[논문]동해방지제의 종류, 농도 및 침투시간이 굴 (Crassostrea gigas) 미수정란의 수정률과 부화율에 미치는 영향

김기태; 임한규

doi:10.9710/kjm.2015.31.3.179

동해방지제의 종류, 농도 및 침투시간이 굴 (Crassostrea gigas) 미수정란의 수정률과 부화율에 미치는 영향
Effects of concentration and permeation time of cryoprotectants on fertilization and hatching rate in the unfertilized egg of the Pacific oyster Crassostrea gigas 원문보기

한국패류학회지 = The Korean journal of malacology, v.31 no.3, 2015년, pp.179 - 186

김기태 (국립수산과학원 남동해수산연구소) , 임한규 (국립목포대학교 해양수산자원학과)

초록
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굴 미수정란의 동결보존에 적합한 동해방지제의 종류, 농도 및 침투 시간을 구명하기 위하여 4가지 동해방지제 (DMSO, EG, methanol, PEG) 를 대상으로 수정률, 부화율 및 형태 이상률을 조사하였다. 동해방지제의 농도 및 침지시간은 각각 5, 10, 15, 20%와 10, 20, 30, 40분이었다. 침지 후 미수정란은 정상 정자와 수정되었고, 수정률, 부화율 및 형태 이상률은 동해방지제의 종류와 농도 및 침지시간에 영향을 받았다. 동해방지제의 농도와 침지시간의 증가에 따라 수정률과 부화율은 낮아졌고, 대부분의 동해방지제에서 5-10% 농도와 10-20분의 짧은 침지시간에서 좋은 결과를 보였다. 수정률과 부화율을 근거로 굴 미수정란에 가장 적합한 동해방지제는 DMSO였으며, 처리 농도와 침지 시간은 각각 5%와 10-20분이었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The Pacific oyster Crassostrea gigas oocytes were exposed to 4 cryoprotectants, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), methanol, or polyethylene glycol (PEG), each with 4 four concentrations (5, 10, 15, and 20%) and for 10, 20, 30 or 40 minutes for permeation. The oocytes were then fertilized, using normal sperm of the species. Fertilization and hatching rates were clearly influenced by cryoprotectant species and their concentration and permeation time. Overall, they decreased as concentrations and permeation time of cryoprotectants increased with optimum results at concentrations of 5-10% and a permeation time of 10 minutes. Larval abnormalities, a sign of the chemical damage, were a representative phenotype which was higher at a higher concentration and longer duration of the chemicals. In conclusion, best result was from 5% DMSO exposure for 10-20 minute permeation.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이와 같이 패류의 발생 배를 이용한 많은 연구들이 진행되어 왔지만, 수정되지 않은 알을 이용한 연구는 아직 미미한 실정이고, 동해방지제의 정확한 세포 보호 매커니즘은 아직 완전히 구명되지 않은 상태이다. 그러므로 본 연구에서는 패류양식 산업에서 중요한 위치를 점유하고 있는 굴의 미수정란을 동결보존하기 위하여, 적합한 동해방지제의 종류, 농도 및 침투 시간에 관한 실험을 실시하여 적정 동해방지제와 농도 및 침지시간을 파악하고자 하였다.

제안 방법

그 후 망목 30 µm 체로 거른 다음, 100개/mL 밀도로 100 mL 비커에 넣어 실온 20℃에서 경과시간에 따른 수정률, 부화율 및 형태 이상률을 조사하였다. 수정률은 광학현미경 (× 100) 의 한 시야에서 전체 수정란에 대한 2-4세포로 발생한 발생 배의 수로 계산하였으며, 부화율도 전체 배중에서 담륜자로 발생한 개체의 비율로 산정하였다. 굴의 전형적인 담륜자 유생과 비교하여 세포가 파괴되어 형태가 변형된 유생은 모두 형태 이상으로 간주하여 계수하였다.
46 g, Milli-Q water 100 mL) 와 혼합 하여 농도를 조절하였다. 실험 농도와 침투시간은 각각 5, 10, 15 및 20%와 10, 20, 30 및 40분으로 설정하였다. 동해방지제 침투가 끝난 미수정란은 침투시간과 같은 시간만큼 각각 여과해수에서 동해방지제를 용출 시켰으며 용출된 미수정란은 성숙한 수컷 굴의 정소에서 채취한 정액으로 수정시켰다.
이 후 미수정란을 망목 140 µm, 65 µm 및 20 µm의 뮐러가제를 사용하여 3회 걸러낸 후, 차아염소산나트륨 150 ppm으로 소독하였고, 자외선 유수 살균기를 거친 깨끗한 해수에 보관하면서 동해방지제 침투실험에 사용하였다. 침투실험에 사용되어진 동해방지제의 종류는 methanol, DMSO, EG 및 polyethylene glycol (PEG) 였으며, 인공해수 (NaCl 2.7 g, KCl 0.07 g, NaHCO₃ 0.05 g, CaCl₂ 0.12 g, MgCl₂ 0.46 g, Milli-Q water 100 mL) 와 혼합 하여 농도를 조절하였다. 실험 농도와 침투시간은 각각 5, 10, 15 및 20%와 10, 20, 30 및 40분으로 설정하였다.

대상 데이터

동해방지제 침투실험에서 사용한 채란·채정용 굴 어미는 2년생 남해안 양식산으로 50개체를 15℃의 ice box에 수용하여 실험실로 수송되었다. 이 후 패각에 붙어 있는 오염물질 및 이물질을 제거하고, 수온 20℃의 순환사육시스템에서 하루 동안 적응시킨 다음 실험에 사용하였다.

데이터처리

각 실험 결과로부터 얻어진 모든 측정값은 평균 ± 표준 오차 (mean ± S.E.) 로 표시하였으며, 측정값 사이의 유의차 유무는 SAS 통계패키지 (ver. 9.1)를 이용하여 95%의 신뢰수준에서 One-way ANOVA test를 실시한 후 최소유의차 검정을 실시하였다

성능/효과

해수는 1,000 mOsm/kg의 삼투질농도를 가지지만 연구에 사용된 동해방지제는 최저 1,265 mOsm/kg에서 최고 3,000 mOsm/kg 이상을 나타냈다. 따라서 세포가 동해방지제노출시 세포막이 손상을 입는 것은 피할 수 없을 것으로 판단된다. 그러나 굴 미수정란을 동해방지제에 노출시킨 후 실제 세포내 동해방지제의 농도와 세포가 받는 손상과의 관계는 파악하지 못했다.
그러나 모든 동해방지제는 강약의 차이는 있지만 세포에 대한 독성을 가지고 있어 사용 농도나 처리 시간에 따라 세포의 생존에 큰 영향을 미치고 있다. 본 연구에서 굴 미수정란에 대한 DMSO, EG, methanol 및 PEG의 침지실험 결과, 동해방지제의 농도가 높아지거나 침투시간이 길어질수록 수정률 및 부화율은 낮아지는 반면, 형태 이상률은 높아지는 경향을 나타내었다. 이는 Renard and Cochard (1989) 가 언급한 것처럼 동해방지제 독성으로 인한 배의 손상은 동해방지제의 높은 삼투질농도와 생화학적 영향에 의한 것으로 생각된다.

후속연구

(1995)도 어류 배의 화학물질에 대한 내성은 발달 단계에 의존한다고 하였고, Haga (1982)는 무지개송어의 발안난이 발안하기 이전보다 내성이 높다고 하였다. 본 연구에서는 미수정란만 실험에 사용하였기 때문에 배의 발달 단계에 따른 동해방지제의 효과를 명확히 밝힐 수 없었으나, 다른 실험들에서 더 발달한 굴 배일수록 동해방지제에 대한 내성이 증가하는 경향을 보였기 때문에 (Kim, 2015), 만일 본 실험에서도 수정 후배체가 형성된 배를 대상으로 실험을 실시하였다면 더욱 좋은 결과가 얻어졌을 것이다.
따라서 세포가 동해방지제노출시 세포막이 손상을 입는 것은 피할 수 없을 것으로 판단된다. 그러나 굴 미수정란을 동해방지제에 노출시킨 후 실제 세포내 동해방지제의 농도와 세포가 받는 손상과의 관계는 파악하지 못했다. 수산 동물을 대상으로 발생 배 내부에 침투한 동해방지제의 농도를 측정하는 방법으로는 동위원소로 표지하여 측정하는 방법 (Harvey et al.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	동해방지제는 어떤 물질인가?	동해방지제 (cryoprotectant) 는 세포가 동결되는 과정에서 생겨나는 세포내 전해질의 농축이나 삼투질농도의 증가와 세포 내외의 얼음 결정 형성 등 세포의 생존에 불리한 상태를 완화하거나 조절하는 역할을 하는 물질이다 (한국수정란이식학회, 1995). 동결보존 과정에서 세포의 생존에 중요한 역할을 하는 동해방지제는 동해방지제 외에도 동결보호제, 동결보호물질, 내동제 등 다양하게 불리고 있다.
	굴 미수정란의 동결보존에 적합한 동해방지제를 구명하기위해 무엇을 대상으로 조사했는가?	굴 미수정란의 동결보존에 적합한 동해방지제의 종류, 농도 및 침투 시간을 구명하기 위하여 4가지 동해방지제 (DMSO, EG, methanol, PEG) 를 대상으로 수정률, 부화율 및 형태 이상률을 조사하였다. 동해방지제의 농도 및 침지시간은 각각 5, 10, 15, 20%와 10, 20, 30, 40분이었다.
	굴 미수정란의 동결보존의 사용한 4가지 동해방지제중 가장 적합한 것으로 보인 것은 무엇인가?	동해방지제의 농도와 침지시간의 증가에 따라 수정률과 부화율은 낮아졌고, 대부분의 동해방지제에서 5-10% 농도와 10-20분의 짧은 침지시간에서 좋은 결과를 보였다. 수정률과 부화율을 근거로 굴 미수정란에 가장 적합한 동해방지제는 DMSO였으며, 처리 농도와 침지 시간은 각각 5%와 10-20분이었다.

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표제어: PCR

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