전기전도성 고분자 위에 고정된 압타머에 흡착된 테트라브롬페놀프탈레인 에틸 에스테르를 이용한 트롬빈 검출 Thrombin Detection with Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester Adsorbed on Aptamer-attached Conductive Polymer원문보기
새로운 산화환원 표지자를 이용한 압타머 기반의 전기화학적 트롬빈 검출 바이오 센서를 개발하였다. 1차 지방족 아민(primary aliphatic amine) 으로 개질한 압타머를 전기 전도성 고분자 poly-(5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid) (polyTTCA) 층 위에 공유결합을 통해 고정하여 센서 표면을 개질하였다. Tetrabromophenolphthalein ethyl ester (KTBPE)를 압타머와 상호 작용시켜 전기화학적인 산화환원 표지자로 사용하였다. 압타머로 개질한 층 위에 KTBPE의 산화반응을 differential pulse voltammetry (DPV)를 사용하여 조사하였으며, 최종 센서의 특성은 voltammetry, QCM, and ESCA 를 사용하여 조사하였다. KTBEF와 압타머 센서와 반응 후, KTBPE의 산화 피크는 감소하였다. 센서의 선형 동적 범위는 10.0 ~ 100.0 nM 이었으며, 이 때 검출 한계는 $1.0{\pm}0.2nM$이었다.
새로운 산화환원 표지자를 이용한 압타머 기반의 전기화학적 트롬빈 검출 바이오 센서를 개발하였다. 1차 지방족 아민(primary aliphatic amine) 으로 개질한 압타머를 전기 전도성 고분자 poly-(5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid) (polyTTCA) 층 위에 공유결합을 통해 고정하여 센서 표면을 개질하였다. Tetrabromophenolphthalein ethyl ester (KTBPE)를 압타머와 상호 작용시켜 전기화학적인 산화환원 표지자로 사용하였다. 압타머로 개질한 층 위에 KTBPE의 산화반응을 differential pulse voltammetry (DPV)를 사용하여 조사하였으며, 최종 센서의 특성은 voltammetry, QCM, and ESCA 를 사용하여 조사하였다. KTBEF와 압타머 센서와 반응 후, KTBPE의 산화 피크는 감소하였다. 센서의 선형 동적 범위는 10.0 ~ 100.0 nM 이었으며, 이 때 검출 한계는 $1.0{\pm}0.2nM$이었다.
An aptamer-based biosensor using a new redox indicator has been examined for the electrochemical detection of thrombin. The aptamer modified primary aliphatic amine was covalently immobilized onto poly-(5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid) (polyTTCA) layer. Tetrabromophenolphthalein ethyl est...
An aptamer-based biosensor using a new redox indicator has been examined for the electrochemical detection of thrombin. The aptamer modified primary aliphatic amine was covalently immobilized onto poly-(5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid) (polyTTCA) layer. Tetrabromophenolphthalein ethyl ester (KTBPE) was interacted to aptamer and used as an electrochemical indicator. Prior to the detection, the oxidation reaction of KTBPE onto aptamer modified layer was also investigated using differential pulse voltammetry. The characterization of the final sensor (KTBPE/aptamer -polyTTCA) was performed by voltammetry, QCM, and ESCA. After binding of thrombin onto KTBPE/aptamer based sensor, the peak signal of KTBPE was gradually decreased. The sensor exhibited a dynamic range between 10.0 and 100.0 nM with the detection limit of $1.0{\pm}0.2nM$.
An aptamer-based biosensor using a new redox indicator has been examined for the electrochemical detection of thrombin. The aptamer modified primary aliphatic amine was covalently immobilized onto poly-(5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid) (polyTTCA) layer. Tetrabromophenolphthalein ethyl ester (KTBPE) was interacted to aptamer and used as an electrochemical indicator. Prior to the detection, the oxidation reaction of KTBPE onto aptamer modified layer was also investigated using differential pulse voltammetry. The characterization of the final sensor (KTBPE/aptamer -polyTTCA) was performed by voltammetry, QCM, and ESCA. After binding of thrombin onto KTBPE/aptamer based sensor, the peak signal of KTBPE was gradually decreased. The sensor exhibited a dynamic range between 10.0 and 100.0 nM with the detection limit of $1.0{\pm}0.2nM$.
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제안 방법
KTBPE와의 결합으로 인해 550, 760 mV에서 새로운 산화 피크를 관찰 하였다 (inset Fig. 2(A)).
DNA 염기의 산화과정을 직접 관찰하기 위해 DPV를 이용하여 트롬빈 결합 전·후의 압타머 산화 피크를 비교 하였다.
실험에 사용한 KTBPE는 전기화학적으로 활성을 가지는 표지자(indicator)이다. DPV를 이용하여 0.35에서 1.1 V까지 aptamer/TTCA/GC, KTBPE/aptamer/TTCA/GC와 thrombin/KTBPE/aptamer/TTCA/GC 전극을 각각 5 mV/s의 주사 속도로 측정하였다. Fig.
KTBPE가 결합된 센서의 선택성 (selectivity)을 측정하기 위해 20.0 nM의 트롬빈과 1.0 mg/mL 농도의 면역글로블린G(IgG), 시토크롬 C(Cytochrome C; Cyt C), 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin; BSA) 과 반응시킨 전극을 각각 비교하였다. Fig.
그 결과 표지자를 이용하여 압타머의 구조 차이를 전기화학적으로 알아 볼 수 있다. KTBPE의 pH에 따른 전기화학적 특성을 분석하기 위해 유리질 탄소 전극을 이용하여 1.0 mM의 KTBPE 용액에서 DPV를 측정하였다. pH가 작아질수록 더 양(positive)의 전위값을 가지는 것을 알 수 있었다.
활성을 가지고 있지 않는 트롬빈과의 상호 작용을 전기화학적으로 검출하기 위해 KTBPE를 산화/환원 표지자로 사용였다. QCM을 이용하여 TTCA로 변성된 전극에 압타머가 결합한 양을 정량 분석하였고, XPS 분석을 통해 펩타이드 결합으로 인한 NH, N-C 결합을 확인하였다. 트롬빈의 검출의 선형 동적 범위는 1.
XPS 분석을 이용하여 각각의 전극 변성과정에 따른 특정 작용기(specific functional group)의 원소를 분석하였다. 먼저 유리질 탄소 디스크에 TTCA 폴리머를 형성한 한 후 카르복실 산 그룹을 가진 TTCA polymer에 아민 그룹을 가진 압타머를 2시간 동안 결합시켰다.
XPS 분석을 이용하여 각각의 전극 변성과정에 따른 특정 작용기(specific functional group)의 원소를 분석하였다. 먼저 유리질 탄소 디스크에 TTCA 폴리머를 형성한 한 후 카르복실 산 그룹을 가진 TTCA polymer에 아민 그룹을 가진 압타머를 2시간 동안 결합시켰다. 전극에 압타머가 공유 결합으로 고정화된 것을 확인하기 위해서 XPS를 측정하였다.
본 연구는 카르복실 산 그룹을 가진 단량체TTCA를 전기화학적 방법을 이용하여 전기 중합하여 합성된 polyTTCA와 아민 그룹을 가지는 압타머를 변성 전극으로 사용하여 트롬빈의 검출 센서를 성공적으로 개발하였다. 활성을 가지고 있지 않는 트롬빈과의 상호 작용을 전기화학적으로 검출하기 위해 KTBPE를 산화/환원 표지자로 사용였다.
이러한 KTBPE의 성질을 이용하여 압타머에 반응시킨 후 시차 펄스 전압전류법 (different pulse voltammetry, DPV)를 통해서 트롬빈을 정량하였다. 뿐만 아니라, 센서 물질 고정 및 특성 확인을 광전자 분광기(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS), 수정 진동자 저울 (quartz crystal microbalance, QCM)을 통해서 수행 하였다.
압타머의 성질을 이용하여 KTBPE와 압타머의 선형-입체 구조의 변화에 따른 상호작용의 차이를 DPV로 비교해 보았다. Fig.
유리질 탄소 전극을 1.0 mM의 TTCA 모노머 용액에 넣고 CV를 이용하여 0.0 에서 1.6 V까지의 전위 범위에서 100 mV/s의 주사속도로 1회 순환시켜 전기 중합 하였다. polyTTCA로 변성된 전극을 10.
이 연구에서는, 트롬빈과 압타머의 상호작용을 연구하기 위해 tetrabromophenolphthalein ethyl ester (KTBPE)를 산화/환원 표지자 (indicator) 로 사용하였다. KTBPE는 브로모페놀 블루 (bromophenol blue)의 계열로 단일 전하 염료 (singly charged dye)이며, 전기화학적, 광학적으로 활성을 가지는 물질이다.
먼저 유리질 탄소 디스크에 TTCA 폴리머를 형성한 한 후 카르복실 산 그룹을 가진 TTCA polymer에 아민 그룹을 가진 압타머를 2시간 동안 결합시켰다. 전극에 압타머가 공유 결합으로 고정화된 것을 확인하기 위해서 XPS를 측정하였다. 그 결과 TTCA polymer에서 없었던 압타머의 amine으로 인한 N1s peak을 400.
Trizma base( DNase and Protease - None detected), tetrabromophenolphthalein ethyl ester potassium salt (KTBPE), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl) carbodiimide (EDC), dichloromethane anhydrous (99.8%), tetra-n-buthylammoniumperchlorate (TBAP)는 SigmaAldrich Co. (USA)로부터 구입하였다. 실험에 사용된 5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid (TTCA)은 자체 합성하였다.
, USA) 를 사용하였다. 모든 실험은 3전극계로써 유리질 탄소 (glassy carbon)을 작업 전극, Ag/AgCl (포화 KCl)을 기준 전극, 그리고 Pt 선을 상대 전극으로 각각 사용 하였다. 전극 표면의 이미지와 성분 분석을 위한 XPS 는 VG Scientific ESCALAB 250 그리고 QCM은 Zeiss FE-SEM Supra40 VP (ESCALAB 250, Germany) SEIKO EG&G model QCA 917 PAR model 263A potentiostat/galvanostat (USA) (금나노 입자가 코팅된 전극 (면적: 0.
실험에 사용된 5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid (TTCA)은 자체 합성하였다.
실험에 사용한 KTBPE는 전기화학적으로 활성을 가지는 표지자(indicator)이다. DPV를 이용하여 0.
실험에 사용한 압타머는 2개의 사중 구조(quartet)가 쌓여있고(stacking), 의자모양으로 접혀있는 구조를 가진다. DNA는 구조 변화에 따라 활성을 잃게 되고 안정성이 떨어지게 되므로, 생체내의 반응을 연구하는데 있어서 DNA의 입체 (folding)-선형 (unfolding) 구조의 형태 변환은 중요한 요소이다.
전극 표면의 이미지와 성분 분석을 위한 XPS 는 VG Scientific ESCALAB 250 그리고 QCM은 Zeiss FE-SEM Supra40 VP (ESCALAB 250, Germany) SEIKO EG&G model QCA 917 PAR model 263A potentiostat/galvanostat (USA) (금나노 입자가 코팅된 전극 (면적: 0.196 cm2 ; 9.0 MHz; AT-cut quartz crystal))를 이용하였다.
20) NH2 으로 변성화된 압타머는 Bioneer (Korea)로부터 구입하였고 염기서열은 NH2-C6-GGT TGG TGT GGT TGG (15 mer)이다. 트롬빈은 Haematologic Technologies Inc., 에서 구입하였다. 동결 건조된 압타머는 3차 증류수로 1 × 10-4 M 의 농도로 녹인 후 냉동고에서 보관하고 매 실험마다 꺼내어 10.
이론/모형
KTBPE는 1차, 2차, 3차 아민 (amine)과 방향족 3차아민 (aromatic tertiary amine)과 결합하여 전하 이동 착물 (charge transfer complex)을 형성한다. 이러한 KTBPE의 성질을 이용하여 압타머에 반응시킨 후 시차 펄스 전압전류법 (different pulse voltammetry, DPV)를 통해서 트롬빈을 정량하였다. 뿐만 아니라, 센서 물질 고정 및 특성 확인을 광전자 분광기(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS), 수정 진동자 저울 (quartz crystal microbalance, QCM)을 통해서 수행 하였다.
전기화학적 특성 분석을 위하여 전압전류법 (cyclic voltammetry, CV)과 시차 펄스 전압전류법 (DPV)은 Kosentech의 potentiostat/galvanostat model KST P-2 (South Korea)와 BAS CV-50W voltammetric analyzer (Bioanalytical Systems Inc., USA) 를 사용하였다. 모든 실험은 3전극계로써 유리질 탄소 (glassy carbon)을 작업 전극, Ag/AgCl (포화 KCl)을 기준 전극, 그리고 Pt 선을 상대 전극으로 각각 사용 하였다.
본 연구는 카르복실 산 그룹을 가진 단량체TTCA를 전기화학적 방법을 이용하여 전기 중합하여 합성된 polyTTCA와 아민 그룹을 가지는 압타머를 변성 전극으로 사용하여 트롬빈의 검출 센서를 성공적으로 개발하였다. 활성을 가지고 있지 않는 트롬빈과의 상호 작용을 전기화학적으로 검출하기 위해 KTBPE를 산화/환원 표지자로 사용였다. QCM을 이용하여 TTCA로 변성된 전극에 압타머가 결합한 양을 정량 분석하였고, XPS 분석을 통해 펩타이드 결합으로 인한 NH, N-C 결합을 확인하였다.
성능/효과
Fig. 1 (A(a))의 N1s spectrum에서 399.18, 401.04 eV에 보여지는 두 개의 피크가 TTCA와 압타머의 N-C-H 결합으로 인한 N-H, N-C 결합과 관계된 것임을 확인하였다. 그 결과 압타머가 TTCA 폴리머 층에 잘 고정되었음을 확인 할 수 있었다.
1) 이러한 압타머는 항원·항체 반응과 같은 개념의 바이오센서 시스템에 도입이 가능하며, 인공적으로 합성하여 저렴하게 대량 생산 할 수 있다.
25) 상온에서 압타머는 1가 금속 이온 중에서 K+ 와 Rb+와 강하게 복합체를 형성하며, Na+ 과 Cs+ 과는 안정된 구조를 형성하지 못한다.
1(B(b))는 압타머에 표적 단백질인 트롬빈이 결합하는 양과 반응시간을 알아보기 위한 QCM 측정결과를 나타낸다. 70분까지 급격한 진동수 변화를 확인했고, 90분 이후로는 반응이 거의 끝나며 진동수의 변화가 거의 없는 것을 확인 하였다. 총 진동수의 변화량은 554.
유리질 탄소 전극을 이용하여 KTBPE의 산화 피크를 확인했을 때 550과 760 mV에서 두 개의 뚜렷한 피크를 확인할 수 있었으나, 압타머에 결합시킨 KTBPE는 활성 자리 (active site)에 영향을 받아 550 mV에서 KTBPE의 피크가 작아짐을 볼 수 있다. KTBPE/aptamer/TTCA/GC 전극에 표적 단백질인 트롬빈을 반응 시킨 결과, KTBPE의 산화 피크가 감소하였다 (Fig. 2(A(c))).
Nernst 식을 이용하여 dE 0' /dpH값을 구한 결과 낮은 pH 범위에서의 dE 0' / dpH = 60.48 mV/pH 의 값으로부터 1 ≤ pH ≤ 4의 범위에서는 두개의 전자와 두 개의 양성자가 관여하는 반응임을 알 수 있었다.
그 결과 압타머가 TTCA 폴리머 층에 잘 고정되었음을 확인 할 수 있었다. Survey spectrum에서 69.09 eV부근의 Br3d 원소분석을 통해 압타머에 KTBPE가 결합하였음을 확인 하였다 (not shown). 더 자세한 분석을 위해 Fig.
0 mM의 KTBPE 용액에서 DPV를 측정하였다. pH가 작아질수록 더 양(positive)의 전위값을 가지는 것을 알 수 있었다. pH 3에서는 하나의 넓은 산화 피크를 보였고 pH 4에서부터 산화 피크의 갈라짐이 보였다.
2(C)는 선형-입체 구조의 압타머에 각각 KTBPE를 결합시킨 전극을 이용하여 트롬빈을 검출할 때의 차이를 알아보았다. 그 결과 선형 구조의 압타머는 트롬빈과의 상호작용으로 인해 KTBPE의 산화 피크의 차이가 크게 나타났다.
04 eV에 보여지는 두 개의 피크가 TTCA와 압타머의 N-C-H 결합으로 인한 N-H, N-C 결합과 관계된 것임을 확인하였다. 그 결과 압타머가 TTCA 폴리머 층에 잘 고정되었음을 확인 할 수 있었다. Survey spectrum에서 69.
20 eV에서 O-H와 O-C 결합으로 인해 피크 세기가 증가 하는 결과를 나타내었다. 그 결과 압타머의 아민기와 KTBPE의 OH 기가 공유 결합한 것을 확인할 수 있었다.
그 결과 TTCA polymer에서 없었던 압타머의 amine으로 인한 N1s peak을 400.0 eV 부근에서 확인 할 수 있었고 532.0 eV에서 압타머의 염기로 인한 O1s의 피크 세기 (peak intensity)가 증가함을 알 수 있었다.
2(A(c))). 그 결과, KTBPE 를 이용하여 전기화학적으로 트롬빈을 검출 할 수 있다고 증명할 수 있었다.
DNA 염기의 산화과정을 직접 관찰하기 위해 DPV를 이용하여 트롬빈 결합 전·후의 압타머 산화 피크를 비교 하였다. 그 결과, 표지자인 KTBPE를 이용하여 트롬빈을 검출한 것이 직접적인 압타머의 구아닌 산화반응을 이용한 결과보다 선택성이 높은 것을 확인하였다.
1(B(a))는 TTCA 폴리머 전극 위에 NH2기를 가진 압타머가 고정되는 양과 반응시간을 알아보기 위한 QCM 결과를 나타낸다. 미량 수정전극 (quartz crystal electrode)은 은(Ag)의 정전위적 석출에 관한 실험을 통해 보정하였고, 그 결과 미량 수정전극의 감도 계수 (sensitivity constant)는 5.608 (ng/cm2 )/Hz 이었다. 미량 수정전극에 polyTTCA를 modification 시킨 후 1 × 10-5 M농도의 압타머와 반응을 시켰다.
2(A(a))는 aptamer/TTCA/GC에서의 DPV 결과이다. 압타머는 15개의 염기서열로 구성되어 있으며, 염기 중 전기화학적으로 활성을 가지는 구아닌 (guanine)에의해 950 mV에서 산화 피크를 확인 할 수 있었다. KTBPE와의 결합으로 인해 550, 760 mV에서 새로운 산화 피크를 관찰 하였다 (inset Fig.
이는 KTBPE의 산화 피크를 통해 압타머가 KTBPE와 결합한 것을 나타낸다. 유리질 탄소 전극을 이용하여 KTBPE의 산화 피크를 확인했을 때 550과 760 mV에서 두 개의 뚜렷한 피크를 확인할 수 있었으나, 압타머에 결합시킨 KTBPE는 활성 자리 (active site)에 영향을 받아 550 mV에서 KTBPE의 피크가 작아짐을 볼 수 있다. KTBPE/aptamer/TTCA/GC 전극에 표적 단백질인 트롬빈을 반응 시킨 결과, KTBPE의 산화 피크가 감소하였다 (Fig.
이 결과 트롬빈의 농도 범위가 1.0에서 50.0 nM 일 때 직선성을 보였으며, 100.0 nM 보다 농도가 높을 경우 산화 전류값의 변화가 없는 것을 확인하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
압타머의 특징은 무엇인가?
압타머 (aptamer)는 단백질, 펩타이드, 지질 등과 같은 분자 또는 크기가 작은 유기, 무기화합물 등 다양한 표적물질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산 (DNA또는 RNA)을 말한다. 1) 이러한 압타머는 항원·항체 반응과 같은 개념의 바이오센서 시스템에 도입이 가능하며, 인공적으로 합성하여 저렴하게 대량 생산 할 수 있다. 또한, 압타머 고정화 (immobilization) 기술은 단백질 고정화에 비해 비교적 간단하며 열 안정성, 정제의 용이성 등 여러 가지 장점을 가지고 있어 압타머를 이용한 새로운 친화성 감지 시스템(affinity sensing system) 연구가 진행되고 있다.
압타머란 무엇인가?
압타머 (aptamer)는 단백질, 펩타이드, 지질 등과 같은 분자 또는 크기가 작은 유기, 무기화합물 등 다양한 표적물질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산 (DNA또는 RNA)을 말한다. 1) 이러한 압타머는 항원·항체 반응과 같은 개념의 바이오센서 시스템에 도입이 가능하며, 인공적으로 합성하여 저렴하게 대량 생산 할 수 있다.
tetrabromophenolphthalein ethyl ester의 특징은 무엇인가?
이 연구에서는, 트롬빈과 압타머의 상호작용을 연구하기 위해 tetrabromophenolphthalein ethyl ester (KTBPE)를 산화/환원 표지자 (indicator) 로 사용하였다. KTBPE는 브로모페놀 블루 (bromophenol blue)의 계열로 단일 전하 염료 (singly charged dye)이며, 전기화학적, 광학적으로 활성을 가지는 물질이다. KTBPE는 1차, 2차, 3차 아민 (amine)과 방향족 3차아민 (aromatic tertiary amine)과 결합하여 전하 이동 착물 (charge transfer complex)을 형성한다. 이러한 KTBPE의 성질을 이용하여 압타머에 반응시킨 후 시차 펄스 전압전류법 (different pulse voltammetry, DPV)를 통해서 트롬빈을 정량하였다.
참고문헌 (25)
C. Tuerk and L. Gold, Science, 249, 505-510 (1990).
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