO 처리군이 EG 처리군에 비해 유의하게(p<0.
배아 발달율은 대조군에서 93.7%가 정상적으로 발달하였으며, 먼저, DMSO 처리군에서는 A 군이 14.7%, B 군이 35.1%, C 군이 54.2%로 각각 나타났으며, EG 처리군에서는 각각 8.9%, 31.1%, 63.2%로 나타났다. Fig.
세포 사멸된 세포수를 분석한 결과에서도 DMSO 처리군(15.4±1.5)과 EG 처리군(10.2±1.4) 모두 대조군(6.1±0.9)에 비해 유의하게 높게 나타났으며(p<0.001), 처리군 간에는 DMSO 처리군이 EG 처리군에 비해 유의하게(p<0.001) 세포 사멸된 세포의 비율이 높은 것으로 각각 나타났다(Fig. 4).
그 결과, DMSO 그리고 EG 처리군과 대조군 사이에는 배아 부화율에 있어서 차이가 있었으며, 이는 배아에 대한 동결 보호제의 잠재적인 독성을 확인한 결과였다. 이번 연구에서 장기간 처리했을 때 EG처리군보다 DMSO 처리군에서 배아발달과 세포수가 저하된 결과로부터 DMSO의 독성이 더 높을 것으로 사료되며, 이전의 연구결과(Mahadevan 등, 1997; Demici 등, 2001)와 일치하는 결과를 나타내었다.
후속연구
아직까지 동결 보호제의 독성에 대해 많은 부분이 밝혀지지 않고 있으므로, 동결 보호제의 독성을 알아보는 추가연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다. 특히 생식(germ) 세포에 대한 성장과 발달에 있어서 저해 효과를 최소화 할 수 있도록 분자 수준에서의 비 치사성 동결 보호제 손상에 대해 더욱더 세밀한 연구 조사가 필요하다고 사료된다.
아직까지 동결 보호제의 독성에 대해 많은 부분이 밝혀지지 않고 있으므로, 동결 보호제의 독성을 알아보는 추가연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다. 특히 생식(germ) 세포에 대한 성장과 발달에 있어서 저해 효과를 최소화 할 수 있도록 분자 수준에서의 비 치사성 동결 보호제 손상에 대해 더욱더 세밀한 연구 조사가 필요하다고 사료된다. 또한 동결 보호제의 알려지지 않은 독성을 감소시키기 위해서 가능하면 동결 보호제에 노출되는 시간을 최소화하는 것이 중요하다고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
동결보존의 기본 원리는 무엇인가?
동결보존의 기본 원리는 초기배아를 비롯하여 세포나 조직, 개체 등의 고유한 형태를 유지하면서 내부의 수분을 고농도의 동결 보호제(cryoprotective agents: CPAs)의 삼투압 원리를 이용하여 점진적으로 제거하고, 이로 인해 얼음결정(icecrystal)을 최소화하여 세포를 보호하는 것이다(Yoon 등, 2007). 배아 및 세포의 동결 보존은 삼투압, 세포 내외의 얼음결정 형성 및 동결 보호제의 독성 등에 의해서 다양한 세포의 손상을 일으킬 수가 있다.
동결보존에 있어 동결 방법만큼 중요한 것은 무엇인가?
배아 및 세포의 동결 보존은 삼투압, 세포 내외의 얼음결정 형성 및 동결 보호제의 독성 등에 의해서 다양한 세포의 손상을 일으킬 수가 있다. 생식능력보존의 새로운 기술인 난소조직 동결 보존술은 아직 초기 단계이어서 사람에게 그 효율성이 확실하지는 않고 문제점도 많지만, 무엇보다 성공적인 동결보존을 위해서는 동결 방법만큼이나 중요한 것은 동결-융해 과정 중 사용되는 동결 보호제의 종류, 농도 및 처리 시간이다(Friedler 등, 1988; Mandelbaum 등, 1988; Dumoulin 등, 1994; Nowshari 등, 1995). 기존에는 독성이 강하고 점성이 높은 침투성의 동결 보호제로서 dimethyl sulfoxide(DMSO), glycerol 그리고 propandiol(1,2-PROH)를 사용하였다(Lovelock 등, 1959; Boutron 등, 1984).
냉각 속도와 융해 속도는 각각 어떻게 얼음 결정 형성에 영향을 주는가?
냉각 속도와 융해 속도는 얼음결정 형성에 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Sutton 등, 1991; Gardner 등, 2000). 냉각 속도가 너무 빠를 때 얼음결정 형성의 증식이 과다해지고, 또한 너무 느려도 심한 탈수로 인한 염분의 침착이 문제가 된다. 느린 융해는 결정이 크게 자라는 기회를 주어 세포에 손상을 주게 되지만, 급속 융해는 얼음 결정이 자라는 시간을 단축해 얼음결정의 용해를 촉진한다(Hey 등, 1996). 냉동과 융해가 세포에 주는 손상을 줄이기 위해 동결 보호제는 매우 중요한 역할을 하지만, 독성 또한 세포에 손상을 줄 수 있기 때문에 조심해 사용해야 한다.
참고문헌 (25)
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