[논문]넙치에 기생하는 쿠도아 점액포자충(Kudoa septempunctata) 의 활성 확인을 위한 염색법의 비교

도정완; 문선화; 김민지; 조미영; 정승희; 이남실

doi:10.13000/jfmse.2016.28.6.1822

넙치에 기생하는 쿠도아 점액포자충(Kudoa septempunctata) 의 활성 확인을 위한 염색법의 비교
A Distinguishing Staining Methods for Vitality of Kudoa (Kudoa septempunctata) spores in Muscle of Olive flounder (Paralichthys olivaceus) 원문보기

水産海洋敎育硏究 = Journal of fisheries and marine sciences education, v.28 no.6 = no.84, 2016년, pp.1822 - 1827

도정완 (국립수산과학원 병리연구과) , 문선화 (국립수산과학원 병리연구과) , 김민지 (국립수산과학원 병리연구과) , 조미영 (국립수산과학원 병리연구과) , 정승희 (국립수산과학원 병리연구과) , 이남실 (국립수산과학원 병리연구과)

Abstract ▼ AI-Helper

Consumption of Paralichthys olivaceus in raw fish have been reported as the cause of outbreaks of food-born illness, and Kudoa septempunctata in muscle of Paralichtys olivaceus was suggested with the causative agent. For this reason, distinguish of vital and dead spore is important to study survivability of Kudoa septempunctata in human intestinal condition and in vitro inactivation of Kudoa septempunctata. In this reports, we suggest NR & MB (Neutral red and Methylene blue) staining method that is easier and simpler than the previously described HO & PI (Hoechst33342 and Propidium iodide) method according to a experimental condition.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

2016). 본 방법은 형광현미경을 통하여 확인 가능한 방법으로 결과의 정확도는 높으나 실험적 환경이 그에 적합하지 않을 때, 즉 형광현미경과 같은 관찰에 필요한 장비가 갖추어져 있지 않은 상황에서 확인할 수 있는 방법이 없어 일반적으로 사용하는 광학현미경을 이용할 수 있는 방법을 모색하던 중 Neutral red와 Methylene blue를 혼합하여 사용한 염색법(Freshney R 1987; Georges K 1935)이 실용성이 있어 본 방법에 대한 유용성을 알아보고자 하였다.

제안 방법

HO & PI법은 Hoechst33342(Sigma)는 28µg/1㎖, Propidiumiodide(Sigma)는 1µg/㎖ 로 상온에서는 30분, 35℃에서는 15분 반응시켜 형광현미경(Axio Imager, Zeiss)으로 관찰하였다.
NR & MB(Neutral red & Methylene blue)염색법은 0.05% neutral red액과 0.05% methylene blue액을 1:1로 섞어 이액을 포자액과 다시 1:1로 35℃, 10분간 반응시켜 관찰하였다.
Trypan blue는 0.4% trypane blue stain (Gibco)액을 사용하여 포자액과 염색액을 5:1의 비율로 상온 또는 30℃에서 10~15분간 반응시켜 관찰하였다. NR & MB(Neutral red & Methylene blue)염색법은 0.
본 보고에서는 live cell과 dead cell을 간단히 구분하는 trypan blue 염색법과 vital staining법의 한가지인 Neutral red 염색의 변형인 Neutral red 와 Methylene blue를 혼합하여 사용하는 염색법(이후 NR & MB 염색법), 그리고 이미 쿠도아 점액포자충의 활성을 확인하는 방법으로 사용되고 있는 Hoechst33342 & Propidium iodide법(이후 HO & PI 법)을 비교하였다.

대상 데이터

실험에 사용한 감염어는 쿠도아 진단 매뉴얼의 Live검사법에 따라(쿠도아 진단 매뉴얼, 2014) 근육 1g 당 10⁶개의 Kudoa septempunctata 포자를 가진 것으로 확인 된 감염넙치(체중 약 500g)를 실험실로 이송하여 근육부분만 채취하여 실험에 사용하였다. 이전 쿠도아포자충의 특성에 관한 연구보고(MAFF, 2016)와 실험실내 사전실험 결과를 바탕으로 활성을 가진 live 쿠도아 점액포자충은 이송 즉시 혹은 냉장보관 24시간 이내에, 그리고 비활성포자인 dead 쿠도아 점액포자충은 초저온(-80℃) 냉동하여 24시간이 지난 근육을 균질화 하였다.

이론/모형

Methylene blue 단염색의 경우도 세포 배양 시 세포성장의 관찰과 세포의 계수에 더 민감하고 유용하다는 보고도 있지만 살아있는 세포와 죽은세포의 구분에는 Neutral red 염색법이 이점을 가지는 점에서(Elliott W M and Auersperg N 1993) Neutral red와 Methylene blue를 함께 사용하는 NR & MB 염색법을 활용하였다.

성능/효과

5~7개의 극낭을 가지는 Kudoa septempunctata의 경우 활성을 가지는 포자는 극낭이 모두 자주색 혹은 보라색으로 염색되어 관찰되는데, 경우에 따라 한 개 포자의 5~7개 극낭 중에서 염색되는 극낭과 염색이 되지 않는 극낭이 관찰되어 포자의 활성도를 염색된 극낭의 개수로도 짐작할 수 있을 것으로 사료되었다.
또한 활성세포의 구분에 있어서도 HO & PI에서의 반응성과 큰 차이를 확인할 수 없을 정도로 활성과 비활성 쿠도아의 구분에 좋은 결과를 나타내었다.
Methylene blue 단염색의 경우도 세포 배양 시 세포성장의 관찰과 세포의 계수에 더 민감하고 유용하다는 보고도 있지만 살아있는 세포와 죽은세포의 구분에는 Neutral red 염색법이 이점을 가지는 점에서(Elliott W M and Auersperg N 1993) Neutral red와 Methylene blue를 함께 사용하는 NR & MB 염색법을 활용하였다. 본 방법은 포자의 극낭을 자주색으로 염색시켜 가시적으로 뚜렷한 염색상을 나타내어 광학현미경상의 관찰에 매우 유용하였다. 다양한 배율에서 포자의 형태적 관찰에도 용이하여, 한 번의 염색으로 한 시야에서 포자의 활성유무와 형태관찰에 모두 활용할 수 있다는 점에서 편리하다.
이에 반해 NR & MB 염색을 실시한 쿠도아 포자는 활성을 가진 경우는 포자의 극낭에 자색 혹은 보라색의 진한 염색성이 뚜렷하게 관찰되며 비활성 포자의 경우는 극낭에 염색성을 나타내지 않는 것으로 관찰되었다 [Fig. 1].
HO & PI법을 실시한 경우, 활성을 가진 쿠도아 점액포자충은 Hoechst33342와 결합하여 푸른색으로 형광반응이 뚜렷하게 나타나지만, 같은 관찰상에서 붉은색으로 관찰되는 Propidiumiodide에는 형광반응을 나타내지 않았다. 이에 반해 비활성 포자의 경우 푸른색의 형광반응과 붉은색의 형광반응이 거의 동일한 포자에서 모두 반응하는 것을 확인할 수 있었다 [Fig. 2].
2016), 실험환경에 따라 이러한 편리한 실험기기들이 모든 연구시설에 갖추어져 있는 것은 아니며 소량의 시료들을 간편한 방법으로 처리하여 광학현미경을 이용하여 확인할 수 있는 방법이 요구되었다. 이에 세포의 활성유무를 확인하는데 사용되는 몇 가지 염색법을 쿠도아 점액포자충에 적용해 본 결과, trypan blue 염색의 경우 비활성 포자에 염색성을 가지기는 하지만 그 반응성이 약하여 활성포자와의 광학현미경적 구분이 명확하지 않았다. Neutral red 염색은 활성세포의 lysosomes에 결합하여 선택적으로 염색성을 나타내어 세포의 활성 및 독성 평가에 활용도가 높은 염색법으로 이미 잘 알려져 있지만(Guillermo R et al.

후속연구

간단한 염색법을 통하여 형광염색을 위한 시약과 형광현미경 없이도 활성포자와 비활성포자를 구분할 수 있다는 것은 쿠도아 점액포자충의 연구를 매우 편리하게 해 줄 것으로 보이며, 이 후, 활성포자와 비활성포자의 비율적인 구분을 두거나, 포자액의 액성(pH 등)에 따라 NR & MB 염색과 HO & PI 법을 동시에 실시하여 계수를 통하여 염색성의 차이를 명확하게 나타낼 수 있도록 추가적인 확인이 필요할 것으로 보이며, 쿠도아 포자충의 생활사와 관련하여 형태적인 연구에 필요한 다양한 염색법에 관한 고찰이 이루어져야 할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Kudoa septempunctata이란?	Kudoa septempunctata는 점액포자충(myxozoa)의 일종으로 5~7개의 극낭을 가지는 포자(spore)의 형태로 넙치(Paralichthys olivaceus)의 근육에 분포하면서 육안적으로 관찰 가능한 시스트를 형성하지 않고 넙치에서는 외관상 병적 증상을 나타내지 않는 Kudoa sp.의 신종으로 보고되었으며, 그 유전형에 관한 연구도 활발하게 진행되고 있다(Matsukane Y et al. 2010; Sugita-Konishi Y et al, 2015; Takeuchi F et al, 2016).
	K. septempunctata로 인한 증상의 원인은?	쿠도아 점액포자충의 생활사는 아직 명확히 밝혀져 있지 않지만 알려진 다른 쿠도아 점액포자충과 유사할 것으로 판단되며(El-Matbouli M and Hoffmann RW 1998; Yokoyama H 2004), K. septempunctata의 경우 넙치 근육 내 다량의 포자(spores) 형태로 존재하는 단계에서 넙치를 회와 같은 날것으로 섭취했을 때 설사, 구토 및 복통 등의 식중독 증상을 일으키며, 이것은 쿠도아 점액포자충이 살아있는 상태에서 장내 도달했을 때 나타나는 현상일 것으로 추정하고 있다. 보고에 따르면 K.
	Kudoa septempunctata로 인해 논란이 된 내용은?	2010; Sugita-Konishi Y et al, 2015; Takeuchi F et al, 2016). 본 종에 대한 논란은 2011년 6월 공식적으로 설사, 복통 등의 유증사례의 원인으로 본 충에 감염된 넙치회를 언급한 이후(Kawai T et al. 2012), 넙치의 양식과 소비가 활발한 일본과 한국에서 다양한 연구가 이루어지고 있으며(Kawai T et al. 2012; Iwashita Y 2013; Sugita-Konishi Y et al. 2014; Song Jun-Young et al. 2013; 2014; Kim Wi Sik et al. 2015; Yokoyma H et al. 2015), 일본 내에서 발생하는 식중독 사례 중 매년 50건 이상이 쿠도아 점액포자충에 감염된 넙치를 날것으로 섭취한 이후 발생하였음을 보고하고 있어(Ministy of Health, Labour and Welfare, Japan 2016) 식중독과 관련하여 식품안전상의 위해성 유무에 관해 논란이 되고 있다.

참고문헌 (25)

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