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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 익기보혈탕 물 추출물(Yikgeebohyul-tang, YKBHT)이 propylthiouracil(PTU)로 유발된 rat의 갑상선기능저하증에 미치는 영향과 갑상선기능저하증으로 초래될 수 있는 간손상과 생식기 장애에 미치는 효과에 대해 관찰하였으며, 갑상선기능저하증 치료제로 사용되고 있는 LT4 투여군과 비교하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- PTU로 유발된 rat의 갑상선기능저하증에 미치는 YKBHT의 영향을 평가하기 위하여 500, 250 및 125 mg/kg의 YKBHT을 투여 후 그 변화를 LT4 투여군과 비교하여 살펴본 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 실험동물은 군당 8마리씩 6그룹 - 정상 대조군, PTU 대조군, LT4 투여군 및 세 용량의 YKBHT 투여군으로 구분하여 실험을 실시하였다. YKBHT 투여군은 1000, 500 및 250 mg의 YKBHT을 각각 10 ml의 멸균 증류수에 용해시켜, kg 당 5 ml의 용량으로 매일 1회씩 PTU 투여 시작 2주 전부터 42일 동안 경구 투여하였다.
- 모든 실험동물의 체중을 automatic electronic balance(Precisa Instrument, Zürich, Switzland)를 이용하여 YKBHT 투여 시작 1일 전, 투여 시작일, 투여 7, 14(PTU 및 LT4 투여 시작일), 21, 28, 35, 41 및 42(최종 희생일)일 후에 각각 측정하였다. 사료섭취에 따른 체중 변화를 최소화하기 위해서 모든 실험동물은 YKBHT 투여시작일 및 최종 희생일에 18시간 정도 절식을 실시하였다.
- 본 실험은 YKBHT이 PTU로 유발된 rat의 갑상선기능저하증에 미치는 영향을 체중, 갑상선, 간, 고환 및 부고환, 전립선의 중량과 혈청 중 갑상선 호르몬, 혈청 중 성 호르몬, 혈청 중 지질, 혈청 중 AST 및 ALT, 간 및 고환 항산화 system의 변화와 갑상선, 간, 고환 및 부고환, 전립선의 조직병리학적 변화를 통해 관찰하였다. 그 결과는 갑상선기능저하증 치료제로 사용되고 있는 LT4 0.
- 실험동물은 군당 8마리씩 6그룹 - 정상 대조군, PTU 대조군, LT4 투여군 및 세 용량의 YKBHT 투여군으로 구분하여 실험을 실시하였다. YKBHT 투여군은 1000, 500 및 250 mg의 YKBHT을 각각 10 ml의 멸균 증류수에 용해시켜, kg 당 5 ml의 용량으로 매일 1회씩 PTU 투여 시작 2주 전부터 42일 동안 경구 투여하였다.
- Louise, MO, USA)를 10 ml 멸균 생리식염수에 용해시킨 후 kg 당 2 ml의 용량으로 매일 1회씩, 28일간 등쪽의 경부 피하에 주사하여 갑상선기능저하증을 유발하였다. 한편 정상 대조군에서는 PTU 대신 동일한 용량의 멸균 생리식염수만 동일한 방법과 기간 동안 투여하였다.
대상 데이터
- 132마리의 수컷 SPF.VAF Outbred Crl:CD [Sprague-Dawley] rat(6-wk old upon receipt, OrientBio, Seungnam, Korea)을 4마리씩 polycarbonate 사육상자에 수용하여 온도(20~25℃)와 습도(40~45％)를 조절한 사육실에서 15일 동안의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였다. 명암 주기는 12시간 주기로 조절하였고, 사료(Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였다.
- 명암 주기는 12시간 주기로 조절하였고, 사료(Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 순화과정 후 체중(Average : 285.60±11.85 g)이 일정한 실험동물을 선별한 후 군당 8마리씩, 총 6개군으로 구분하여 실험에 사용하였다.
- 약재는 대원약업사(Daegu, Korea)에서 매입한 것으로 관능검사를 통하여 선정하여 사용하였으며, 본 실험에 사용된 益氣補血湯의 처방 구성은 대구한의대학교 원내처방집9)을 기준으로 하였다(Table 1). 선정된 약제 10첩 분량(804.
데이터처리
- PTU 유발 갑상선기능저하증에 대한 YKBHT 또는 LT4의 유효한 효과를 보다 명확히 하기 위하여, YKBHT 또는 LT4 투여군과 PTU 대조군과의 percent change를 다음의 공식 [2]를 이용하여 측정하였다
- 등분산일 경우에는 one way ANOVA test를 실시한 다음, 유의성이 인정된 경우에는 LSD test로 사후 검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였고, 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시한 다음, 유의성이 인정된 경우에 는 Mann-Whitney U test로 사후 검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였다
- 또한 PTU에 의한 갑상선기능저하증 및 관련 간 및 생식기 장애의 유발 정도를 보다 명확히 하기 위해 정상 대조군과 PTU 대조군과의 percent change를 다음의 공식 [3]을 이용하여 각각 측정하였다.
- 모든 수치는 다중비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였으며, Levene test를 실시하여 분산동질성을 검증하였다23)
이론/모형
- Mogulkoç 등10-2)의 방법에 따라 50 mg의 PTU(Sigma, St. Louise, MO, USA)를 10 ml 멸균 생리식염수에 용해시킨 후 kg 당 2 ml의 용량으로 매일 1회씩, 28일간 등쪽의 경부 피하에 주사하여 갑상선기능저하증을 유발하였다.
- 0, 온도 25℃하에서 1 μmol의 H2O2를 분해하는데 필요한 catalase를 1 unit(U)으로 정의하여 U/mg protein의 단위로 catalae의 활성을 평가하였다. SOD 활성은 Nishikimi 등19)의 nicotinamide adenine dinucleotide (reduced)-phenazine methosulphate-nitroblue-tetrazolium 억제 반응을 변형시킨 Kakkar 등20)의 방법을 이용하여 평가하였다. SOD 1 unit는 상온(25±2℃)에서 1분 동안 formazan 형성을 50％ 억제하는 농도로 정의하여, U/mg protein 단위로 측정하였다.
- 또한 Ku and Lee10)의 방법에 따라 세포 절단한 갑상선 전체 두께(μm/central regions) 및 평균 갑상선 여포 직경(μm/follicle)을 각각 automated image analysis process(iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Quebec, Canada)를 이용하여 측정하였다
- 4)을 이용하여 homogenize 한 다음 800× g으로 10분간 원심분리하여 상층액을 분리하고, 다시 12,000× g으로 15분간 원심분리하여 mitochondrial fraction을 준비하였다. 이후 단백질 함량은 Lowry 등15)의 방법으로 bovine serum albumin을 standard로 이용하여 측정하였다. 지질 과산화 정도(lipid peroxidation)는 Jamall과 Smith16)의 방법으로 2-thiobarbituric acid를 이용하여 흡광도 525 nm에서 측정하여 malondialdehyde(MDA) nM/mg protein 단위로 측정하였다.
- 이후 단백질 함량은 Lowry 등15)의 방법으로 bovine serum albumin을 standard로 이용하여 측정하였다. 지질 과산화 정도(lipid peroxidation)는 Jamall과 Smith16)의 방법으로 2-thiobarbituric acid를 이용하여 흡광도 525 nm에서 측정하여 malondialdehyde(MDA) nM/mg protein 단위로 측정하였다. 또한 H2O2 함량은 Pick과 Keisari17) 방법에 따라 horseradish peroxidase(Sigma, St.
- 최종 희생일에 모든 실험동물의 좌측 갑상선, 간, 고환 및 부고환, 전립선을 적출·분리하여 중량을 측정한 것을 절대중량(absolute wet-weight)으로 하였으며, 체중의 변화에 수반되는 이차적인 변화를 최소화하기 위해 체중에 대한 절대중량의 비율인 상대중량을 다음의 공식 [1]를 이용하여 각각 산출하였다.
성능/효과
- LT4 투여군은 이전의 방법10,11)에 따라 2.5 mg의 LT4를 10 ml의 멸균 생리식염수에 용해시켜, kg 당 2 ml의 용량으로 PTU 투여 시작일로부터 28일 동안 매일 복강 주사하였다. 한편 정상 및 PTU 대조군에서는 동일한 용량의 멸균 증류수를 YKBHT 투여군과 동일한 기간 동안 경구 투여하였다.
- 최종 희생일에 좌측 갑상선, 간, 고환 및 부고환, 전립선 조직을 적출한 다음 세포로 절단하였다. 10％ 중성포르말린에 18시간 이상 고정시킨 후 탈수를 거쳐 파라핀 포매를 한 뒤 3 μm의 조직 절편을 제작하여 H&E 염색을 실시한 것을 광학현미경으로 관찰하였다. 또한 Ku and Lee10)의 방법에 따라 세포 절단한 갑상선 전체 두께(μm/central regions) 및 평균 갑상선 여포 직경(μm/follicle)을 각각 automated image analysis process(iSolution FL ver 9.
- 4
- 최종 희생일에 모든 실험동물을 18시간 이상 절식한 후 대정맥에서 각각 6 ml의 혈액을 채취하였고, 상온에서 1시간 정도 방치한 다음 3,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 분리하였으며, 분석 전까지 −150℃의 초저온냉장고(Deep freezer; Sanyo, Tokyo, Japan)에 보관하였다.
- 7. 간의 항산화 system의 변화는 LT4 및 YKBHT 투여군에서 PTU 대조군에 비해 용량 순으로 간 CAT 활성 증가가 유의하게 나타났고, 용량 순으로 간 H2O2 함량 및 SOD 활성 감소가 유의하게 나타났다. 고환의 항산화 system의 변화는 YKBHT 투여군에서 용량 순으로 고환 SOD와 CAT 활성의 증가와 고환 H2O2 함량의 감소가 각각 유의하게 나타났다.
- 간의 항산화 system의 변화는 LT4 및 YKBHT 투여군에서 PTU 대조군에 비해 용량 순으로 간 CAT 활성 증가가 유의하게 나타났고, 용량 순으로 간 H2O2 함량 및 SOD 활성 감소가 유의하게 나타났다. 고환의 항산화 system의 변화는 YKBHT 투여군에서 용량 순으로 고환 SOD와 CAT 활성의 증가와 고환 H2O2 함량의 감소가 각각 유의하게 나타났다.
- 따라서 YKBHT은 PTU에 의한 갑상선의 변화를 직접적으로 억제하는 것으로 판단된다. 그러므로 YKBHT은 LT4와는 달리 단순히 감소된 T4의 보충뿐만 아니라 본 실험에서 확인된 항산화 방어 시스템의 활성을 통해 갑상선 여포세포의 변화를 억제하여 갑상선기능저하증에 유효한 효과를 나타내는 것으로 판단되나 정확한 기전을 알 수는 없었다.
- 한편 LT4 투여에 의해 TSH의 함량 감소와 T4의 함량 증가는 인정되었으나 T3의 농도에는 별다른 영향을 미치지 않은 반면, YKBHT 투여군에서는 용량 순으로 TSH의 감소와 T4의 증가가 각각 인정되었고, T3 역시 유의성 있게 증가되었다. 또한 PTU 대조군에서 현저한 갑상선 중량의 증가를 보였는데 조직병리학적인 소견으로는 갑상선 전체 두께가 유의하게 증가하였고, 평균 갑상선 여포 직경이 유의하게 감소되었다. 한편 이러한 갑상선 중량 및 비활동성 갑상선 종대의 조직병리학적 변화가 세 용량의 YKBHT 투여에 의해 용량 순으로 억제되었다.
- 조직병리학적 변화는 YKBHT 투여군에서 PTU 대조군에 비해 갑상선 전체 두께의 감소와 평균 갑상선 여포 직경의 증가, 부고환 두부 평균 직경의 증가와 부고환 도관 비율의 감소가 각각 유의하게 나타났다. 또한 용량 순으로 단위 면적당 간세포 수의 증가, 정세관 평균 직경 증가 및 stage I~Ⅱ 정세관 비율 증가, 전립선 도관 상피의 평균 두께 증가 및 위축 도관 비율의 감소가 각각 유의하게 나타났다.
- 일반적으로 갑상선기능저하증이 생겼을 경우에 체중의 증가가 일어나게 되지만 이때 체중의 증가를 보상하기 위한 기전으로 leptin의 분비가 증가하게 되면 오히려 체중의 감소가 유발될 수도 있다30,31). 본 실험 결과에서도 PTU 대조군에서 4주간의 PTU 투여기간 및 6주간의 실험 전 기간 동안의 체중 증가량이 정상 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 한편 이러한 PTU 대조군의 체중 및 체중 증가량의 감소가 LT4 및 세 용량의 YKBHT 투여군에 의해 현저히 억제되어 YKBHT은 PTU 투여로 인한 갑상선기능저하증시 유발되는 체중의 감소를 매우 효과적으로 억제하는 것으로 판단된다.
- 갑상선기능저하증에서 일반적으로 나타나는 지질 단백질의 이상은 total cholesterol 및 LDL 함량의 증가이며, LT4의 투여로 현저히 억제되는 것으로 알려져 있다33). 본 실험에서 PTU 투여로 인한 혈청 중 total cholesterol 및 LDL의 변화가 의미있는 것으로 인정되지 않았으나 HDL의 증가와 triglyceride의 감소는 유의성 있는 변화를 보였다. 이는 갑상선기능저하증에 있어 사람의 일반적인 지질 대사와는 반대의 결과로서 갑상선 호르몬이 지질 대사에 있어서 종 간의 차이를 보인다32)는 것을 알 수 있다.
- 현재 남성 불임의 중요한 인자 중 하나가 고환의 산화적 stress로 알려져 있으며36), 갑상선의 상태에 따라 정자의 수적 변화가 초래되는 것으로 알려져 있다37). 본 실험에서 YKBHT은 고환 내 항산화 system의 변화를 현저히 억제하여 PTU 유발로 인한 갑상선기능저하증에서 초래되는 생식기 장애를 억제하는 것으로 판단된다. 한편 LT4 투여군에서는 이전의 보고38)와 유사하게 항산화 방어 system 약화로 인한 생식기 장애의 악화가 인정되었다.
- 갑상선기능저하증에서 혈청 내 효소인 AST와 ALT의 상승이 관찰되며10,11,21), PTU를 투여한 갑상선기능항진증 환자의 30％에서도 이들 효소의 증가가 나타난다34). 본 실험에서 간 중량의 감소, 혈청 중 AST의 증가, 간세포의 지방소적 침윤으로 인한 비대와 그에 따른 단위 면적당 간세포의 수적 감소가 PTU 투여에 의해 유발되었으며, ALT의 증가는 인정되지 않았다. LT4 및 YKBHT 투여군에서는 이러한 PTU 투여에 의한 간 손상이 현저히 억제되었다.
- 고환은 갑상선기능저하증에서 현저한 위축과 함께 남성 호르몬인 testosterone 및 DHT의 감소와 FSH의 증가가 수반된다35). 본 실험의 결과에서도 PTU 투여에 의해 고환, 부고환 및 전립선 중량 감소, 남성 호르몬의 함량 감소, 부고환 위축과 정자 감소증을 나타내는 부고환 도관의 수적 증가, 고환 정세관의 위축 및 성숙 정자를 함유한 stage I~Ⅱ 정세관 비율의 감소, 전립선 도관의 현저한 위축이 조직병리학적으로 인정되었다. LT4 투여군에서는 평균 정세관 직경과 stage I~Ⅱ 정세관 비율의 감소를 나타내었고, 부고환 도관 비율과 부고환 두부 평균 직경이 유의하게 증가하였으며, 전립선 도관 상피의 평균두께 위축 및 도관 비율의 증가하였고, 혈청 중 남성 호르몬의 감소가 유의하게 인정되어 LT4 투여로 인한 생식기 손상을 확인하였다.
- 갑상선기능저하증 상태에서는 기초 대사량이 감소하고, 세포 호흡이 억제되며, MDA가 억제되고, SOD의 경미한 증가와 함께 CAT의 현저한 감소가 발생하게 되며, H2O2가 간 조직 내 축적 되는 등 신체 항산화 system의 변화가 초래되는 것으로 알려져 있다14). 본 실험의 결과에서도 이전의 연구들10,11,21)과 유사하게 PTU 투여로 인해 MDA가 경미한 감소를 보였고, 대표적인 내인성 항산화 효소인 SOD 활성이 유의한 증가를 보였다. 또한 CAT의 현저한 감소로 인해 대표적인 세포호흡성 산화물질로 알려져 있는 H2O2가 증가하는 결과를 나타내었다.
- LT4 투여군에서는 PTU 대조군에 비해 유의성 있는 혈청 중 HDL의 함량 감소와 triglyceride 함량의 증가가 각각 인정되었다. 세 용량의 YKBHT 투여군에서도 PTU 대조군에 비해 혈청 중 HDL의 함량 감소와 triglyceride 함량의 증가가 인정되었는데 이것은 YKBHT이 PTU로 유발된 지질 대사 장애를 갑상선 호르몬의 함량을 증가시킴으로써 호전된 것으로 생각된다.
- 이상에서 YKBHT의 경구투여는 PTU로 유발된 갑상선기능저하증으로 초래되는 체중의 감소, 갑상선 종대, 갑상선 및 성 호르몬의 감소, 혈청 중 지질 함량의 변화 및 간과 생식기 손상을 용량 순으로 억제하였고, 갑상선기능저하증시 초래되는 항산화 system의 변화 역시 용량 순으로 억제하였다. 또한 LT4 투여 이후 보였던 생식기 장애의 악화가 YKBHT에서는 보이지 않았다.
- 2. 장기의 중량 변화는 YKBHT 투여군에서 PTU 대조군에 비해 갑상선, 간, 고환, 부고환 및 전립선 등의 절대 및 상대 중량이 용량 순으로 각각 유의하게 증가하였다.
- 8. 조직병리학적 변화는 YKBHT 투여군에서 PTU 대조군에 비해 갑상선 전체 두께의 감소와 평균 갑상선 여포 직경의 증가, 부고환 두부 평균 직경의 증가와 부고환 도관 비율의 감소가 각각 유의하게 나타났다. 또한 용량 순으로 단위 면적당 간세포 수의 증가, 정세관 평균 직경 증가 및 stage I~Ⅱ 정세관 비율 증가, 전립선 도관 상피의 평균 두께 증가 및 위축 도관 비율의 감소가 각각 유의하게 나타났다.
- 1. 체중의 변화는 LT4 및 YKBHT 투여군에서 PTU 대조군에 비해 PTU 투여기간 및 실험 전 기간 동안 체중 증가량이 유의하게 증가하였다.
- 6. 혈청 중 AST 및 ALT 함량은 LT4 및 YKBHT 투여군에서 PTU 대조군에 비해 AST의 증가가 용량 순으로 유의하게 억제되었다.
- 3. 혈청 중 갑상선 호르몬은 YKBHT 투여군에서 PTU 대조군에 비해 용량 순으로 T3 및 T4 함량의 증가, TSH 함량의 감소가 각각 유의하게 나타났다.
- 4. 혈청 중 성 호르몬은 YKBHT 투여군에서 PTU 대조군에 비해 testosterone 및 DHT 함량의 증가, FSH 함량 감소가 용량 순으로 유의하게 나타났다.
- 5. 혈청 중 지질 함량은 LT4 및 YKBHT 투여군에서 PTU 대조군에 비해 HDL의 감소 및 triglyceride 함량의 증가가용량 순으로 유의하게 나타났다.
후속연구
- 또한 LT4 투여 이후 보였던 생식기 장애의 악화가 YKBHT에서는 보이지 않았다. 따라서 益氣補血湯이 갑상선기능저하증에 매우 유효한 효과를 나타낼 뿐만 아니라 생식기 장애를 일으키는 LT4를 대체할 수 있을 것으로 기대된다. 향후 YKBHT의 효능에 대한 임상 연구를 병행하며 구성 개별 약재의 효능 검색과 더불어 다양한 방면의 기전적인 연구를 더 수행해야 할 것으로 사료된다.
- 따라서 益氣補血湯이 갑상선기능저하증에 매우 유효한 효과를 나타낼 뿐만 아니라 생식기 장애를 일으키는 LT4를 대체할 수 있을 것으로 기대된다. 향후 YKBHT의 효능에 대한 임상 연구를 병행하며 구성 개별 약재의 효능 검색과 더불어 다양한 방면의 기전적인 연구를 더 수행해야 할 것으로 사료된다.
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