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문제 정의
- 식물화학적 성분과 약리 활성에 관한 연구가 거의 이루어지지 않은 누리장나무 꽃의 함유 성분과 그 효능을 밝히기 위해 연구를 진행하였고 먼저 7종의 flavonoid 성분과 항산화 효능을 보고하였다.21) 계속적으로 성분 및 효능을 규명하기 위해 누리장나무 꽃 MeOH 추출물의 EtOAc 분획을 대상으로 silica gel, Sephadex LH-20 및 RP-18 column chromatography를 반복 실시하고, 일부 분획은 HPLC 또는 recycling HPLC에 적용하여 5종의 배당체 성분을 분리하였다.
제안 방법
- − 1H-NMR 및 13C-NMR spectra는 Varian Unity INOVA 500 spectrometer로 측정하였고, ESI-MS는 Agilent 1100LC/MSD trap classic을 이용하였다.
- 21) 계속적으로 성분 및 효능을 규명하기 위해 누리장나무 꽃 MeOH 추출물의 EtOAc 분획을 대상으로 silica gel, Sephadex LH-20 및 RP-18 column chromatography를 반복 실시하고, 일부 분획은 HPLC 또는 recycling HPLC에 적용하여 5종의 배당체 성분을 분리하였다.
- DPPH를 0.1 mM이 되도록 MeOH에 용해하고, 96 well plate에 각 농도의 시료 용액 100 μl와 DPPH용액 100 μl혼합액, 시료용액 100 μl에 MeOH 100 μl만 가한 액, DPPH 용액 100 μl와 MeOH 100 μl의 혼액, 및 200 μl MeOH를 각각 만들고 25℃에서 10분간 반응시킨 후 540 nm에서 microplate reader(EL808 Ultra Microplate Reader, BIO-TEK) 로 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 결정하였다.
- EtOAc 분획물을 CH2Cl2: MeOH:H2O(50:10:1, 40:10:1) 혼합용매의 silica gel column(40×6 cm)에 적용하여 6개의 소분획(E1~E6)으로 나누었고, 소분획 E5로부터 화합물 1(4.85 g)을 얻었다.
- HPLC는 Knauer Smartline system [Manager 5000, Pump 1000(x2), UV Detector 2500, Injector, and Column Thermostat 4000]과 Phenomenex Luna 10 μ C18(2) column(250×10 mm)을 사용하였고, recycling HPLC는 JAIGEL-GS310 column(500×20 mm)이 장착된 JAI LC-908 Recycling Preparative HPLC에서 수행하였다.
- 누리장나무 꽃 추출물의 용매분획을 각종 column chromatography에 적용하여 5종의 화합물을 분리하였고, 그 이화학적 특징 및 기기 분석 결과로부터 화학구조를 규명하였다. 분리된 화합물 1~5는 phenylpropanoid glycoside인 acteoside(1), martynoside(2), leucosceptoside A(3), isoacteoside(4)와 monoterpenoid glycoside인 neohancoside A(5)로 각각의 spectral data와 문헌 기재 값과의 비교를 통하여 확정하였다.
- 최종적으로 E3B3 분획을 silica gel column(35×2 cm, CH2Cl2:MeOH:H2O=80:10:1, 60:10:1, 10:10:1)으로 정제하여 화합물 3(21 mg)을 수득하였다. 또한 소분획 E3B4를 reverse phase C-18 HPLC(40% MeOH) 및 JAIGEL GS-310 column이 장착된 recycling HPLC(MeOH only)에 순차적으로 적용하여 화합물 4(9 mg)과 5(7 mg)를 분리하였다.
- 누리장나무 꽃 추출물의 용매분획을 각종 column chromatography에 적용하여 5종의 화합물을 분리하였고, 그 이화학적 특징 및 기기 분석 결과로부터 화학구조를 규명하였다. 분리된 화합물 1~5는 phenylpropanoid glycoside인 acteoside(1), martynoside(2), leucosceptoside A(3), isoacteoside(4)와 monoterpenoid glycoside인 neohancoside A(5)로 각각의 spectral data와 문헌 기재 값과의 비교를 통하여 확정하였다. 분리된 5종의 화합물은 누리장나무 꽃으로부터 처음으로 분리 보고되는 성분이며, 특히 neohancoside A(5) 는 Clerodendrum 속 식물뿐만 아니라 마편초과(Verbenaceae) 의 식물에서도 최초로 분리 보고되는 화합물이다.
- 소분획 E2는 MeOH를 용매로 Sephadex LH-20 column chromatography(70×3 cm)하여 5개의 소분획(E2D~E2E)을 얻었고, 이중 E2B 분획을 reverse phase C-18 column chromatography(25×2.5 cm, 45% MeOH)하여 6개의 소분획(E2B1~E2B6)으로 나누었다.
- 소분획 E3를 40% MeOH 용매로 reverse phase C-18 column chromatography하여 3개의 소분획 (E3A~E3C)를 얻었고, E3B 분획을 Sephadex LH-20 column(70×3 cm, MeOH only)에 통과시켜 4개의 소분획(E3B1~ E3B4)을 얻었다.
- 이상에서 기술한 바와 같이 식물화학적 연구가 거의 이루어지지 않은 누리장나무의 꽃으로부터 계속적인 식물화학적 성분연구를 진행하여 4종의 phenylpropanoid glycoside 와 1종의 monoterpene glycoside 성분을 분리, 확인하였다. 얻어진 모든 화합물은 누리장나무의 꽃에서 처음 분리되었으며, 특히 화합물 5는 Clerodendrum속 뿐만 아니라 마편초과(Verbenaceae)의 식물에서도 최초로 확인되었다.
- 최종적으로 E3B3 분획을 silica gel column(35×2 cm, CH2Cl2:MeOH:H2O=80:10:1, 60:10:1, 10:10:1)으로 정제하여 화합물 3(21 mg)을 수득하였다.
대상 데이터
- − 누리장나무(Clerodendrum trichotomum Thunb.) 꽃은 2007년 8월 경기도 수원에서 채취하여 정확히 감정한 후 사용하였고, 기준표본은 성균관대학교 약학대학에 보관하였다(표본번호: SKKU-Ph-07-23).
- Column chromatography 용 충진제는 Silica gel 60(230~400mesh, Merck), Sephadex LH-20(25~100 μ, Sigma-Aldrich)와 LiChroprep RP-18(40~63 μm, Merck)을 사용하였으며 TLC plate는 TLC Silica gel 60 F254s(Merck)와 TLC Silica gel 60 RP-18 F254s(Merck)을 사용하였다.
- DPPH(2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) 및 L-ascorbic acid는 Sigma-Aldrich 사에서 구입하여 사용하였고 본 실험에서 검액 및 표준액의 제조와 희석에는 MeOH를 사용하였으며 화합물을 MeOH에 일정 농도로 녹이고 각각을 희석하여 최종적으로 100, 50, 10, 5 μg/ml의 4가지 농도로 실험하였다.
이론/모형
- − 분리된 화합물의 항산화 활성은 DPPH free radical scavenging assay법22,23)을 활용하였으며 DPPH solution내 free radical의 소멸에 의한 흡 광도의 변화를 측정하여 확인하였다.
- 30) 누리장나무 또한 각종 약리 활성이 연구되었으며 함유성분인 phenylpropanoid 화합물 및 flavonoid 화합물들의 항산화 활성이 다수 보고되었다.9-11,21) 누리장나무 꽃으로부터 분리된 배당체 화합물 5종의 항산화 활성은 DPPH free radical scavenging assay법을 적용하여 평가하였으며 대조 물질로 L-ascorbic acid를 사용하였다. 화합물 1~5의 항산화 활성을 측정한 결과, 화합물 1~4는 강한 항산화 활성을 보였고, 특히 화합물 1, 3, 4가 대조 물질인 L-ascorbic acid보다 높은 항산화 활성을 나타내었다(Table I).
- 얻어진 모든 화합물은 누리장나무의 꽃에서 처음 분리되었으며, 특히 화합물 5는 Clerodendrum속 뿐만 아니라 마편초과(Verbenaceae)의 식물에서도 최초로 확인되었다. 분리된 화합물의 항산화 활성은 DPPH free radical scavenging assay법으로 확인하였다.
성능/효과
- 1H-NMR spectra에서 나타난 rhamnose의 특징적인 signal(δ 0.97~1.18, J=6.0~6.5 Hz)과 13C-NMR spectra에서 보여주는 12개의 탄소 signal의 chemical shift 값으로부터 2개의 당은 각각 glucose와 rhamnose임을 확인하였다.
- 또한, coupling constant 15.5~16.5 Hz인 한 쌍의 trans olefinic 수소가 나타났고, δ4.33~4.39의 doublet(7.5~8.0 Hz) signal과 δ 5.04~5.22의 broad singlet 또는 doublet(1.5~2.0 Hz) signal은 각각 2개의 특징적인 anomeric proton peak으로 2개의 단당류가 존재함을 알 수 있었다.
- 이상에서 기술한 바와 같이 식물화학적 연구가 거의 이루어지지 않은 누리장나무의 꽃으로부터 계속적인 식물화학적 성분연구를 진행하여 4종의 phenylpropanoid glycoside 와 1종의 monoterpene glycoside 성분을 분리, 확인하였다. 얻어진 모든 화합물은 누리장나무의 꽃에서 처음 분리되었으며, 특히 화합물 5는 Clerodendrum속 뿐만 아니라 마편초과(Verbenaceae)의 식물에서도 최초로 확인되었다. 분리된 화합물의 항산화 활성은 DPPH free radical scavenging assay법으로 확인하였다.
- 이상의 결과로부터 화합물 1~4는 phenylethanoid와 phenylpropanoid, 그리고 glucose와 rhamnose를 포함하는 화합물로 각각의 수소 및 탄소 chemical shift 값과 coupling 양상 그리고 δ 3.80~3.90에 존재하는 methoxy group의 차이로부터 1~4은 각각 acteoside, martynoside, leucosceptoside A 및 isoacteoside임을 알 수 있었고 이들의 spectral data는 문헌 기재 값7,24-26)과 잘 일치 하였다.
- 이상의 결과로부터 화합물 5는 linalyl 3- O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside인 neohancoside A27-29)로 확정하였다.
- 6)으로부터 2개의 당은 glucose와 xylose로 확인하였다. 탄소 10개의 aglycone은 spectral data로부터 linalool임을 알았고 glucose, xylose 및 aglycone의결합 형태는 HMBC를 포함한 2D-NMR data로부터 확인할 수 있었다(Fig. 2). 이상의 결과로부터 화합물 5는 linalyl 3- O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside인 neohancoside A27-29)로 확정하였다.
- 화합물 1~4는 NMR spectra의 signal 들로부터 모두 phenylpropanoid와 phenylethanoid moiety를 가진 배당체 화합물임을 알 수 있었다. 이들 화합물의 1H-NMR spectra는 aromatic 영역에서 6개의 수소 signal을 보여주고 있으며 이는 coupling 양상으로부터 2개의 1,3,4-trisubstituted benzene ring 존재를 확인할 수 있었다.
- 분리된 5종의 화합물은 누리장나무 꽃으로부터 처음으로 분리 보고되는 성분이며, 특히 neohancoside A(5) 는 Clerodendrum 속 식물뿐만 아니라 마편초과(Verbenaceae) 의 식물에서도 최초로 분리 보고되는 화합물이다. 화합물 1~5의 DPPH free radical scavenging assay법을 이용한 항산화 활성 검색 결과, 1~4는 강한 항산화 활성을 나타내었고, 특히 화합물 1, 3, 4는 대조 물질인 L-ascorbic acid보다 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 본 연구에서 분리된 화합물과 항산화 활성 검색 결과로부터 누리장나무의 꽃 또한 약용 자원으로서 높은 가치가 있을 것으로 판단된다.
- 9-11,21) 누리장나무 꽃으로부터 분리된 배당체 화합물 5종의 항산화 활성은 DPPH free radical scavenging assay법을 적용하여 평가하였으며 대조 물질로 L-ascorbic acid를 사용하였다. 화합물 1~5의 항산화 활성을 측정한 결과, 화합물 1~4는 강한 항산화 활성을 보였고, 특히 화합물 1, 3, 4가 대조 물질인 L-ascorbic acid보다 높은 항산화 활성을 나타내었다(Table I).
후속연구
- 화합물 1~5의 DPPH free radical scavenging assay법을 이용한 항산화 활성 검색 결과, 1~4는 강한 항산화 활성을 나타내었고, 특히 화합물 1, 3, 4는 대조 물질인 L-ascorbic acid보다 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 본 연구에서 분리된 화합물과 항산화 활성 검색 결과로부터 누리장나무의 꽃 또한 약용 자원으로서 높은 가치가 있을 것으로 판단된다.
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