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문제 정의
- , 1995) 대체 약제의 개발이 시급한 상황이다. 본 연구는 파밤나방이 벡큘로바이러스에 대해서 비교적 감수성이라는 보고에 바탕을 두고 이 바이러스의 살충력을 증가시키는 전략에 기초하여 재조합 벡큘로바이러스 개발에 역점을 두었다. 이를 위해 파밤나방 자체가 바이러스에 대한 면역력을 억제하여 벡큘로바이러스의 살충력을 증가시키는 전략을 세웠다.
- 곤충의 면역력을 억제하는 인자들 가운데 PDV는 가장 잘 알려져 있으며, 이는 이 바이러스의 유전자가 대부분 나비목 유충의 세포성 및 체액성 면역을 억제하는 것으로 알려졌기 때문이다 (Strand, 2010). 본 연구에서는 국내 자생하는 프루텔고치벌에서 유래한 CpBV 유전체를 통해 얻은 CpBV-ELP1 유전자를 재조합 벡큘로바이러스 제작에 이용하여 해충 방제에 응용하려 시도되었다. 이는 기존의 연구에서 CpBV-ELP1과 재조합된 벡큘로바이러스가 다른 CpBV 유래 유전자들의 재조합 벡큘로바이러스들 보다 높은 살충력을 지니기 때문에(Kim et al.
- 또한 이 재조합바이러스에 대한 다양한 유충 영기별 감수성 분석이 필요하였다. 이를 수행하기 위해 본 연구는 CpBV-ELP1의 재조합 벡큘로바이러스를 파밤나방(Spodoptera exigua)에서 대량증식하였고, 이를 통해 얻은 재조합 벡큘로바이러스에 대해서 파밤나방의 영기별 감수성 및 포트 조건에서 바이러스 현탁액을 살포하면서 해충 방제 제로 개발 가능성을 분석하였다.
제안 방법
- AcMNPV-ELP1 현탁액(5 × 106 PIB/mL)을 파밤나방 유충영기별(1령-5령)로 처리하였다.
- AcMNPV-ELP1 현탁액을 살포에 따른 파밤나방 방제 효과를 분석했다(Fig. 2). AcMNPV는 대조 바이러스인 AcMNPVEGFP에 비해 높은 살충력을 나타냈고, 처리 농도가 높아짐에 따라 방제 효과도 높아졌다.
- PIB/mL)을 파밤나방 유충영기별(1령-5령)로 처리하였다. 각 유충령은 10마리씩 3반복으로 분석되었다. 처리 방법은 상기의 바이러스 처리 방법으로 실시되었다.
- 이후 건전 배추잎을 제공하고 매 24시간 마다 치사된 개체를 조사하였다. 각 처리는 10마리씩 3반복으로 실시하였다. 이때 치사 유충은 외부 자극에 대해서 능동적 반응 움직임이 없는 개체로 규정하였다.
- 각 포트(30 × 60 cm)에 배추(높이 약 20 cm) 4포기를 키웠다.
- 곤충 체내에서 재조합 벡큘로바이러스를 대량 증식하기 위해, Sf9 세포주에서 증식된 출아형 벡큘로바이러스를 파밤나방 5령 유충 혈강에 주입하였다. 주입 후 3-5일 경과 후 치사된 개체를 모아서 알칼리 용액으로 용해시킨 후 바이러스 순화를 실시하였다.
- 이 상등액은 다시 새로운 세포를 감염시키는 데 사용하였다. 다각체 바이러스 밀도는 위상차현미경(S730, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 검경하고, 세포계수기 (Marienfeld, Germany)를 이용하여 계수하였다.
- 살충효과는 처리 후 7일째 사망율로 비교하였다. 대조구 바이러스 처리는 AcMNPV-EGFP를 같은 농도로 처리하였다.
- 4). 대조구로서 AcMNPVEGFP 처리와 화학 농약인 테부페노자이드를 병행하여 처리 하였다. 처리 후 3일 및 7일 후에 각각 조사하여 AcMNPVELP1의 방제 속도도 분석하였다.
- 두 대조구로서 같은 농도의 AcMNPV-EGFP 처리와 화학 농약인 테부페노자이드(8% active ingredient, 미믹®, 경농, 서울, 한국) 1,000 ppm을 각각 살포하였다.
- 미량주사위(Hamilton microsyringe, Reno, Nevada, USA)를 이용하여 유충 혈강으로 출아형 재조합바이러스를 연구 목적에 맞도록 각 pfu 농도를 1 μL 부피로 주입하였다.
- 배추좀나방 4령충과 파밤나방 5령충에 대해 재조합바이러스의; 살충력을 검정하였다. Sf9 세포주에서 증식된 다각 체형 바이러스를 3 × 3 cm의 배추 잎 조각에 처리하였다.
- 처리 방법은 상기의 바이러스 처리 방법으로 실시되었다. 살충효과는 처리 후 7일째 사망율로 비교하였다. 대조구 바이러스 처리는 AcMNPV-EGFP를 같은 농도로 처리하였다.
- , 1991)를 먹이로 제공 하였고, 성충은 10%의 설탕물을 제공하여 사육하였다. 상기의 사육 조건에서 배추좀나방 유충은 배추를 먹이로 제공하였고, 성충은 10% 설탕물을 제공하여 사육하였다.
- 각 처리는 3반복(=포트)으로 실시되었다. 생존수는 처리 후 3일 및 7일 후에 각각 조사하여 대조구 대비 방제가를 산출 하였다.
- 본 연구는 파밤나방이 벡큘로바이러스에 대해서 비교적 감수성이라는 보고에 바탕을 두고 이 바이러스의 살충력을 증가시키는 전략에 기초하여 재조합 벡큘로바이러스 개발에 역점을 두었다. 이를 위해 파밤나방 자체가 바이러스에 대한 면역력을 억제하여 벡큘로바이러스의 살충력을 증가시키는 전략을 세웠다. 곤충의 면역력을 억제하는 인자들 가운데 PDV는 가장 잘 알려져 있으며, 이는 이 바이러스의 유전자가 대부분 나비목 유충의 세포성 및 체액성 면역을 억제하는 것으로 알려졌기 때문이다 (Strand, 2010).
- 그러나, 포장에서 이 재조합 벡큘로바이러스를 살포하여 파밤나방을 방제하기 위해서는 기존에 Sf9 세포주를 이용하여 이 바이러스를 생산하는 시스템으로는 다량으로 살포해야 하는 현실에 맞지 않았다. 이를 해결하기 위해 이 재조합 바이러스를 기주 충체에서 증식시켜 대량으로 바이러스를 생산하는 방식을 적용하였다. 본 연구는 파밤나방 5령 유충 개체 당 5 × 1010개 다각체를 형성하는 것으로 나타냈다.
- 처리된 배추잎 주변으로 6시간 절식된 유충을 옮겨 놓고 24시간섭식시켰다. 이후 건전 배추잎을 제공하고 매 24시간 마다 치사된 개체를 조사하였다. 각 처리는 10마리씩 3반복으로 실시하였다.
- 잎침지법에 따라 나타난 AcMNPV-ELP1의 방제 효과를 모든 파밤나방 유충 발육태에 처리하여 살충력을 비교하였다(Fig. 3). 대조구인 AcMNPV-EGFP는 유충 발육태가 증가할수록 방제 효율이 증가하였다.
- 곤충 체내에서 재조합 벡큘로바이러스를 대량 증식하기 위해, Sf9 세포주에서 증식된 출아형 벡큘로바이러스를 파밤나방 5령 유충 혈강에 주입하였다. 주입 후 3-5일 경과 후 치사된 개체를 모아서 알칼리 용액으로 용해시킨 후 바이러스 순화를 실시하였다. 순화된 바이러스 입자는 전형적인 벡큘로바이러스 다각체 구조를 보였다.
- 증식된 바이러스는 3,000 × g의 원심분리로 다각체형을 포함하는 Sf9 세포와 출아형이 포함된 상등액으로 나누었다.
- 각 유충령은 10마리씩 3반복으로 분석되었다. 처리 방법은 상기의 바이러스 처리 방법으로 실시되었다. 살충효과는 처리 후 7일째 사망율로 비교하였다.
- 대조구로서 AcMNPVEGFP 처리와 화학 농약인 테부페노자이드를 병행하여 처리 하였다. 처리 후 3일 및 7일 후에 각각 조사하여 AcMNPVELP1의 방제 속도도 분석하였다. 처리 3일 후에 AcMNPVELP1은 대조구인 AcMNPV-EGFP에 비해 높은 방제력을 나타내어 CpBV-ELP1 유전자에 의한 벡큘로바이러스 살충력 증가를 확인하였으나, 화학약제인 테부페노자이드에 비해서는 낮은 살충력을 나타냈다.
- 처리구는 곤충 체내에서 증식된 AcMNPV-ELP1을 5 × 106 PIB/mL의 농도로 살포하였다.
- (2008)에 기술하였다. 출아형(budded form) 바이러스를 107 plaque-froming unit(pfu)/mL의 농도로 Sf9 세포주에 접종하고, fetal bovine serum이 포함된 TC-100 곤충세포배양액에서 5일 동안 배양하여 출아형과 다각체형(polyhedrin inclusion body: PIB)으로 증식하였다. 증식된 바이러스는 3,000 × g의 원심분리로 다각체형을 포함하는 Sf9 세포와 출아형이 포함된 상등액으로 나누었다.
대상 데이터
- 각 포트(30 × 60 cm)에 배추(높이 약 20 cm) 4포기를 키웠다. 각 배추 포기에 파밤나방 3령충을 20마리 접종하였다. 처리구는 곤충 체내에서 증식된 AcMNPV-ELP1을 5 × 106 PIB/mL의 농도로 살포하였다.
- 본 실험에 사용된 파밤나방은 온도 25 ± 1ºC, 광조건 16:8시간(L:D), 상대습도 60 ± 10% 사육실에서 누대 사육하였다.
- 본 연구는 파밤나방 5령 유충 개체 당 5 × 1010개 다각체를 형성하는 것으로 나타냈다.
- 미량주사위(Hamilton microsyringe, Reno, Nevada, USA)를 이용하여 유충 혈강으로 출아형 재조합바이러스를 연구 목적에 맞도록 각 pfu 농도를 1 μL 부피로 주입하였다. 사용된 파밤나방은 5령충으로 복부 첫마디의 헛다리를 통해 바이러스를 주입하였다. 혈강주입 후 파밤나방은 먹이를 공급하고, 상기의 사육 조건에 바이러스 증식을 도모하였다.
- 본 실험에 사용된 파밤나방은 온도 25 ± 1ºC, 광조건 16:8시간(L:D), 상대습도 60 ± 10% 사육실에서 누대 사육하였다. 유충의 경우 인공사료(Goh et al., 1991)를 먹이로 제공 하였고, 성충은 10%의 설탕물을 제공하여 사육하였다. 상기의 사육 조건에서 배추좀나방 유충은 배추를 먹이로 제공하였고, 성충은 10% 설탕물을 제공하여 사육하였다.
데이터처리
- 모든 살충효과 시험 결과는 백분율 자료로서 arcsine 변환 후 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석후 처리평균간 비교를 실시하였다.
이론/모형
- exigua. Leaf-dipping method was used to test insecticidal activity. As a control recombinant baculovirus, AcMNPV-EGFP, was used.
- 벡큘로바이러스 제작은 Kwon et al. (2008)에 기술하였다. 출아형(budded form) 바이러스를 107 plaque-froming unit(pfu)/mL의 농도로 Sf9 세포주에 접종하고, fetal bovine serum이 포함된 TC-100 곤충세포배양액에서 5일 동안 배양하여 출아형과 다각체형(polyhedrin inclusion body: PIB)으로 증식하였다.
성능/효과
- 2). AcMNPV는 대조 바이러스인 AcMNPVEGFP에 비해 높은 살충력을 나타냈고, 처리 농도가 높아짐에 따라 방제 효과도 높아졌다.
- 1A) 모든 재조합 벡큘로바이러스는 배추좀나방과 파밤나방에 살충력을 나타냈다. 그러나 대상 기주에 따라 이들 살충력을 차이를 보여 파밤나방이 배추좀나방에 비해 높은 감수성을 나타냈다. 특히 파밤나방에서 이들 재조합 유전자에 따라 벡큘로바이러스의 살충력에 변이를 나타내어, ELP1 유전자가 재조합된 벡큘로바이러스(AcMNPV-ELP1)가 비교적 우수한 방제력을 나타냈다.
- 처리 3일 후에 AcMNPVELP1은 대조구인 AcMNPV-EGFP에 비해 높은 방제력을 나타내어 CpBV-ELP1 유전자에 의한 벡큘로바이러스 살충력 증가를 확인하였으나, 화학약제인 테부페노자이드에 비해서는 낮은 살충력을 나타냈다. 그러나 처리 7일 후에는 AcMNPV-ELP1의 처리가 대조구 재조합바이러스는 물론이고 화학농약인 테부페노자이드에 비해서도 높은 살충 효율을 나타냈다.
- 3). 대조구인 AcMNPV-EGFP는 유충 발육태가 증가할수록 방제 효율이 증가하였다. 처리구인 AcMNPVELP1도 비교적 높은 방제력이 노숙 유충(4-5령)에서 나타나지만, 대조구와 달리 1령충에 대해서 가장 높은 살충력을 보였다.
- 선발된 AcMNPV-ELP1을 살포액으로 제조하여 배추를 가해하는 파밤나방 유충에 처리한 결과 대조구 바이러스에 비해 살충력이 뚜렷이 높아지는 실내 검정 결과를 재확인시켜 주었다. 더욱이 이 재조합 벡큘로바이러스는 비록 3일차에서는 화학농약인 테부페노자이드에 비해 낮은 살충력을보였으나, 처리 7일이 경과하면서 화학농약에 비해 월등히 높은 살충력을 나타냈다. 파밤나방 방제 적용약제인 테부페노자이드는 곤충 탈피호르몬인 엑다이손의 동력제로서 처리 해충의 탈피를 과도하게 촉진시켜 살충력을 발휘하는 곤충 성장조절제 화학 농약이다(Wing et al.
- 이는 기존의 연구에서 밝혀진 CpBV-ELP1의 높은 세포독성에 기인된다(Kwon and Kim, 2008). 본 연구 결과는 특별히 1령 유충이 이러한 세포독성에 매우 감수성이 높은 것으로 해석된다.
- 본 연구는 CpBV-ELP1을 재조합 벡큘로바이러스의 곤충기주를 이용한 대량 생산이 살충력에 보전에 큰 변수가 되지 않았다는 것을 밝혔다. 또한 화학농약에 감수성이 저하된 파밤나방의 경우에도 이 재조합 벡큘로바이러스의 높은 살충력을 유지한다는 것을 의미하고 있다.
- , 2004). 본 연구에서는 AcMNPV-ELP1이 노숙 유충은 물론이고 1령충에서 높은 방제효율을 나타냈다. 파밤나방 노숙 유충에 대한 AcMNPVELP1의 높은 살충력은 대조 바이러스와 마찬가지로 어린 유충 시기에 비해 섭식량이 많아 이에 따라 체내로 들어온 바이러스 함량의 증가에 기인된 것으로 사료된다.
- , 2008). 본 연구에서는 테부페노자이드 추천농도 처리에서 파밤나방이 불과 71.5%의 방제효과를 나타냈다. 이는 본 연구에 사용된 파밤나방이 테부페노자이드에 대해서 감수성 저하를 보였다고 해석된다.
- 선발된 AcMNPV-ELP1을 살포액으로 제조하여 배추를 가해하는 파밤나방 유충에 처리한 결과 대조구 바이러스에 비해 살충력이 뚜렷이 높아지는 실내 검정 결과를 재확인시켜 주었다. 더욱이 이 재조합 벡큘로바이러스는 비록 3일차에서는 화학농약인 테부페노자이드에 비해 낮은 살충력을보였으나, 처리 7일이 경과하면서 화학농약에 비해 월등히 높은 살충력을 나타냈다.
- 따라서 이들 유전자들이 모두 곤충의 면역을 억제하고 이를 통해 벡큘로바이러스의 병원력을 상승시킨 것으로 해석된다. 이 가운데 CpBV-ELP1이 재조합된 벡큘로바이러스가 가장 높은 병원력 상승을 유도하였다. 이는 기존의 Kim et al.
- 이들 고리게놈을 각각 클로닝하여 배추좀나방 유충에 삽입하여 일시발현을 일으킨 후 특정 유전자의 RNA 간섭(RNA interference: RNAi)을 일으켜 이 유전자의 기능을 추정하는 과정이 SERI 기술이다. 이 기술을 통해 CpBV 유전자들의 기능을 추정한 결과 대부분 기주 면역을 억제하는 기능을 보였다. 이 가운데 CpBV-ELP1은 Cotesia 속에 속한 BV 바이러스들이 공통적으로 가지고 있는 EP1 유전자와 높은 상동성을 가지며, 세포독성을 지니는 것으로 추정되었다(Kwon and Kim, 2008).
- 처리 후 3일 및 7일 후에 각각 조사하여 AcMNPVELP1의 방제 속도도 분석하였다. 처리 3일 후에 AcMNPVELP1은 대조구인 AcMNPV-EGFP에 비해 높은 방제력을 나타내어 CpBV-ELP1 유전자에 의한 벡큘로바이러스 살충력 증가를 확인하였으나, 화학약제인 테부페노자이드에 비해서는 낮은 살충력을 나타냈다. 그러나 처리 7일 후에는 AcMNPV-ELP1의 처리가 대조구 재조합바이러스는 물론이고 화학농약인 테부페노자이드에 비해서도 높은 살충 효율을 나타냈다.
- 대조구인 AcMNPV-EGFP는 유충 발육태가 증가할수록 방제 효율이 증가하였다. 처리구인 AcMNPVELP1도 비교적 높은 방제력이 노숙 유충(4-5령)에서 나타나지만, 대조구와 달리 1령충에 대해서 가장 높은 살충력을 보였다.
- , 2008). 총 6종류의 CpBV 유래 유전자를 이용하여 재조합 벡큘로바이러스를 제작하였고, 이들의 살충력을 비교한 결과 CpBVELP1이 재조합된 벡큘로바이러스 가운데 가장 높은 살충력을 지니는 것으로 나타났다. 그러나 분석된 벡큘로바이러스는 Sf9 곤충 세포주를 이용하여 증식되었으나, 실용적으로 해충 방제에 사용하기 위해서는 기주 곤충에서 대량 증식이 필요했고, 이를 통해 얻은 바이러스의 살충력을 재검정할 필요가 있었다.
- 그러나 대상 기주에 따라 이들 살충력을 차이를 보여 파밤나방이 배추좀나방에 비해 높은 감수성을 나타냈다. 특히 파밤나방에서 이들 재조합 유전자에 따라 벡큘로바이러스의 살충력에 변이를 나타내어, ELP1 유전자가 재조합된 벡큘로바이러스(AcMNPV-ELP1)가 비교적 우수한 방제력을 나타냈다. 파밤나방에 대한 AcMNPV-ELP1의 높은 감수성은 혈강으로 주입한 출아형 벡큘로바이러스에서도 유사하게 나타났다(Fig.
후속연구
- 총 6종류의 CpBV 유래 유전자를 이용하여 재조합 벡큘로바이러스를 제작하였고, 이들의 살충력을 비교한 결과 CpBVELP1이 재조합된 벡큘로바이러스 가운데 가장 높은 살충력을 지니는 것으로 나타났다. 그러나 분석된 벡큘로바이러스는 Sf9 곤충 세포주를 이용하여 증식되었으나, 실용적으로 해충 방제에 사용하기 위해서는 기주 곤충에서 대량 증식이 필요했고, 이를 통해 얻은 바이러스의 살충력을 재검정할 필요가 있었다. 또한 이 재조합바이러스에 대한 다양한 유충 영기별 감수성 분석이 필요하였다.
- 그러나 분석된 벡큘로바이러스는 Sf9 곤충 세포주를 이용하여 증식되었으나, 실용적으로 해충 방제에 사용하기 위해서는 기주 곤충에서 대량 증식이 필요했고, 이를 통해 얻은 바이러스의 살충력을 재검정할 필요가 있었다. 또한 이 재조합바이러스에 대한 다양한 유충 영기별 감수성 분석이 필요하였다. 이를 수행하기 위해 본 연구는 CpBV-ELP1의 재조합 벡큘로바이러스를 파밤나방(Spodoptera exigua)에서 대량증식하였고, 이를 통해 얻은 재조합 벡큘로바이러스에 대해서 파밤나방의 영기별 감수성 및 포트 조건에서 바이러스 현탁액을 살포하면서 해충 방제 제로 개발 가능성을 분석하였다.
- 또한 화학농약에 감수성이 저하된 파밤나방의 경우에도 이 재조합 벡큘로바이러스의 높은 살충력을 유지한다는 것을 의미하고 있다. 이상의 결과는 재조합 벡큘로바이러스가 다양한 화학농약에 저항성을 발휘 하여 방제 효율을 떨어뜨리는 파밤나방에 대해서 CpBVELP1으로 재조합된 벡큘로바이러스가 대체 방제제로 응용이 가능하다는 것을 제시하고 있다.
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