세포대사 기능 분석을 위한 광학센서 기반 용존산소와 pH 측정 시스템의 제작 및 특성 분석 Characteristics and Fabrication of Dissolved Oxygen and pH Measurement System based on the Optical Sensor for Analysis of Cell Metabolic Functions원문보기
This study evaluates the performance of an optical sensor and measurement system (CMA-24) which can analyze the fluctuation of dissolved oxygen and pH simultaneously. In the optical sensor system, the fluorescent materials, Rudpp and HPTS which are sensitive to dissolved oxygen and pH, respectively,...
This study evaluates the performance of an optical sensor and measurement system (CMA-24) which can analyze the fluctuation of dissolved oxygen and pH simultaneously. In the optical sensor system, the fluorescent materials, Rudpp and HPTS which are sensitive to dissolved oxygen and pH, respectively, are coated on the bottom of a 24-well -plate by the sol-gel technology. The detection times of the emission light of the oxygen sensor were $4,186{\pm}13.90{\mu}s$ and $4,452{\pm}36.68{\mu}s$ for the dissolved oxygen of 17% $O_2$ and 7.6% $O_2$, respectively. On the other hand, the detection times of the pH sensor were $6,699.43{\pm}14.64{\mu}s$, $6,722.24{\pm}6.21{\mu}s$, and $6,748.52{\pm}2.63{\mu}s$ using pH 6, 7, and 8, respectively. When we determined cellular respiration levels of C2C12 myocytes with CMA-24, $O_2$/pH measurement system, the ratio of the uncoupled to coupled OCR (oxygen consumption rate) was 1.41. The results mean that this CMA-24 system shows almost the same sensitiveness as the commercial system.
This study evaluates the performance of an optical sensor and measurement system (CMA-24) which can analyze the fluctuation of dissolved oxygen and pH simultaneously. In the optical sensor system, the fluorescent materials, Rudpp and HPTS which are sensitive to dissolved oxygen and pH, respectively, are coated on the bottom of a 24-well -plate by the sol-gel technology. The detection times of the emission light of the oxygen sensor were $4,186{\pm}13.90{\mu}s$ and $4,452{\pm}36.68{\mu}s$ for the dissolved oxygen of 17% $O_2$ and 7.6% $O_2$, respectively. On the other hand, the detection times of the pH sensor were $6,699.43{\pm}14.64{\mu}s$, $6,722.24{\pm}6.21{\mu}s$, and $6,748.52{\pm}2.63{\mu}s$ using pH 6, 7, and 8, respectively. When we determined cellular respiration levels of C2C12 myocytes with CMA-24, $O_2$/pH measurement system, the ratio of the uncoupled to coupled OCR (oxygen consumption rate) was 1.41. The results mean that this CMA-24 system shows almost the same sensitiveness as the commercial system.
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문제 정의
본 연구에서는 세포대사 기능분석을 위하여 광학센서를 기반으로 하는 용존산소와 pH를 동시에 감지할 수 있는 고감도 통합센서 CMA-24를 개발하고 측정 시스템을 제작하였다.
본 연구에서는 세포대사 기능의 지표가 되는 용존산소 및 pH에 대하여 높은 측정 분해능을 가지는 통합형 광학센서를 제작했고 실시간 동시 측정이 가능한 측정시스템을 개발했다.
제안 방법
개발된 측정시스템에 대한 성능평가는 저농도 산소용액과 표준 pH시약을 이용하여 용존산소 측정센서와 pH센서의 검출성능을 먼저 확인하고 최종적으로 실제 세포를 대상으로 세포 호흡량 측정시험을 수행하였다. 또한, 상용화 제품의 측정 데이터와 비교하여 개발 시스템의 세포 실험 적용 가능성을 간접적으로 확인하였다.
그림에서 보는 바와 같이 48개의 여기 LED, 포토다이오드, 그리고 격벽(optical barrier)으로 구성되어있다. 격벽은 LED와 포토다이오드 간 광 간섭을 최소화하여 정확한 측정이 이루어지도록 설계되었다.
그림에서 우측에 도포된 반원은 용존산소 검출용 형광센서이며, 좌측에 도포된 반원은 pH 검출용 형광센서이다. 분할형 형광센서막의 제작을 위해서 용존산소 센서막의경우, MTMS(methyl trimethoxy silane) 졸-겔용액(MTMS : EtOH : H2O : HCl = 3.97 mL : 1.84 mL : 0.72 mL : 18 ml)에 Rudpp 30 mg/ml를 넣어 정량화하였고, pH 검출용 센서막의 경우, GPTM(3-glycidoxypropyl trimethoxy silane)-APTMS(3- aminopropyl trimethoxy silane) 졸-겔 용액 (GPTMS : APTMS :Et-OH : 3DW : HCl = 1.25 ml : 625 ml : 2.708 ml : 5.417 ml :400 ml)에 HPTS를 30 mg/ml를 넣어 정량화한 다음 4시간 동안 교반하여 센서 도포용 용액을 각각 제조했다.
이 광량의 변화는 포토다이오드에서 검출되는 파형의 폭에 비례하므로 파형의 폭을 시간(µs 단위)으로 측정하였다.
제작된 시스템과 상용화된 제품의 간접적 성능비교 평가를 위해 두 측정시스템에서 측정된 세포 호흡량 데이터를 이용하여 uncoupled OCR과 coupled OCR의 비(ratio)를 계산하고 그 차이를 비교했다. 그 결과, 개발 시스템은 1.
측정시스템은 검출센서간 간섭을 최소화하고 정밀한 측정이 가능하도록 신호처리 회로를 자체 개발하고, 분할형 형광센서막이 고정화된 마이크로 플레이트 상에서 용존산소와 pH를 동시에 측정할 수 있도록 제작되었다.
대상 데이터
Uncoupled OCR을 측정하기 위한 uncoupler로 FCCP(carbonylcyanide p-trifluoroume thoxyphenyl hydrazine)가 사용되었다.
개발시스템을 이용한 세포 호흡량 측정에 사용한 세포는 마우스 근육세포인 C2C12(ATTC, USA)이다. 세포는 미토콘드리아에서 산소를 소모하는 전자전달계와 ATP 합성효소가 couple 된 산화적 인산화 과정을 통해 ATP를 합성한다.
4는 방출 광을 분석하기 위한 신호처리 센서보드를 나타낸 것이다. 그림에서 보는 바와 같이 48개의 여기 LED, 포토다이오드, 그리고 격벽(optical barrier)으로 구성되어있다. 격벽은 LED와 포토다이오드 간 광 간섭을 최소화하여 정확한 측정이 이루어지도록 설계되었다.
용존산소 검출을 목적으로 사용된 형광물질은 루테늄 복합체, Rudpp(tris(4,7–diphenyl-1,10-phenanthroline) ruthenium(II))이다.
3은 광학센서 기반 용존산소와 pH 측정 시스템의 전체 구성도를 나타낸 것이다. 측정 시스템은 센서보드, 온도제어 장치, 형광 마이크로 플레이트 이송장치, 약물 정량제어 및 자동 주입 장치 및 제어 패널 PC로 구성되어 있다.
이론/모형
앞서 기술한 각각의 형광물질은 졸-겔 법을 이용하여 24-웰 마이크로 플레이트 바닥 면에 2분할하여 고정화되었다. 졸-겔 기법은 광학식 센서 분야에서 효소나 형광염료의 고정화를 위해 널리 사용되는 방식이며, 고정화 후 장기간 사용이 가능하고 형광염료의 활성저하 현상을 감소시켜 정밀도를 증가시키는 장점이 있다[11,12].
성능/효과
8 에서 나타난 바와 같이 세포의 산소소모를 가속화 하기 위해 측정시작 후 30분 되는 시점에 FCCP 약물 10 µM을 주입했다. FCCP 약물을 투여한 후 35분부터 55분까지 세포의 산소소모가 증가하는 uncoupled OCR이 나타남을 알 수가 있다.
pH 6, 7, 그리고 8에 대하여 24- 웰 평균과 표준편차는 각각 6,699.43 ± 14.64 µs, 6,722.24 ±6.21 µs, 6,748.52 ± 2.63 µs로 나타났다.
제작된 시스템과 상용화된 제품의 간접적 성능비교 평가를 위해 두 측정시스템에서 측정된 세포 호흡량 데이터를 이용하여 uncoupled OCR과 coupled OCR의 비(ratio)를 계산하고 그 차이를 비교했다. 그 결과, 개발 시스템은 1.41, 상용화된 제품은 1.44으로 나타났으며, 약 0.03의 차이를 보였다. 이 결과는 두 시스템의 측정방법, 측정 세포 수, 측정 오차, 그리고 측정 그룹웰 등의 차이를 고려할 때 제작된 시스템이 상용화된 제품의 측정 수준과 유사함을 보여준다.
그림에서 보는 바와 같이 본 연구의 세포 호흡량 측정에 사용된 동일한 FCCP 약물용량인 10 µM에서 상용화 제품의 coupled OCR과 uncoupled OCR은 175±40 pmole/min, 252±145 pmole/ min 정도로 나타났다. 그리고 약물 주입 후 OCR의 측정오차가 크게 나타나는 특성을 보였다.
개발된 측정시스템에 대한 성능평가는 저농도 산소용액과 표준 pH시약을 이용하여 용존산소 측정센서와 pH센서의 검출성능을 먼저 확인하고 최종적으로 실제 세포를 대상으로 세포 호흡량 측정시험을 수행하였다. 또한, 상용화 제품의 측정 데이터와 비교하여 개발 시스템의 세포 실험 적용 가능성을 간접적으로 확인하였다.
산소농도 17%를 사용했을 경우 산소 형광센서막으로부터 방출된 광량의 검출시간은 24-웰 평균 4,186 µs로 측정되었고, 표준편차는 ±13.90 µs이었다.
산소농도 7.6%와 17%를 통해 측정한 방출 광의 검출시간 차이는 226 µs정도로 나타났으며, 분해능은 0.03 %이다.
03의 차이를 보였다. 이 결과는 두 시스템의 측정방법, 측정 세포 수, 측정 오차, 그리고 측정 그룹웰 등의 차이를 고려할 때 제작된 시스템이 상용화된 제품의 측정 수준과 유사함을 보여준다.
05 pmole/min까지 선형적으로 증가함을 알 수가 있었다. 이 결과로써 FCCP 약물이 잘 작용했음을 확인할 수 있었다.
제작된 광학센서의 성능평가를 위하여 용존산소량과 pH 변화에 대한 센서의 반응도를 측정한 결과, 산소농도 10% 정도의 변화에 대해 방출 광 검출시간의 차이가 226 µs 정도 나타났고, pH 1의 변화에 20 µs 이상의 차이를 보였다.
제작된 측정 시스템의 성능평가를 위하여 약물을 이용한 세포 호흡량 변화를 측정한 결과에서 coupled OCR과 uncoupled OCR 영역에서의 측정값 차이가 최소 25.3 pmole/min에서 최대 46.7 pmole/min로 나타났으며, 이 값은 상용화된 제품과 대등한 수준임을 확인할 수 있었다.
후속연구
따라서, 미토콘드리아 전자전달계에서 소모되는 산소량과 pH 변화는 미토콘드리아의 기능을 판단할 수 있는 중요한 척도이며, 대사증후군의 진단 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다. 따라서, 이러한 측면에서 세포를 대상으로 한 용존산소량과 pH 변화를 정확하게 측정할 수 있는 고감도의 센서개발이 지속적으로 요구되어 왔다.
제작된 시스템은 향후 형광염료 도포공정과 LED 및 포토다이오드의 위치 최적화를 통해 측정오차를 개선하고 재현성을 확보한다면 세포 생리학 연구, 신약물질의 독성과 효능연구, 대사 질환 연구 등 다양한 분야에서 유용한 세포대사 분석 시스템으로 활용될 것으로 기대된다.
향후, 형광염료의 도포공정 개선과 포토다이오드의 위치 최적화를 통해 보다 높은 측정 재현성과 낮은 측정오차의 특성을 가진 시스템으로 개선할 수 있을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
전기화학식 용존산소 검출 센서는 어떤 방식인가?
용존산소 검출센서는 크게 전기화학식과 광학식으로 구분할수 있다. 전기화학식은 전류전극법을 이용하는 것으로 전해질 내에 있는 전극에 일정 전위를 인가한 상태에서 선택적 투과막을 통해 확산된 용존산소가 전극 표면에서 화학반응의 결과로 발생하는 전류를 측정하는 방식이다. 이 방식은 시료 내의 용존산소량을 정확히 측정할 수 있는 장점이 있어 널리 사용되는 반면, 선택적 투과막을 통해 확산되는 산소량에 의존적이고 정밀한 분석을 위해서는 화학반응이 일어나는 전극에 충분한 시료의 공급이 필요하다.
용존산소 검출센서는 어떻게 분류할 수 있는가?
용존산소 검출센서는 크게 전기화학식과 광학식으로 구분할수 있다. 전기화학식은 전류전극법을 이용하는 것으로 전해질 내에 있는 전극에 일정 전위를 인가한 상태에서 선택적 투과막을 통해 확산된 용존산소가 전극 표면에서 화학반응의 결과로 발생하는 전류를 측정하는 방식이다.
용존산소가 세포의 활성상태를 입증하는 중요한 요소인 이유는?
산소와 수소이온 농도는 세포대사 기능 및 미토콘드리아 활성도의 중요한 지표 중 하나이다. 용존산소로 호흡하는 세포는 손상되면 대사기능 저하로 더 적은 양의 산소를 소모한다. 죽은 세포는 더 이상 용존산소를 소모하지 않으므로 용존산소량은 감소하지 않는다. 결국, 용존산소는 세포의 활성상태를 입증하는 중요한 요소이다[1].
참고문헌 (12)
A. Niazi and C. J. Anthony, "Development of oxygen sensor by integrating the low cost printed circuit board technology and solid electrolyte membrane", Proc. Of ICBES, p.137, Prague, Czech, 2014.
E. Gnaiger, Drug-Induced Mitochondiral Dysfunction, John Wiley & Sons, New York, pp. 327-352, 2008.
H. K. Lee, Y. M. Cho, Y. Y. Lee, and Y. K. Pak, "Mitochondria-based model for fetal origin of adult disease and insulin resistance", Ann. N. Y. Acad Sci., Vol. 1042, pp. 1-18, 2005.
J. Goicoechea, C. R. Zamarreno, I. R. Matias, and F. J. Arregui, "Optical fiber pH Sensor based on layer-by-layer electrostatic self-assembled neutral red", Sens. Actuators B, Vol. 132, pp. 305-311, 2008.
C. Mcdoagh, C. Kolle, A. K. Mcevoy, D. L. Dowling, A. A. Cafolla, S. J. Cullen, B. D. Maccraith, "Phase fluorometric dissolved oxygen sensor", Sens. Actuators B,, Vol. 74, pp. 124-127, 2001.
G. O'keeefe, B. D. Maccraith, A. K. Mcevoy, C. Mcdonagh, and J. F. Mcgilp, "Development of a led-based phase fluorimetric oxygen sensor using evanescent wave excitation of a sol-gel immobilized dye", Sens. Actuators, Vol. 29, pp. 226-230, 1995.
G. Holst, R. N. Glud, M. Kuhl, and I. Klimant, "A microoptode array for fine-scale measurement of oxygen distribution", Sens. Actuators, Vol. 29, pp. 123-129, 1997.
D. Wencel, C. Higgins, A. Klukowska, B. D. Maccraith, and C. Mcdonagh, "Novel sol-gel derived films for luminescence-based oxygen and pH sensing", Materials Science-Poland, Vol. 25, No. 3, pp. 768-770, 2007.
D. A. Nivens, Y. Zhang, and S. M. Angel, "A fiber-optic pH sensor prepared using a base-catalyzed organo-silica solgel", Anal. Chim. Acta., Vol. 376, pp. 235-245, 1998.
O. B. Miled, H. B. Ouada, and J. Livage, "pH sensor based on a detection sol-gel layer onto optical fiber", Mater. Sci. Eng. C, Vol. 21, pp. 183-188, 2002.
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