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문제 정의
- C2C12 근원세포가 다핵의 myotube를 형성하여 골격근 세포로 분화하는 과정에 있어 IGF-I이 FABPpm 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. 이를 위해 24, 48, 72, 그리고 96시간 동안 분화배지로 분화를 유도하였고, 분화를 유도하는 과정에서 20 ng/ml의 IGF-I을 처리하여 면역 형광 염색(immuno-cytochemistry)을 실시하였다.
- 또한 C2C12 골격근 세포의 성장 및 분화, 특정 유전자의 세포 성장 및 분화 관여, 또는 근 비대와 위축 기전 등을 규명하는데 집중되어왔던 반면, 근육 세포가 분화하는 과정에서의 지방산 수송과 같은 대사적인 측면에서의 연구는 미비하였던 것이 사실이다. 따라서 본 연구에서는 C2C12 골격근 세포의 분화과정에서 지방산 수송체인 FABPpm의 발현이 myotube로 분화됨에 따라 증가한 것을 처음으로 관찰하였다는 것에 의의가 있다.
- 그러나 골격근 에너지 대사에 있어 IGF-I이 지방 에너지 대사 관련 유전자 발현에 미치는 영향에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 골격근 세포에서 지방산 흡수 및 저장, 사용 정도의 적정 균형을 유지하는데 중심적인 역할을 하는 FABPpm의 발현에 있어 IGF-Ⅰ 이 어떠한 영향을 미치는 알아보고자 하였다.
- [12]. 이러한 결과들을 바탕으로 본 연구에서는 골격근 세포의 성장 및 분화에 따른, 그리고 인슐린 구조 및 신호 체계와 유사하고 골격근 세포의 대사에 있어 중요한 역할을 하는 IGF-I이 FABPpm mRNA 및 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 최종적으로 추출된 pellete 상온에서 10분간 완전히 건조시킨 뒤 ultra pure water 30 μl에 녹여 UV 흡광도 260 nm에서 농도를 측정하였다. 1 μg/μl의 RNA를 cDNA master mix (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)와 혼합하여 25℃에서 10분, 42℃ 에서 60분, 그리고 95℃에서 5분간 PCR 을 이용해 cDNA를 합성하였다.
- 모든 샘플은 3회 반복 실험하여 합성시킨 cDNA를 2회 이상 반복 측정하였다. 95℃ 15초, 60℃ 30초간 40 cycle을 측정하여 CT 값을 얻어내고, 융해 곡선 확인을 위해 40 cycle 이후 dissociation stage를 2회 반복하였다. 결과는 단순 CT 값 비교 분석 방법을 사용하였으며, mRNA 발현양은 glyceraldehyde 3-phosphate de- hydrogenase (GAPDH)의 CT 값으로 상대 정량 하여 보정하였다.
- FABPpm의 mRNA 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green PCR master mix (Kappa, USA)를 사용하여 real-time RT-PCR (ABI PRISM 7700 system, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)을 실시하였다. 이때 사용한 모든 Primer는 마크로젠(M acrogen, KOREA)에서 제작 및 구입하여 사용하였으며, 사용된 primer sequence는 Table 1에 제시되었다.
- 95℃ 15초, 60℃ 30초간 40 cycle을 측정하여 CT 값을 얻어내고, 융해 곡선 확인을 위해 40 cycle 이후 dissociation stage를 2회 반복하였다. 결과는 단순 CT 값 비교 분석 방법을 사용하였으며, mRNA 발현양은 glyceraldehyde 3-phosphate de- hydrogenase (GAPDH)의 CT 값으로 상대 정량 하여 보정하였다.
- 2% TBST)로 5분간 상온에서 permeabilizing 하였다. 그 다음 0.1% TBST로 5분간 3번 씻어낸 후, blocking을 위해 5% BSA를 함유한 0.1% TBST 로 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 이후 TBS로 1회 씻어낸 뒤, 3% BSA를 함유한 TBS에 FABPpm monoclonal mouse an- tibody (Abcam, Cambridge, UK)를 1:500으로 희석하여 4℃ 에서 12시간 동안 반응시켰다.
- 처리하여 plate에 세포를 고정시켰다. 그 후 TBS로 2회 씻어내어, 0.2% triton X-100을 함유한 TBS (0.2% TBST)로 5분간 상온에서 permeabilizing 하였다. 그 다음 0.
- 이후 TBS로 1회 씻어낸 뒤, 3% BSA를 함유한 TBS에 FABPpm monoclonal mouse an- tibody (Abcam, Cambridge, UK)를 1:500으로 희석하여 4℃ 에서 12시간 동안 반응시켰다. 그 후, 0.1% TBST로 5분간 3회 세척한 뒤, Alexa 568-conjugated goat anti-mouse IgG secon- dary antibody (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 를 이용하여 3% BSA에 1:250으로 희석하여 상온에서 20분간 반응시킨 다음 0.1% TBST로 5분간 3번 씻어내었다. 세포 사진은 digital imaging system이 갖춰진 Axiovert 200 fluo- rescence microscope (Carl Zeiss, Germany)로 촬영하였다.
- 5×105 개씩 분주하여 90% 이상 자라도록 배양한 뒤, 배지를 제거하고 2% horse serum (HS) (Hyclone, Logan, UT)이 함유된 분화 배지, IGF-I을 함유한 분화배지로 교체하여 24-96시간 동안 배양하였다. 또한 20 ng/ml 의 IGF-I (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)을 시간 별로 처리하여 FABPpm의 mRNA와 단백질 발현 변화를 알아보았다.
- 이때 사용한 모든 Primer는 마크로젠(M acrogen, KOREA)에서 제작 및 구입하여 사용하였으며, 사용된 primer sequence는 Table 1에 제시되었다. 모든 샘플은 3회 반복 실험하여 합성시킨 cDNA를 2회 이상 반복 측정하였다. 95℃ 15초, 60℃ 30초간 40 cycle을 측정하여 CT 값을 얻어내고, 융해 곡선 확인을 위해 40 cycle 이후 dissociation stage를 2회 반복하였다.
- 영향을 미치는지 알아보았다. 이를 위해 24, 48, 72, 그리고 96시간 동안 분화배지로 분화를 유도하였고, 분화를 유도하는 과정에서 20 ng/ml의 IGF-I을 처리하여 면역 형광 염색(immuno-cytochemistry)을 실시하였다. 그 결과, Fig.
- 1% TBST 로 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 이후 TBS로 1회 씻어낸 뒤, 3% BSA를 함유한 TBS에 FABPpm monoclonal mouse an- tibody (Abcam, Cambridge, UK)를 1:500으로 희석하여 4℃ 에서 12시간 동안 반응시켰다. 그 후, 0.
- 이때 생성된 pellet을 DEPC 용액으로 희석한 75% EtOH을 이용하여 씻은 다음 4℃, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리를 하였다. 최종적으로 추출된 pellete 상온에서 10분간 완전히 건조시킨 뒤 ultra pure water 30 μl에 녹여 UV 흡광도 260 nm에서 농도를 측정하였다. 1 μg/μl의 RNA를 cDNA master mix (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)와 혼합하여 25℃에서 10분, 42℃ 에서 60분, 그리고 95℃에서 5분간 PCR 을 이용해 cDNA를 합성하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 C2C12 골격근 세포는 American Type of Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 구입하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 100 U/ml 의 penicillin G, 100 μg/ml 의 streptomycin sulfate (Welgene, KOREA)를 함유하고 있는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Welgene, KOREA)으로 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였다. 세포는 35 mm plate에 2.
- 1% TBST로 5분간 3번 씻어내었다. 세포 사진은 digital imaging system이 갖춰진 Axiovert 200 fluo- rescence microscope (Carl Zeiss, Germany)로 촬영하였다.
- , Foster City, CA)을 실시하였다. 이때 사용한 모든 Primer는 마크로젠(M acrogen, KOREA)에서 제작 및 구입하여 사용하였으며, 사용된 primer sequence는 Table 1에 제시되었다. 모든 샘플은 3회 반복 실험하여 합성시킨 cDNA를 2회 이상 반복 측정하였다.
데이터처리
- IGF-I 처리에 따른 C2C12 세포에서의 FABPpm mRNA 발현의 유의성 검증을 위하여 SPSS 18.0 for window를 이용하여 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였다(p<0.05).
이론/모형
- RNA 추출은 TRIzol 용액(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용한 phenol-chloroform 기법을 사용하였다. TRIzol 용액을 well 당 각 600 μl 씩 넣고, 150 μl의 chloro- form을 처리하여 섞어준 뒤 4℃, 13, 000 rpm에서 15분간 원심분리를 하였다.
성능/효과
- C2C12 골격근 세포가 myotube로 분화하는데 있어 FABPpm 유전자의 mRNA 발현에 어떠한 변화가 나타나는지 측정해본 결과, Fig. 1A와 같이 FABPpm이 시간 의존적으로증가되었음을 알 수 있었다. Myotube로 분화를 유도한지 24 시간을 기준으로 보았을 때, 48시간 동안 분화를 유도한 경우 FABPpm의 mRNA 발현이 약 7%, 72시간 동안 분화시킨 경우 약 96% 가량 증가하였으나 통계적으로 유의하지 않으며, 96시간이 경과하였을 때는 약 262% 유의하게 증가하였다.
- 1A와 같이 FABPpm이 시간 의존적으로증가되었음을 알 수 있었다. Myotube로 분화를 유도한지 24 시간을 기준으로 보았을 때, 48시간 동안 분화를 유도한 경우 FABPpm의 mRNA 발현이 약 7%, 72시간 동안 분화시킨 경우 약 96% 가량 증가하였으나 통계적으로 유의하지 않으며, 96시간이 경과하였을 때는 약 262% 유의하게 증가하였다. 한편, 시간 별(24, 48, 72, 96시간)로 IGF-Ⅰ20 ng/ml를 처리한 결과, 제시된 Fig.
- 이를 위해 24, 48, 72, 그리고 96시간 동안 분화배지로 분화를 유도하였고, 분화를 유도하는 과정에서 20 ng/ml의 IGF-I을 처리하여 면역 형광 염색(immuno-cytochemistry)을 실시하였다. 그 결과, Fig. 2에 제시된 바와 같이 24시간 동안 분화배지와 IGF-I을 각각 처리한 두 조건에서는 모두 완벽한 myotube의 형태가 아닌 근원세포에 가까운 형태로 관찰되었다. 그러나 IGF-I을 처리하였을 때는 처리하지 않은 조건에 비해 myotube를 형성하기 시작하는 형태를 보였으며, 더욱 많은 수의 근원세포와 두드러진 FABPpm의 발현 관찰할 수 있었다.
- 2에 제시된 바와 같이 24시간 동안 분화배지와 IGF-I을 각각 처리한 두 조건에서는 모두 완벽한 myotube의 형태가 아닌 근원세포에 가까운 형태로 관찰되었다. 그러나 IGF-I을 처리하였을 때는 처리하지 않은 조건에 비해 myotube를 형성하기 시작하는 형태를 보였으며, 더욱 많은 수의 근원세포와 두드러진 FABPpm의 발현 관찰할 수 있었다. 동일한 조건으로 24시간을 더 관찰한 결과, 48시간이 지난 후에는 IGF-I을 처리한 조건에서 더욱 선명한 형태의 myotube를 볼 수 있었으며, FABPpm 단백질이 증가된 것을 관찰할 수 있었다.
- 동일한 조건으로 24시간을 더 관찰한 결과, 48시간이 지난 후에는 IGF-I을 처리한 조건에서 더욱 선명한 형태의 myotube를 볼 수 있었으며, FABPpm 단백질이 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 더 나아가 72시간이 지나자, IGF-I을 처리한 경우 더욱 굵고 선명한 형태의 my-otube를 관찰할 수 있었고, 전반적으로 더욱 증가된 FABPpm 단백질을 확인할 수 있었다. 반면, 96시간이 지나자 그림에서처럼 IGF-I을 처리한 조건에서 처리하지 않은 조건에 비해 선명하지 못한 myotube의 형태와 FABPpm 단백질을 관찰 할 수 있었다.
- 그러나 IGF-I을 처리하였을 때는 처리하지 않은 조건에 비해 myotube를 형성하기 시작하는 형태를 보였으며, 더욱 많은 수의 근원세포와 두드러진 FABPpm의 발현 관찰할 수 있었다. 동일한 조건으로 24시간을 더 관찰한 결과, 48시간이 지난 후에는 IGF-I을 처리한 조건에서 더욱 선명한 형태의 myotube를 볼 수 있었으며, FABPpm 단백질이 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 더 나아가 72시간이 지나자, IGF-I을 처리한 경우 더욱 굵고 선명한 형태의 my-otube를 관찰할 수 있었고, 전반적으로 더욱 증가된 FABPpm 단백질을 확인할 수 있었다.
- 더 나아가 72시간이 지나자, IGF-I을 처리한 경우 더욱 굵고 선명한 형태의 my-otube를 관찰할 수 있었고, 전반적으로 더욱 증가된 FABPpm 단백질을 확인할 수 있었다. 반면, 96시간이 지나자 그림에서처럼 IGF-I을 처리한 조건에서 처리하지 않은 조건에 비해 선명하지 못한 myotube의 형태와 FABPpm 단백질을 관찰 할 수 있었다. 이와 같이 C2C12 골격근 세포의 분화 과정에 있어 IGF-Ie 전체적인 FABPpm의 발현을 증가시키고, 특히 my- otube를 형성하는 과정에서 FABPpm 발현을 더욱 증가시키는 것을 알 수 있었다.
- 증가시키는 영향을 미친다고 알려져 있다. 본 연구에서는 IGF-I이 C2C12 골격근 세포의 myotube 형성 과정에서두 유전자의 단백질 발현을 증가시키는 것은 확인할 수 있었으나, 세포막으로의 이동은 확인할 수 없었다. IGF-I에 의해 FABPpm의 발현은 증가하였으나 세포막으로의 이동에는 또 다른 인자들이 작용하였을 것으로 추측된다.
- 1B과 같이, IGF-Ⅰ을 처리하지 않고 분화를 유도하였을 때와 달리 시간에 따른 일정한 결과를 얻을 수 없었다. 분화배지와 IGF-Ⅰ처리를 한 후, 시간 별로 비교하였을 때 24 시간이 지났을 때는 약 130%(Fig. 1C), 48시간이 경과하자 약 179%로 유의하게 증가하였다(Fig. 1D). 72시간이 경과한 경우 약 12% 가량 증가하였으나 통계적으로 유의하지 않았다(Fig.
- 이와 마찬가지로 또 다른 에너지 대사 시스템 인 지방 대사 시스템에 있어 LCFA의 저장 및 운반, 사용 등은 에너지 생성 및 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 뿐만 아니라 LCFA 저장 및 사용 불균형은 비만과 당뇨, 심혈관 질환 등의 질병을 초래하는 것으로 알려졌다. 따라서 지방산 수송체가 지방산을 저장하고, 운반하는 기전을 밝히고자 하는 연구들이 활발히 이루어지고 있다.
- 반면, 96시간이 지나자 그림에서처럼 IGF-I을 처리한 조건에서 처리하지 않은 조건에 비해 선명하지 못한 myotube의 형태와 FABPpm 단백질을 관찰 할 수 있었다. 이와 같이 C2C12 골격근 세포의 분화 과정에 있어 IGF-Ie 전체적인 FABPpm의 발현을 증가시키고, 특히 my- otube를 형성하는 과정에서 FABPpm 발현을 더욱 증가시키는 것을 알 수 있었다.
- 첫째로, C2C12 골격근 세포의 분화 과정에 있어 FABPpm 의 mRNA 발현이 myotube로 분화함에 따라 증가하는 것을 확인하였다. 이전까지의 선행연구에서는 근육조직에서 지방산 수송에 관여하는 유전자의 발현과 세포 내에서의 이동, 지방산 저장 및 산화 메커니즘에 연구가 집중되어왔다.
후속연구
- 이러한 결과들을 바탕으로 운동에 의한 지방산 수송체 증가는 지방 산화 능력 증가와 함께 지방산흡수 및 저장능력도 증가시키는 것으로 볼 수 있다. 이러한 선행 연구 결과들을 바탕으로 차후 운동에 의한 IGF-I의 증가가 FABPpm의 발현을 증가 시키는데 있어 지방산 흡수 및 저장과 산화 증가에 협력하는 역할을 하는 다른 인자들과의 상호작용에 대한 연구가 함께 진행되어야 할 것이다.
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