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문제 정의
- 본 연구에서는 하이드로겔 콘택트렌즈에 HA를 IPN과 CCB 방법으로 첨가하여 제조한 다음 함수율과 광투과율 등의 물리적인 특성과 lysozyme 흡착량을 비교하여 하이드로겔 콘택트렌즈의 기능성 부여를 위한 효과적인 HA의 첨가방법을 살펴보고자 한다.
제안 방법
- Hy-CL와 IPN, CCB 방법으로 HA를 첨가한 콘택트렌즈 5개씩을 lysozyme이 포함된 인공눈물에 충분히 잠길 수 있도록 넣어준 후 12시간동안 37°C를 유지하면서 150rpm으로 진탕회전(Shaking incubator, HB-201SF, Korea)시켜 렌즈에 lysozyme을 흡착시켰다.
- 건조 상태의 렌즈 5개를 선택하여 UV-Visible Spectro-photometer(GENOVA NANO, GENWAY, UK)를 이용하여 300 nm에서 800 nm까지의 파장 범위에서 각각의 렌즈에 대해 3번씩 측정한 후 평균하여 사용하였다.
- 고분자인 HA의 특성상 다른 단량체와 잘 섞이지 않고 상분리를 일으키기 때문에 이를 방지하기 위해 두 가지의 HA 첨가 방법을 사용하였다.
- 하이드로겔 콘택트렌즈 제조를 위해 HEMA(2-Hydroxyethyl methacrylate, Junsei, Japan), NVP (N-vinyl pyrrolidone, Junsei, Japan), GMMA (glycerol monomethacrylate, Melrob, UK), 중합개시제인 AIBN (azobis isobutyronitrile, Junsei, Japan)과 가교제인 EGDMA (ethylene glycol dimethacrylate, Sigma Aldrich, USA)가 사용되었다. 렌즈에 기능성을 부여하기 위해 HA (hyaluronic acid, molecular weight 10 kDa, Life Core Biomedical, USA)를 사용하였다. IPN 방법을 위해 PEI (Polyethylenimine, Sigma Aldrich, USA)와 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, Sigma Aldrich, USA)를 사용하였고 CCB 방법을 위한 중합기 부착에 Methacrylic anhydride(Sigma Aldrich, USA)가 사용되었다.
- HA 용액을 2% w/v가 되게 증류수에 녹인 뒤, HA에methacrylic anhydride를 첨가하고, pH 8을 유지시키면서 5oC에서 2일간 교반시켰다. 반응 종료 후 원심분리를 통해 얻어진 침전물을 증류수와 알코올로 반복적으로 세척하며 과량의 methacrylic anhydride 및 methacrylic acid를 제거한 후 동결 건조시켰다. 하이드로겔 콘택트렌즈 제조에 필요한 모노머들과 일정 비율의 건조된 HA를 혼합하여 교반시킨 후 혼합된 모노머를 몰드에 주입하였다.
- 본 연구에서는 하이드로겔 콘택트렌즈에 IPN, CCB 방법으로 HA를 첨가한 다음 함수율, 광투과율, lysozyme 흡착량을 비교하여 보았다. HA를 첨가하기 전에 비해 HA를 첨가한 후 함수율이 증가하였고, lysozyme 흡착량은 감소하였으나 광투과율은 차이가 없었다.
- 실험실에서 제조된 하이드로겔 콘택트렌즈(Hy-CL;hydrogel contact lens)를 HA(5 g/L) 용액과 PEI (0.5 g/L,in 30% ethanol/70% water)를 섞은 용액에 4일 동안 4°C에서 수화시킨 후 amide 결합으로 가교시키기 위해 EDC (5 g/L, 30% ethanol in water) 수용액에서 4°C에서 48시간 동안 유지하였다.
- 제조된 10개의 콘택트렌즈 샘플을 0.9% NaCl 생리 식염수에 24시간 동안 수화시켜 측정한 무게와 90°C drying oven에서 1시간 동안 건조시킨 렌즈의 무게를 비교하는 중량측정법으로 함수율을 측정하였다.
- 콘택트렌즈에 사용되는 단량체에 상분리 없이 HA를 첨가하기 위해 methacrylate가 결합된 HA를 합성하였다. HA 용액을 2% w/v가 되게 증류수에 녹인 뒤, HA에methacrylic anhydride를 첨가하고, pH 8을 유지시키면서 5oC에서 2일간 교반시켰다.
- 콘택트렌즈의 lysozyme 흡착 특성을 비교하기 위해 인체의 눈물과 비슷한 조성의 인공눈물을 제조하였다. 인공눈물은 1.
- 콘택트렌즈의 제조는 cast mold 방식이 사용되었으며, 혼합된 모노머가 주입된 몰드는 90°C drying oven(HST-501S, Hanst,Korea)에서 6시간 동안 중합시킨 후 몰드에서 렌즈를 떼어내고 증류수에 2일 동안 담가 두었다.
- 하이드로겔 콘택트렌즈를 제조하기 위해 Table 2와 같이 HEMA, NVP, GMMA, AIBN과 EGDMA를 구성비에 따라 혼합한 후 교반기(MS-2026, MISUNG S&I, Korea)를 이용하여 1시간 동안 상온에서 교반하였다.
대상 데이터
- HA 첨가 방법에 따른 렌즈의 변화를 알아보기 위해 실험실에서 제조한 렌즈를 사용하였으며, 사용된 렌즈의 시료명과 구성된 모노머(monomer)를 Table 1에 나타내었다.
- 렌즈에 기능성을 부여하기 위해 HA (hyaluronic acid, molecular weight 10 kDa, Life Core Biomedical, USA)를 사용하였다. IPN 방법을 위해 PEI (Polyethylenimine, Sigma Aldrich, USA)와 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, Sigma Aldrich, USA)를 사용하였고 CCB 방법을 위한 중합기 부착에 Methacrylic anhydride(Sigma Aldrich, USA)가 사용되었다. 인공눈물 제조를 위해 lysozyme(chicken egg lysozyme,≥90%, Sigma Aldrich, USA)이 사용되었다.
- 인공눈물 제조를 위해 lysozyme(chicken egg lysozyme,≥90%, Sigma Aldrich, USA)이 사용되었다.
- 하이드로겔 콘택트렌즈 제조를 위해 HEMA(2-Hydroxyethyl methacrylate, Junsei, Japan), NVP (N-vinyl pyrrolidone, Junsei, Japan), GMMA (glycerol monomethacrylate, Melrob, UK), 중합개시제인 AIBN (azobis isobutyronitrile, Junsei, Japan)과 가교제인 EGDMA (ethylene glycol dimethacrylate, Sigma Aldrich, USA)가 사용되었다. 렌즈에 기능성을 부여하기 위해 HA (hyaluronic acid, molecular weight 10 kDa, Life Core Biomedical, USA)를 사용하였다.
데이터처리
- 9% NaCl 생리 식염수에 24시간 동안 수화시켜 측정한 무게와 90°C drying oven에서 1시간 동안 건조시킨 렌즈의 무게를 비교하는 중량측정법으로 함수율을 측정하였다. 각각의 렌즈에 대해 3회 측정 후 평균값을 사용하였다.
이론/모형
- Hy-CL와 IPN, CCB 방법으로 HA를 첨가한 콘택트렌즈 5개씩을 lysozyme이 포함된 인공눈물에 충분히 잠길 수 있도록 넣어준 후 12시간동안 37°C를 유지하면서 150rpm으로 진탕회전(Shaking incubator, HB-201SF, Korea)시켜 렌즈에 lysozyme을 흡착시켰다. 콘택트렌즈 표면에 흡착된 lysozyme의 추출은 Keith D. 등[18]의 방법에 따라 acetonitrile과 0.2%의 trifluoroacetic acid를 1:1로 혼합한 용액을 사용하였으며, 24시간동안 방치시켜 콘택트렌즈에 침착된 lysozyme을 추출하였다.
성능/효과
- 00%로 나타나 HA가 첨가된 렌즈에서 함수율이 증가하였으며 통계적으로 유의성을 보였다.(p=0.021) 첨가 방법에 따른 함수율은 IPN 방법에 의해 제조된 Hy-ipnHA 렌즈에서 약간 높게 나타났으며 통계적으로 유의성 유의성을 보였다(p=0.046). 렌즈의 함수율은 렌즈를 구성하는 모노머의 화학적 구조에 크게 의존하며, 특히 물분자와 수소결합이 가능한 하이드록실 그룹(OH, hydroxyl group)에의한 영향이 절대적이다.
- HA 첨가 방법에 따른 단백질 흡착량을 살펴보면 CCB 방법에 의해 제조된 렌즈에서보다 IPN 방법을 사용한 렌즈에서 단백질 흡착률 더 크게 감소하였다. 이는 작용기가 부착된 HA와 monomer들이 공중합하는 CCB 방법에서는 HA가 렌즈 전체에 고르게 분포되는 반면, IPN방법은 렌즈 표면에 HA를 침투-고정시켜 첨가하기 때문에 HA가 렌즈 표면에 많이 분포하게 되어 단백질 흡착 감소율이 더 크게 나타난 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 하이드로겔 콘택트렌즈에 IPN, CCB 방법으로 HA를 첨가한 다음 함수율, 광투과율, lysozyme 흡착량을 비교하여 보았다. HA를 첨가하기 전에 비해 HA를 첨가한 후 함수율이 증가하였고, lysozyme 흡착량은 감소하였으나 광투과율은 차이가 없었다. 비이온성-OH group을 가진 HA의 첨가로 인해 더 많은 물 분자와의 수소결합이 가능해졌으며, HA의 높은 수분보유력으로 인한 친수성의 증가로 함수율이 증가하였고, 표면에 덮여진 물 분자로 인해 단백질의 구조적 변화가 방지되어 단백질 흡착이 감소된 것으로 판단된다.
- 5에 나타내었다. UV spectrophotometer를 이용하여 300~800 nm 범위의 광투과율을 측정한 결과 모두 90% 이상으로 HA의 첨가 유무와 첨가 방법에 따른 차이가 거의 없는 것으로 나타났다. 두 가지의 HA 첨가방법 모두 HA와 콘택트렌즈 모노머와의 결합이상분리 없이 잘 이루어졌기 때문에 첨가 후에도 90%가 넘는 광투과율이 나타난 것으로 보인다.
- 4%의 lysozyme 흡착 감소율을 각각 나타내었다. 두 첨가 방법에 따른 차이는 IPN 방법으로 HA를 첨가하였을 때더 높은 감소율을 보였으나 통계적으로 유의성을 나타내진 않았다(p=0.209). Takanori 등[1]은 2-methacryloyloxyethylphosphorycholine(MPC)를 실리콘하이드로겔 렌즈에 본 연구와 동일한 방법으로 첨가하였을 때 단백질 흡착량이 감소되었다고 보고하였으며, Van Beek 등[14,20]은 pHEMA, 실리콘 하이드로겔과 같은 재질에 HA가 교차결합되면 단백질 침착이 감소되었다고 보고하였다.
- 비이온성-OH group을 가진 HA의 첨가로 인해 더 많은 물 분자와의 수소결합이 가능해졌으며, HA의 높은 수분보유력으로 인한 친수성의 증가로 함수율이 증가하였고, 표면에 덮여진 물 분자로 인해 단백질의 구조적 변화가 방지되어 단백질 흡착이 감소된 것으로 판단된다. 또한 CCB 방법에 비해 IPN 방법이 함수율 증가와 lysozyme 흡착 감소에 더 좋은 효과를 보였다. 이는 IPN방법이 콘택트렌즈의 표면에 많은 HA를 분포시키기 때문에 더 많은 수분을 끌어당길 수 있어 더 높은 lysozyme 흡착 감소율을 나타낸 것으로 여겨진다.
- [19] 김 등[12]의 연구에서 HA가 포함된 렌즈가 HA가 포함되지 않은 렌즈에 비해 표면 습윤성이 좋아 눈물층이 고르게 퍼지게 되어 눈물층의 안정성을 높여준다고 하였으며, Van Beek 등[14]의 연구에서는 HA를 첨가하였을 때 습윤각이 작아져 렌즈의 습윤성이 좋아지는 결과를 나타내었다고 하였다. 본 연구에서는 OH group이 포함된 NVP나 GMMA와 같은 친수성 단량체를 사용하여 Hy-CL를 제조하였기 때문에 50%가 넘는 높은 함수율을 가지며, 분자량의 1000배에 달하는 수분 흡수력을 가진[13] HA의 첨가로 인해 함수율이 증가한 것으로 생각된다. 또한 HA를 콘택트렌즈 표면과 내부에 화학적으로 고르게 분포시키는 공유결합에 비해 IPN 결합은 주로 렌즈 표면에 HA를 많이 분포시키기 때문에 함수율의 증가 효과가 높게 나타난 것으로 여겨진다.
- HA를 첨가하기 전에 비해 HA를 첨가한 후 함수율이 증가하였고, lysozyme 흡착량은 감소하였으나 광투과율은 차이가 없었다. 비이온성-OH group을 가진 HA의 첨가로 인해 더 많은 물 분자와의 수소결합이 가능해졌으며, HA의 높은 수분보유력으로 인한 친수성의 증가로 함수율이 증가하였고, 표면에 덮여진 물 분자로 인해 단백질의 구조적 변화가 방지되어 단백질 흡착이 감소된 것으로 판단된다. 또한 CCB 방법에 비해 IPN 방법이 함수율 증가와 lysozyme 흡착 감소에 더 좋은 효과를 보였다.
- 하이드로겔 콘택트렌즈(Hy-CL)의 함수율은 52.68±0.02%로 나타났으며, HA가 첨가된 하이드로겔 콘택트렌즈(Hy-ipnHA, Hy-ccb-HA)의 함수율은 60.88±0.01%와 57.60±0.00%로 나타나 HA가 첨가된 렌즈에서 함수율이 증가하였으며 통계적으로 유의성을 보였다.
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