[논문]목질섭식곤충의 장내 세균 다양성 분석 및 섬유소 분해균 탐색

최민영; 안재형; 송재경; 김성현; 배진우; 원항연

doi:10.7845/kjm.2015.5018

[국내논문] 목질섭식곤충의 장내 세균 다양성 분석 및 섬유소 분해균 탐색
Analysis of gut bacterial diversity and exploration of cellulose-degrading bacteria in xylophagous insects 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.51 no.3, 2015년, pp.209 - 220

최민영 (국립농업과학원 농업미생물과) , 안재형 (국립농업과학원 농업미생물과) , 송재경 (국립농업과학원 농업미생물과) , 김성현 (국립농업과학원 곤충산업과) , 배진우 (경희대학교 생물학과) , 원항연 (국립농업과학원 농업미생물과)

초록
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목질 섭식 곤충에 관한 장내 세균 군집의 연구를 이용한 lignocellulose의 분해는 생명 공학적 응용에 있어 큰 잠재력을 갖는다. 본 연구에서 목질 섭식 곤충의 장내 세균 군집은 16S rRNA 유전자를 기반으로 한 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 분석되었다. 분석된 모든 곤충에서 중장보다 후장에서 OTU수, 종 풍부도, 다양성 지수가 높았다. 세균 문 또는 강 수준의 다양성을 분석한 결과, 흰개미를 제외한 곤충의 장내 군집에는 Firmicutes, Bacteroidetes, ${\gamma}-Proteobacteria$가 우점하였다. PCoA (principal coordinates analysis)를 이용하여 세균의 군집 구조를 분석한 결과, 서식지보다는 곤충의 과별로 클러스터링 되는 경향이었다. CMC 분해 활성이 가장 높은 두 균주는 Bacillus toyonensis $BCT-7112^T$와 Lactococcus lactis subsp. hordniae $NCDO\;2181^T$과 유연관계가 높았다. 장 적출물의 섬유소 분해활성 실험 결과, 하늘소 후장에서 ${\beta}-1,4-glucosidase$, ${\beta}-1,4-endoglucanase$, ${\beta}-1,4-xylanase$의 효소활성이 가장 높았다. 본 연구에서는 목질 섭식 곤충의 장내에 다양하고 풍부한 세균이 서식하며, 섬유소를 분해하는 세균이 존재한다는 사실을 확인하였고, 이로부터 다양하고 유용한 섬유소 분해균을 분리할 수 있을 것으로 판단되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, gut bacterial communities in xylophagous insects were analyzed using the pyrosequencing of 16S rRNA genes for their potential biotechnological applications in lignocelluloses degradation. The result showed that operational taxonomic units (OTUs), species richness and diversity index were higher in the hindgut than in the midgut of all insect samples analyzed. The dominant phyla or classes were Firmicutes (54.0%), Bacteroidetes (14.5%), ${\gamma}-Proteobacteria$ (12.3%) in all xylophagous insects except for Rhinotermitidae. The principal coordinates analysis (PCoA) showed that the bacterial community structure mostly clustered according to phylogeny of hosts rather than their habitats. In our study, the two carboxymethyl cellulose (CMC)-degrading isolates which showed the highest enzyme activity were most closely related to Bacillus toyonensis $BCT-7112^T$ and Lactococcus lactis subsp. hordniae $NCDO\;2181^T$, respectively. Cellulolytic enzyme activity analysis showed that ${\beta}-1,4-glucosidase$, ${\beta}-1,4-endoglucanase$ and ${\beta}-1,4-xylanase$ were higher in the hindgut of Cerambycidae. The results demonstrate that xylophagous insect guts harbor diverse gut bacteria, including valuable cellulolytic bacteria, which could be used for various biotechnological applications.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

,2013). 따라서 본 연구에서는 이전에 연구가 잘 되어있지 않은 목질 섭식 곤충의 곤충 종류 및 장 부위별 장내 세균 군집 조성 및 다양성을 분석하기 위해서 16S rRNA 유전자 염기서열 기반의 파이로시퀀싱 기법을 이용하였고, DNS (dinitrosalicylic acid) 방법을 이용하여 각 곤충의 장내 섬유소 분해능 시험을 수행하였다. 또한 향후 연구에 사용될 수 있는 섬유소 분해능을 가진 새로운 세균을 분리하기 위하여 곤충의 장 적출물을 희석평판 배양하였다.

제안 방법

, 2010). 96 well DNA clean-up plate (Millipore)를 이용하여 PCR 산물을 정제한 후 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열 분석은 (주)제노텍에서 수행하였으며, 800R 프라이머(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3')를 사용하여 약 500–700 bp 크기의 염기서열을 얻었다.
Bradford assay를 이용하여 농도가 조절된 장 추출물 50 μl와 기질 50 μl를 PCR tube에 넣고 현탁한 뒤 thermal cycler (Biometra)를 이용하여 반응시켰고(37°C, 90분) 반응시키지 않은 것을 대조구로 사용하였다.
CMC를 분해하는 미생물의 밀도를 확인하기 위해서 10-4-10-6의 희석계열액 0.1 ml를 1% CMC가 첨가된 R2A 배지(Difco)와 MediaⅡ 배지(Cazemier et al., 2003)에 3반복으로 도말 한 후 28°C에서 7일간 배양하였다.
PCR은 touch-down 방식으로 수행되었으며 초기 denaturation(94°C, 5분) 후 denaturation (94°C, 30초)-annealing (60°C, 45초)-extension (72°C, 90초)을 10회 반복하였다.
Qubit fluorometer (Invitrogen)를 이용하여 DNA의 농도를 측정한 후 농도를 1 ng/μl로 조절하였다.
각 well 당 멸균된 30% glycerol 40 μl가 첨가된 96-well microplate에 진탕배양한 균주 40 μl를 넣고 잘 혼합한 후 SILVERsealTM (Greiner Bio-One)으로 덮고 -70°C에서 동결 보존하였다.
곤충별 장 적출물의 섬유소 분해활성을 측정하기 위하여 적출물 0.5 g을 sodium citrate buffer 500 μl (50 mM, pH 7.0)가 첨가된 Eppendorf tube에 넣고 cute mixer (EYELA)을 이용하여 현탁(2,000 rpm, 10분)하였다.
, 2009) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 다음으로 RDP database (version 9)(Cole et al.,2009)를 이용하여 진핵생물, 고세균, 엽록체, 미토콘드리아, 계(kingdom) 수준에서 분류가 안된 염기서열들을 제거한 후 각 시료의 염기서열을 1510개(갑옷바퀴 샘플은 755개)로 표준화하였다. 시료간 유사성 기반의 베타 다양성 분석은 mothur 프로그램의 tree.
따라서 본 연구에서는 이전에 연구가 잘 되어있지 않은 목질 섭식 곤충의 곤충 종류 및 장 부위별 장내 세균 군집 조성 및 다양성을 분석하기 위해서 16S rRNA 유전자 염기서열 기반의 파이로시퀀싱 기법을 이용하였고, DNS (dinitrosalicylic acid) 방법을 이용하여 각 곤충의 장내 섬유소 분해능 시험을 수행하였다. 또한 향후 연구에 사용될 수 있는 섬유소 분해능을 가진 새로운 세균을 분리하기 위하여 곤충의 장 적출물을 희석평판 배양하였다.
수집한 곤충은 70% 에탄올로 1분간 표면을 살균한 뒤 멸균 증류수로 두 번 세척하였다. 멸균된 핀셋과 메스를 이용하여 항문에서 가슴까지 절개한 후 중장과 후장으로 나누어 적출하였고, 적출한 장을 부위별로 모아 1.5ml Eppendorf tube에 넣고 pestle tip (OPTIMA)을 이용하여 균질화하였다. 초기희석액을 제조하기 위하여 장 적출물 0.
시료가 첨가된 모든 well에 Bradford working solution 100 μl를 첨가한 후(Bradford, 1976) microplate reader (Infinite® 200 PRO NanoQuant, Tecan)에서 595nm로 흡광도를 측정하였다.
,2009)를 이용하여 진핵생물, 고세균, 엽록체, 미토콘드리아, 계(kingdom) 수준에서 분류가 안된 염기서열들을 제거한 후 각 시료의 염기서열을 1510개(갑옷바퀴 샘플은 755개)로 표준화하였다. 시료간 유사성 기반의 베타 다양성 분석은 mothur 프로그램의 tree.shared와 pcoa 명령어를 이용하여 수행하였다. 분석한 곤충 장내 세균 유래의 파이로시퀀스는 농업생명공학정보센터(NABIC)에 NN-1687-000001-000040의 번호로 등록하였다.
염기서열 분석은 (주)제노텍에서 수행하였으며, 800R 프라이머(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3')를 사용하여 약 500–700 bp 크기의 염기서열을 얻었다.
, 2003). 이 장내세균 중에서 섬유소 분해균의 밀도를 측정하기 위하여, CMC가 첨가된 2종류의 배지(R2A, Media Ⅱ)에 희석평판 한 뒤, congo red 용액을 사용하여 분해능을 갖는 콜로니를 계수하였다(Table 4). 그 결과, 후장의 Media Ⅱ 배지에서의 밀도를 제외하고는 사슴벌레(0.
장 적출물의 DNA는 초기 희석액 0.5 ml로부터 FastDNA spin kit for soil (MP biomedicals)를 이용하여 추출하였다. Qubit fluorometer (Invitrogen)를 이용하여 DNA의 농도를 측정한 후 농도를 1 ng/μl로 조절하였다.
장내 세균을 동정하기 위하여, 보존 시 96-deep well plate에 남아있는 균주를 96-well PCR tube에 넣고 액체질소와 80°C에서 1분씩 5번 반복하는 freezing-thawing 방법으로 세포를 파괴시킨 후 thermal cycler (Biometra)를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하였다.
증폭된 PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동을 통하여 약 500 bp 크기의 밴드를 확인한 후 메스를 이용하여 밴드부분의 겔을 절단하고 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 정제하였다. 정제한 DNA를 서울대학교 농생명과학공동기기원에 의뢰하여 454 GS FLX Titanium Sequencing System (Roche)을 이용한 파이로시퀀싱을 수행하였다. 염기서열은 UPARSE 파이프라인(Edgar, 2013)을 이용하여 OTU 클러스터링을 수행하였다.
여기서 X는 7-11개의 뉴클레오타이드로 구성된 바코드이며, 시료를 구별하기 위해 사용되었다. 증폭된 PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동을 통하여 약 500 bp 크기의 밴드를 확인한 후 메스를 이용하여 밴드부분의 겔을 절단하고 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 정제하였다. 정제한 DNA를 서울대학교 농생명과학공동기기원에 의뢰하여 454 GS FLX Titanium Sequencing System (Roche)을 이용한 파이로시퀀싱을 수행하였다.
, 2003)에 3반복으로 도말 한 후 28°C에서 7일간 배양하였다. 콜로니 계수를 한 후 CMC를 분해하는 세균의 밀도를 측정하기 위하여 평판에 0.1% congo red 용액을 넣고 30분간 염색한 후 흘려버린뒤 1 M NaCl 용액으로 10분간 탈색한 후 투명환이 생긴 콜로니를 계수하였다. 분리한 장내 세균의 CMC 분해능을 확인하기 위하여 congo red 염색법을 이용하여 위와 동일한 방법으로 실험하였으며, 투명환의 직경을 측정하였다.
Qubit fluorometer (Invitrogen)를 이용하여 DNA의 농도를 측정한 후 농도를 1 ng/μl로 조절하였다. 파이로시퀀싱 분석을 위해 thermal cycler (Biometra)를 이용하여 추출된 DNA의 16S rRNA 유전자를 증폭하였다. PCR 반응액은 총 30 μl이었으며 1x PCR buffer (Roche), 4종의 dNTP 각 0.
하늘소 7개 시료와 사슴벌레 9개 시료의 장내 세균 밀도를 측정하기 위하여 R2A 배지와 Media Ⅱ 배지를 사용하여 장 부위별로 희석평판을 수행하였다(Table 3). 장내 세균의 밀도는 R2A에 배양한 하늘소(447.
하늘소(135 균주), 사슴벌레(136 균주), 갑옷바퀴(9 균주), 흰개미(19균주) 4종의 곤충에서 총 299균주의 장내세균을 분리하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통하여 속 수준까지 동정하였다(Table 5).
하늘소와 사슴벌레의 장 적출물을 4개의 서로 다른 기질(salicin, β-1,4-glucosidase; CMC, β-1,4-endoglucanase; Avicel, β-1,4-exoglucanase; xylan, β-1,4-xylanase)과 반응시켜 섬유소 효소 활성을 측정하였다(Fig. 6).

대상 데이터

CMC (carboxymethyl cellulose, Sigma Aldrich)를 분해하는 장내 세균을 분리하기 위하여 0.85% NaCl 0.9 ml이 들어있는 Eppendorf tube에 초기희석액을 0.1 ml씩 넣고 10배씩 희석하면서 10^-6까지 희석액을 제조하였다. CMC를 분해하는 미생물의 밀도를 확인하기 위해서 10^-4-10^-6의 희석계열액 0.
본 연구에서 실험에 사용하기 위하여 국내의 총 10개 지역내에 19개 지점에서 목질 섭식 곤충(사슴벌레, 하늘소, 갑옷바퀴, 흰개미)이 서식하고 있는 부후목을 수집하였다(Fig. 1 and Table 1). 목질 섭식 곤충에서 적출한 40개 장 시료(사슴벌레 중장과 후장 11개, 하늘소 중장과 후장 7개, 갑옷바퀴 중장과 후장 1개, 흰개미 장 2개) 유래의 파이로시퀀스를 분석한 결과, OTU 수는 사슴벌레 후장에서 405개로 가장 높았다(Table 2).
본 연구에서는 총 12개 지역 60개 지점에서 목질 섭식 곤충이 서식하고 있는 부후목을 수집하였으나 모든 실험을 진행하기에는 장 적출물의 양이 적었기 때문에 제주, 울릉, 중부(설악산, 칠보산, 수원, 중원산, 용문산), 남부(계룡산, 팔공산) 지방에서 채집한 총 21개를 실험에 사용하였다. 부후목은 적당히 해체하여 유충이 확인되면 약 50 cm로 잘라 수집하였다.
수집한 부후목은 마르지 않게 수분을 보충해주면서 한 달 동안 25°C에서 유지시킨 후 나무를 해체하여 사슴벌레(Lucanidae)와 하늘소(Cerambycidae)는 성충으로 우화하기 1-2령전 정도의 유충을 크기에 따라 3-5마리, 갑옷바퀴(Cryptocercidae)는 2마리, 흰개미(Rhinotermitidae)는 약 150마리를 수집하였다.
다음 단계에서 denaturation (94°C, 30초)-annealing (55°C, 45초)-extension(72°C, 90초)을 20회 반복하였다. 정방향 프라이머는 V1-9F(5ʹ-X-AC-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3ʹ), 역방향 프라이머는 V3-541R (5ʹ-X-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3ʹ)을 사용하였다. 여기서 X는 7-11개의 뉴클레오타이드로 구성된 바코드이며, 시료를 구별하기 위해 사용되었다.

데이터처리

txt 파일은 펄 스크립트를 이용하여 행열을 변환한 후 생성한 *.shared 파일을 Mothur(version 1.27.1)(Schloss et al., 2009) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 다음으로 RDP database (version 9)(Cole et al.
염기서열 분석은 (주)제노텍에서 수행하였으며, 800R 프라이머(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3')를 사용하여 약 500–700 bp 크기의 염기서열을 얻었다. 분석된 염기서열 데이터는 Seqman (version. 5.05)프로그램으로 가공 처리하였으며, EzBioCloud 데이터베이스(http://www.ezbiocloud.net/)(Kim et al., 2012)에서 표준균주들과 염기서열의 유사도를 분석하였다.

이론/모형

곤충의 장내세균에 대한 군집구조간의 비교는 16S rRNA 염기서열간의 계통분류학적 유사도를 고려한 방법인 unweighted UniFrac 분석과 공유 또는 비공유되는 OTU의 풍부도에 근거한 Theta-YC distance index를 이용하였다. Theta-YC distance index를 이용한 클러스터링 분석 결과, 사슴벌레 후장시료 4개(16LH, 35LH, 48LH, 53LH) 시료와 울릉도에서 채집한 하늘소 2개(47CM, 47CH) 시료를 제외한 나머지 시료들 중 하늘소와 사슴벌레는 곤충 과별로 클러스터가 형성되었으며, 곤충시료 내에서 중장과 후장의 차이는 없었다(Fig.
목질 섭식 곤충에 관한 장내 세균 군집의 연구를 이용한 lignocellulose의 분해는 생명 공학적 응용에 있어 큰 잠재력을갖는다. 본 연구에서 목질 섭식 곤충의 장내 세균 군집은 16S rRNA 유전자를 기반으로 한 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 분석되었다. 분석된 모든 곤충에서 중장보다 후장에서 OTU 수, 종 풍부도, 다양성 지수가 높았다.
1% congo red 용액을 넣고 30분간 염색한 후 흘려버린뒤 1 M NaCl 용액으로 10분간 탈색한 후 투명환이 생긴 콜로니를 계수하였다. 분리한 장내 세균의 CMC 분해능을 확인하기 위하여 congo red 염색법을 이용하여 위와 동일한 방법으로 실험하였으며, 투명환의 직경을 측정하였다.
샘플을 10,000 × g로 4°C에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 1.5 ml Eppendorf tube에 옮기고, 단백질 농도를 측정하기 위해 Bradford assay(Bradford, 1976)를 수행하였다.
정제한 DNA를 서울대학교 농생명과학공동기기원에 의뢰하여 454 GS FLX Titanium Sequencing System (Roche)을 이용한 파이로시퀀싱을 수행하였다. 염기서열은 UPARSE 파이프라인(Edgar, 2013)을 이용하여 OTU 클러스터링을 수행하였다. 클러스터링한 후 생성된 *_otu_table.
측정된 시료와 standard의 값을 계산하여 각 시료에 sodium citrate buffer를 첨가하면서 단백질 농도를 60 μg/ml로 조절하였다. 장 적출물 시료의 섬유소 분해활성을 측정하기 위하여, dinitrosalicylic acid (DNS) assay(Miller, 1959)를 이용하여 장 추출물과 기질이 반응할 때 생성되는 환원당의 양을 측정하였다. 섬유소 분해효소에 해당하는 4종류의 기질은 2% salicin (β-1,4-glucosidase), 2% CMC (β1,4-endoglucanase), 1% Avicel (β-1,4-exoglucanase), 1% xylan(β-1,4-xylanase)이었고, 이를 대상으로 섬유소 분해활성을 측정하였다(Kukor et al.

성능/효과

PCoA (principal coordinates analysis)를 이용하여 세균의 군집 구조를 분석한 결과, 서식지보다는 곤충의 과별로 클러스터링 되는 경향이었다. CMC 분해 활성이 가장 높은 두 균주는 Bacillus toyonensis BCT-7112^T와 Lactococcus lactis subsp.hordniae NCDO 2181^T과 유연관계가 높았다. 장 적출물의 섬유소 분해활성 실험 결과, 하늘소 후장에서 β-1,4-glucosidase, β-1,4-endoglucanase, β-1,4-xylanase의 효소활성이 가장 높았다.
9)에서 가장 낮았다. OTU수, 종 풍부도, 다양성 지수는 모든 곤충 종에서 중장보다 후장이 더 높은 경향이었다. pH는 사슴벌레 중장(7.
세균 문 또는 강 수준의 다양성을 분석한 결과, 흰개미를 제외한 곤충의 장내 군집에는 Firmicutes, Bacteroidetes, γ-Proteobacteria가 우점하였다. PCoA (principal coordinates analysis)를 이용하여 세균의 군집 구조를 분석한 결과, 서식지보다는 곤충의 과별로 클러스터링 되는 경향이었다. CMC 분해 활성이 가장 높은 두 균주는 Bacillus toyonensis BCT-7112^T와 Lactococcus lactis subsp.
R2A와 Media Ⅱ배지에서 장내 세균의 밀도는 하늘소가 사슴벌레보다 약 3-15배 가량 높았으며, 배지 별로는 Media Ⅱ 배지(12.4–326.4)보다 R2A 배지(13.9–447.1)에서 높았고, 장 부위별로는 중장(13.2, 50.0)보다 후장(28.5, 386.8)에서 두 배지 모두에서 높았다.
Rarefaction curve 분석 결과, 사슴벌레 후장에서 OTU 풍부도가 가장 높았으며, 갑옷바퀴 중장에서 가장 낮았다(Fig. 2). 하늘소와 사슴벌레의 중장과 후장, 갑옷바퀴 후장의 곡선은 샘플수가 커질수록 OTU 풍부도가 증가하는 반면에 갑옷바퀴 중장과 흰개미 장의 곡선은 상대적으로 완만한 곡선을 나타내었다.
곤충의 장내세균에 대한 군집구조간의 비교는 16S rRNA 염기서열간의 계통분류학적 유사도를 고려한 방법인 unweighted UniFrac 분석과 공유 또는 비공유되는 OTU의 풍부도에 근거한 Theta-YC distance index를 이용하였다. Theta-YC distance index를 이용한 클러스터링 분석 결과, 사슴벌레 후장시료 4개(16LH, 35LH, 48LH, 53LH) 시료와 울릉도에서 채집한 하늘소 2개(47CM, 47CH) 시료를 제외한 나머지 시료들 중 하늘소와 사슴벌레는 곤충 과별로 클러스터가 형성되었으며, 곤충시료 내에서 중장과 후장의 차이는 없었다(Fig. 4). Unweighted UniFrac-PCoA 분석에서도 울릉도 하늘소를 제외하고 각 곤충 종으로 그룹핑 되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
4). Unweighted UniFrac-PCoA 분석에서도 울릉도 하늘소를 제외하고 각 곤충 종으로 그룹핑 되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 따라서 지역보다는 곤충 종류가 장내 세균 군집구조에 더 큰 영향을 미치는 것임을 알 수 있었다.
특히 활성이 가장 높았던 균주는 사슴벌레 후장과 하늘소 중장에서 분리한 32LH-43 균주와 60CM-43 균주로 이들은 각각 Bacillus toyonensis BCT7112^T(CP006863)와 Lactococcus lactis subsp. hordniae NCDO2181^T(AB100804)와 유연관계가 높은 것으로 확인되었다. 분리한 균주 중 모든 곤충에서 Raoultella planticola (23균주)와 유연관계가 높은 균주가 가장 많이 분리되었으며, 이들 균주에서 14CH-01, 16LH-05, 43RG-04, 48LH-07, 36CH-24 균주는 표준 균주의 유사도를 근거로 하여 새로운 속이나 종일 가능성이 높은 것으로 확인되었다.
곤충 목 수준에서 사슴벌레와 하늘소가 속한 Coleoptera 목과 갑옷바퀴와 흰개미가 속한 Blattodea 목의 세균 분포를 비교하면, γ-Proteobacteria는 갑옷바퀴 중장(0.5%)과 후장(0%), 흰개미 장(1.4%)보다 사슴벌레 중장(17.0%)과 후장(4.6%), 하늘소 중장(25.6%)과 후장(37.1%)에서 점유 비율이 높은 반면, Bacteroidetes는 사슴벌레 중장(1.8%)과 후장(12.3%), 하늘소 중장(2.6%)과 후장(11.8%)보다 갑옷바퀴 중장(39.3%)과 후장(10.5%), 흰개미 장(23.0%)에서 점유 비율이 높았다.
8)에서 섬유소 분해균의 밀도가 높았다. 곤충의 장내 세균 밀도와 섬유소 분해균의 밀도는 사슴벌레보다 하늘소에서 높았지만, 전체 분리균에 대한 섬유소 분해균의 비율은 하늘소(9.1%) 보다 사슴벌레(32.5%)가 R2A(6.7%) 보다 Media Ⅱ배지(34.8%)에서 높았기 때문에 MediaⅡ 배지를 이용하여 사슴벌레 장에서 섬유소 분해균을 분리하는 것이 더 효과적일 것으로 판단되었다.
하늘소(135 균주), 사슴벌레(136 균주), 갑옷바퀴(9 균주), 흰개미(19균주) 4종의 곤충에서 총 299균주의 장내세균을 분리하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통하여 속 수준까지 동정하였다(Table 5). 그 결과, 하늘소 중장에서는 Raoultella (22.2%)와 Lactococcus (12.5%), 후장에서는 Serratia(17.5%)와 Klebsiella (12.7%)가 주로 분리되었고, 사슴벌레 중장에서는 Bulkholderia (16.7%), Cedecea (13.9%), Raoultella(11.1%), 후장에서는 Raoultella (14.1%), Escherichia (12.5%), Gryllotalpicola와 Bulkholderia (10.9%)가 주로 분리되었다. 갑옷바퀴의 중장과 후장에서는 Weissella가 각각 60%, 50%를 차지하였으며, 흰개미에서는 Lactococcus (31.
그 결과, 후장의 Media Ⅱ 배지에서의 밀도를 제외하고는 사슴벌레(0.3–5.1)보다 하늘소(5.1–10.6)에서 섬유소 분해균의 밀도가 높았으며, 하늘소의 후장을 제외하고는 R2A (0.3- 5.1)보다 Media Ⅱ배지(5.1-19.8)에서 섬유소 분해균의 밀도가 높았다.
5). 따라서 지역보다는 곤충 종류가 장내 세균 군집구조에 더 큰 영향을 미치는 것임을 알 수 있었다. 별노린재과(Pyrrhocoridae) 중장의 세균 군집 다양성을 분석한 이전 연구에서도 군집 구조는 5개 지역 간 큰 차이가 없었지만 곤충의 먹이에 따라 변화한다고 보고하였다(Sudakaran et al.
1 and Table 1). 목질 섭식 곤충에서 적출한 40개 장 시료(사슴벌레 중장과 후장 11개, 하늘소 중장과 후장 7개, 갑옷바퀴 중장과 후장 1개, 흰개미 장 2개) 유래의 파이로시퀀스를 분석한 결과, OTU 수는 사슴벌레 후장에서 405개로 가장 높았다(Table 2).풍부도 추정치(Chao1, Ace)도 사슴벌레 후장(462.
장 적출물의 섬유소 분해활성 실험 결과, 하늘소 후장에서 β-1,4-glucosidase, β-1,4-endoglucanase, β-1,4-xylanase의 효소활성이 가장 높았다. 본 연구에서는 목질 섭식 곤충의 장내에 다양하고 풍부한 세균이 서식하며, 섬유소를 분해하는 세균이 존재한다는 사실을 확인하였고, 이로부터 다양하고 유용한 섬유소 분해균을 분리할 수 있을 것으로 판단되었다.
hordniae NCDO2181^T(AB100804)와 유연관계가 높은 것으로 확인되었다. 분리한 균주 중 모든 곤충에서 Raoultella planticola (23균주)와 유연관계가 높은 균주가 가장 많이 분리되었으며, 이들 균주에서 14CH-01, 16LH-05, 43RG-04, 48LH-07, 36CH-24 균주는 표준 균주의 유사도를 근거로 하여 새로운 속이나 종일 가능성이 높은 것으로 확인되었다.
본 연구에서 목질 섭식 곤충의 장내 세균 군집은 16S rRNA 유전자를 기반으로 한 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 분석되었다. 분석된 모든 곤충에서 중장보다 후장에서 OTU 수, 종 풍부도, 다양성 지수가 높았다. 세균 문 또는 강 수준의 다양성을 분석한 결과, 흰개미를 제외한 곤충의 장내 군집에는 Firmicutes, Bacteroidetes, γ-Proteobacteria가 우점하였다.
세 종류의 기질(salicin, CMC, Avicel)을 분해하는 유리알락하늘소(Anoplophora glabripennis)의 장내 효소 활성을 측정한 이전 연구와 비교하였을 때(Geib et al., 2009), 본 연구의 효소 활성 결과와는 β-1,4-endoglucanase > β-1,4-glucosidase > β-1,4-exoglucanase 순으로 일치하였다.
세균 문 또는 강 수준의 다양성을 분석한 결과, 흰개미를 제외한 곤충의 장내 군집에는 Firmicutes, Bacteroidetes, γ-Proteobacteria가 우점하였다.
이들 곤충 장내 분리 세균 중 총 21균주가 CMC 분해능을 가지는 것으로 확인되었다(Table 6). 특히 활성이 가장 높았던 균주는 사슴벌레 후장과 하늘소 중장에서 분리한 32LH-43 균주와 60CM-43 균주로 이들은 각각 Bacillus toyonensis BCT7112^T(CP006863)와 Lactococcus lactis subsp.
장 적출물의 섬유소 분해활성 실험 결과, 하늘소 후장에서 β-1,4-glucosidase, β-1,4-endoglucanase, β-1,4-xylanase의 효소활성이 가장 높았다.
5)에서 가장 낮았다. 전체적으로 곤충의 장내 pH는 약산성-중성의 산도를 나타내었으며, 중장이 후장보다 더 높았다. 이전 연구에서 바퀴벌레 종인 Shelfordella lateralis의 장내 pH는 중장과 후장에서 각각 5.
특히 하늘소 중장 시료에서 가장 활성이 높았으며, 장 부위별로는 하늘소의 후장(1.4–5.8 mg/g) 보다 중장(21.0–33.8 mg/g)에서 활성이 높았고, 사슴벌레는 장 부위별로 효소 활성의 차이가 크지 않았다.
2). 하늘소와 사슴벌레의 중장과 후장, 갑옷바퀴 후장의 곡선은 샘플수가 커질수록 OTU 풍부도가 증가하는 반면에 갑옷바퀴 중장과 흰개미 장의 곡선은 상대적으로 완만한 곡선을 나타내었다.
흰개미를 제외한 나머지 곤충에서는 Firmicutes (38.0–78.2%)의 비율이 가장 높았으며, 사슴벌레와 하늘소의 Bacteroidetes의 비율은 중장(1.8%, 2.6%)에 비해 후장(12.3%, 11.8%)에서 높았다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	바이오 에탄올을 생산하는 방법은 무엇인가?	, 2005), 섬유소를 기반으로 얻을 수 있는 바이오연료가 주목을 받고 있다(Sun and Scharf, 2010). 바이오 에탄올은 바이오매스의 섬유소 부분을 가수분해하여 얻어진 단당류를 발효하여 생산되며(Hamelinck et al., 2005), 미생물을 이용한 발효 공정은 다른 방법들에 비해 경제적이고 환경친화적이라는 장점이 있다(Eijsink et al.
	인간의 장내 세균은 어떤 역할을 하는가?	곤충은 지구상에서 가장 다양하고 풍부한 동물 중 하나이며(Engel and Moran, 2013), 곤충의 장내에는 많은 미생물들이 서식하고 있다(Dillon and Dillon, 2004). 곤충의 장내에 공생하는 세균은 숙주의 생리 대사 조절, 섭식한 먹이의 소화 효율 촉진, 외부로부터 유입된 유해한 미생물의 억제 등의 중요한 역할을 수행하며(Kaufman and Klug, 1991; Dillon and Charnley, 2002; Engel and Moran, 2013), 인간의 장내 세균의 경우에는 영양분을 합성하고 면역체계와 관련한 상호작용 등의 역할을 수행한다(Clemente et al., 2012).
	사슴벌레, 하늘소, 갑옷바퀴, 흰개비 등의 목질 섭식 곤충의 세균 군집 분석결과 중장보다 후장에서 수치가 높았던 항목에는 무엇이 있는가?	본 연구에서 목질 섭식 곤충의 장내 세균 군집은 16S rRNA 유전자를 기반으로 한 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 분석되었다. 분석된 모든 곤충에서 중장보다 후장에서 OTU수, 종 풍부도, 다양성 지수가 높았다. 세균 문 또는 강 수준의 다양성을 분석한 결과, 흰개미를 제외한 곤충의 장내 군집에는 Firmicutes, Bacteroidetes, ${\gamma}-Proteobacteria$가 우점하였다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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