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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 이러한 구형 나노 입자의 한계점을 극복하기 위한 새로운 형태의 디스크 나노 입자를 제안하고, 디스크 나노 입자의 생산 과정과 입자의 질을 향상시키기 위한 입자 생산방법에 관한 연구 내용을 보고하였다.
- 본 연구에서는 500 nm 지름의 디스크 모양 나노입자의 개선된 생산 공정을 찾기 위하여 생산의 각 단계를 분석하기 위한 알고리즘을 수립하였다. 그리고 각각의 경우에 대한 생산된 입자의 분포와 loading 후의 scum layer를 AFM을 이용하여 비교하였다(그림 4).
- 따라서 향후 연구는 이러한 디스크 나노 입자의 특징을 이용하여, 암세포에 실제로 약물이 전달되는 방식과 세포사멸 효과를 규명하는 연구를 진행할 계획이다. 요컨대 본 연구를 통해 균일한 500 nm 디스크 나노 입자를 생산하는 방식을 소개하였으며, 또한 그러한 입자의 생산량을 개선시키기 위한 입자 생산 방식을 제시할 수 있었다.
- 이에 본 연구는 암 조직 내의 입자 축적률을 높이기 위해 디스크 모양의 PLGA (지름 500 nm, 높이 200 nm) 나노 입자를 새로운 항암제 전달체로 제안하고 입자 생산의 각 단계를 최적화하여 표준화된 생산 공정을 찾는 것을 목표로 하였다. 또한 해당 생산 공정으로 만들어진 입자가 암 세포에서 작용하는 방식을 연구하였다.
제안 방법
- 그림 5. AFM을 이용하여 Loading후 PVA template 표면을 나노 스케일로 관찰한 사진.
- PVA template에 loading을 진행할 때, loading의 횟수를 2회, 5회, 8회로 각각 진행하였다. PVA template는 지름이 약 20 cm인 원모양으로, 한 template을 한 번 Loading하는데 약 360 µl의 polymer 용액을 사용하였다(그림 4).
- PVA template의 loading 결과 분석은 AFM으로 측정하였다. 사용한 AFM probe의 type은 TESP이며, integral gain: 3, proportional gain: 30, amplitude setpoint: 230 mV, drive frequency: 344.
- Polymer 용액 제조 단계에서 solution의 농도를 90 mg / 1.8 ml, 90 mg / 1 ml, 150 mg / 1 ml, 250 mg / 1 ml (solute/solvent)으로 하여 각각 loading을 진행하였다(그림 4).
- Polymer 용액의 loading 횟수를 달리하여 PVA template에 loading을 한 결과를 AFM을 이용하여 확인하였다. Loading 횟수를 그림 4의 순서도에 따라 비교 분석하였다.
- Si template 위에서 PDMS 용액을 polymerization시켜 PDMS template을 만들고 이를 이용하여 PVA solution을 loading한 후 최종적으로 생산된 PVA template을 입자를 생산하는데 사용하였다. PVA template 위에 polymer 용액을 loading한 후, blade를 수직으로 세워 밀어주는 방식으로 나노 구멍을 채웠다.
- 그림 4에서 제시한 최적화 알고리즘을 통해서 생산한 입자를 현미경의 bright field에서 확인하였고(그림 3), 같은 조건에서 형광 물질인 RhB를 포함하여 생산한 디스크 입자를 암세포와 함께 처리하였다. 그 후 세포에 DAPI staining을 하여 Patch-clamp system: IX71을 사용하여 형광 이미지를 촬영하였으며, Metamorph 프로그램을 이용하여 이미지를 merge 하였다. merge된 이미지를 확인한 결과 세포 내에서 입자에 loading된 형광 Dye가 방출된 현상은 관찰되지 않았으며 세포 표면에 입자가 bound 된 것으로만 관찰되었다.
- 본 연구에서는 500 nm 지름의 디스크 모양 나노입자의 개선된 생산 공정을 찾기 위하여 생산의 각 단계를 분석하기 위한 알고리즘을 수립하였다. 그리고 각각의 경우에 대한 생산된 입자의 분포와 loading 후의 scum layer를 AFM을 이용하여 비교하였다(그림 4). 제시한 알고리즘 내에서 Polymer 용액의 농도가 90 mg / 1.
- 그림 4에서 제시한 최적화 알고리즘을 통해서 생산한 입자를 현미경의 bright field에서 확인하였고(그림 3), 같은 조건에서 형광 물질인 RhB를 포함하여 생산한 디스크 입자를 암세포와 함께 처리하였다. 그 후 세포에 DAPI staining을 하여 Patch-clamp system: IX71을 사용하여 형광 이미지를 촬영하였으며, Metamorph 프로그램을 이용하여 이미지를 merge 하였다.
- 나노 입자를 생산하면서 생성된 부유물은 nylon filter (pore size: 100 µm)를 이용하여 1차적으로 제거하였고, 크기 500 nm인 나노 입자는 추가적인 membrane filter (pore size: 200 nm, 800 nm)와 centrifugation (13,500rpm, 5min)을 통하여 획득하였다(그림 3).
- 나노 입자의 생산을 최적화하기 위하여 생산 공정에서 3가지 단계(concentration, loading number, purification)를 선정하여 다양한 조건에서 실험을 진행하였다(그림 4).
- 나노 입자의 크기는 Zetasizer Nano를 이용하여 확인하였다. 나노 입자는 deionized (DI) water (1 ml) 속에 분산되어있는 상태로 측정되었으며 DLS 상의 Count Rate(kcps)는 174.
- 이 후 PBS로 2번 washing하여 10% 포름알데히드로 15분간 고정하였다. 다시 PBS로 washing 후 DAPI 염색 후 형광현미경(Patchclamp system: IX71)으로 관찰하여 영상을 얻었다. 사진은 Metamorph 프로그램을 이용하여 얻었다.
- 이에 본 연구는 암 조직 내의 입자 축적률을 높이기 위해 디스크 모양의 PLGA (지름 500 nm, 높이 200 nm) 나노 입자를 새로운 항암제 전달체로 제안하고 입자 생산의 각 단계를 최적화하여 표준화된 생산 공정을 찾는 것을 목표로 하였다. 또한 해당 생산 공정으로 만들어진 입자가 암 세포에서 작용하는 방식을 연구하였다.
- 그림 4에서 제시한 최적화 알고리즘 내에서 Polymer 용액의 농도와 loading 횟수가 최소인 조건으로 RhB를 loading하여 생산한 나노 입자를 인간 유방암세포(MCF7)와 함께 배양하였다. 배양 시간을 달리하였고, 세포와 반응하지 않은 입자들은 PBS로 제거 한 후, 형광 현미경으로 확인하였다. 그 결과 입자를 처리하지 않은 Control에서는 RhB가 관찰되지 않았으며, 전체 관찰 면적(126957 pixels)에 대하여 Normalized particle area를 각각 구하면 입자와 함께 세포를 배양한 시간이 4h가 경과했을 때는 445 pixels, 8h는 1638 pixels, 12h는 5901 pixels로 입자의 처리 시간이 증가할수록 동일 면적당 세포에 부착된 입자의 수가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(그림 7).
- 따라서 본 연구에서는 이러한 구형 나노 입자의 한계점을 극복하기 위한 새로운 형태의 디스크 나노 입자를 제안하고, 디스크 나노 입자의 생산 과정과 입자의 질을 향상시키기 위한 입자 생산방법에 관한 연구 내용을 보고하였다. 본 연구를 통해 생산된 디스크 나노 입자는 인간 유방암인 MCF7 세포에 적용하여 항암제 전달체로써의 가능성을 평가하였다.
- 본 연구의 방식으로 생산된 입자가 세포에 처리되었을 때 작용하는 방식을 확인하기 위해 형광 물질인 RhB를 적재한 입자를 세포에 처리한 후 배양 시간을 달리하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 세포는 인간 유방암 세포인 MCF 7이 사용되었다.
- 다시 PBS로 washing 후 DAPI 염색 후 형광현미경(Patchclamp system: IX71)으로 관찰하여 영상을 얻었다. 사진은 Metamorph 프로그램을 이용하여 얻었다. 입자의 처리시간에 따른 단위 면적당 정규화된 입자의 수는 ImageJ 프로그램으로 분석하였다.
- 상기된 다양한 조건에서 나노 입자를 생산한 후, DLS를 이용하여 생산된 입자의 크기 분포도를 측정하였다. Loading 횟수를 달리하였을 때, 최적화 알고리즘 내에서 최소 loading 횟수를 가진 경우 나노 입자의 평균 크기는 487.
- 생산된 Silicon template에 PDMS와 elastomer를 weight ratio 10 : 1로 혼합한 solution을 loading하여 직경 500 nm, 높이 200 nm의 디스크 모양의 기둥이 새겨진 PDMS template를 생산하였다[4].
- 세포 및 조직 친화성을 갖춘 생분해성 고분자인 PLGA로 나노 입자의 틀을 구성하였다. 입자 표면의 친수성을 높임으로써 입자가 정상 조직이나 대식 세포로 흡수되는 비율을 감소시키기 위해 PEG를 첨가하였다[6].
- 세포는 Confocal cover-glass bottom dish에서 Dulbeco's Modified Eagle's Medium (DMEM)에 1% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin/ Streptomycin을 함유한 배양액을 사용하여 37o C, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양되었다. 세포가 약 40%의 confluency를 차지했을 때, Control을 제외한 실험군에 입자를 처리하여 각각 4시간, 8시간, 12시간 동안 배양하였다. 이 후 PBS로 2번 washing하여 10% 포름알데히드로 15분간 고정하였다.
- 세포에 bound 된 입자의 양을 측정하기 위해 ImageJ프로그램으로 촬영된 이미지 면적과 나노 입자 형광의 면적을 비교하여 분석하였다.
- 세포 및 조직 친화성을 갖춘 생분해성 고분자인 PLGA로 나노 입자의 틀을 구성하였다. 입자 표면의 친수성을 높임으로써 입자가 정상 조직이나 대식 세포로 흡수되는 비율을 감소시키기 위해 PEG를 첨가하였다[6]. PLGA와 PEG를 weight ratio 1 : 1로 혼합하고 DCM과 CHCl3를 volume ratio 1 : 1로 혼합한 용매에 용해시켰다.
- 그림 6. 입자의 수용액 상에서의 크기 분석. (a) 농도: 90 mg / 1.
- 사진은 Metamorph 프로그램을 이용하여 얻었다. 입자의 처리시간에 따른 단위 면적당 정규화된 입자의 수는 ImageJ 프로그램으로 분석하였다. 그림 7A (Control)을 제외한 나머지는 같은 면적(126957 pixels)을 가지고 있고, 이 때 RhB의 면적을 각각 구하여 정규화하였다.
- 형광 현미경을 통한 입자의 검증을 위해 형광 물질인 RhB 또는 Cy 5.5를 22.2 µg/ml를 첨가하였다(그림 2).
대상 데이터
- PVA template는 지름이 약 20 cm인 원모양으로, 한 template을 한 번 Loading하는데 약 360 µl의 polymer 용액을 사용하였다(그림 4).
- Poly (DL-lactide-co-glycolide) acid (PLGA), Poly (ethylene glycol) dimethacrylate (PEG dimethacrylate), Poly (vinyl alcohol) (PVA), Poly (dimethylsiloxane) (PDMS), Rhodamine B (RhB), Cyanine 5.5 (Cy5.5), Dichloromethane (DCM), Chloroform (CHCl3).
- 그림 4에서 제시한 최적화 알고리즘 내에서 Polymer 용액의 농도와 loading 횟수가 최소인 조건으로 RhB를 loading하여 생산한 나노 입자를 인간 유방암세포(MCF7)와 함께 배양하였다. 배양 시간을 달리하였고, 세포와 반응하지 않은 입자들은 PBS로 제거 한 후, 형광 현미경으로 확인하였다.
- 사용한 AFM probe의 type은 TESP이며, integral gain: 3, proportional gain: 30, amplitude setpoint: 230 mV, drive frequency: 344.876 kHz, drive amplitude: 18.62 mV으로 설정하였다.
- 세포는 Confocal cover-glass bottom dish에서 Dulbeco's Modified Eagle's Medium (DMEM)에 1% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin/ Streptomycin을 함유한 배양액을 사용하여 37o C, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양되었다.
- 본 연구의 방식으로 생산된 입자가 세포에 처리되었을 때 작용하는 방식을 확인하기 위해 형광 물질인 RhB를 적재한 입자를 세포에 처리한 후 배양 시간을 달리하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 세포는 인간 유방암 세포인 MCF 7이 사용되었다. 세포는 Confocal cover-glass bottom dish에서 Dulbeco's Modified Eagle's Medium (DMEM)에 1% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin/ Streptomycin을 함유한 배양액을 사용하여 37o C, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양되었다.
이론/모형
- 직경 500 nm, 높이 200 nm의 동일한 디스크 나노구멍은 Electron beam lithography 방식으로 제작되었고, 이러한 Silicon template을 이용하여 기존에 보고된 나노 임프린트 리소그래피(Nanoimprint Lithography) 방법으로 다량의 디스크 나노 입자를 생산하였다[4](그림 1).
성능/효과
- 그 후 세포에 DAPI staining을 하여 Patch-clamp system: IX71을 사용하여 형광 이미지를 촬영하였으며, Metamorph 프로그램을 이용하여 이미지를 merge 하였다. merge된 이미지를 확인한 결과 세포 내에서 입자에 loading된 형광 Dye가 방출된 현상은 관찰되지 않았으며 세포 표면에 입자가 bound 된 것으로만 관찰되었다. 세포에 bound 된 입자의 양을 측정하기 위해 ImageJ프로그램으로 촬영된 이미지 면적과 나노 입자 형광의 면적을 비교하여 분석하였다.
- 이 때 디스크 나노 입자는 pH condition에 따라 다른 release 특성을 보여주었다. pH 7.4에서 디스크 나노 입자는 모양과 크기를 유지한 채 RhB의 확산에 의한 방출만을 하는 것을 보였고, pH 5.5에서는 degradation되며 RhB를 빠른 속도로 방출하는 것을 보여주었다. 이러한 pH condition에 대한 특이성은 종양 미세환경과 같은 산성 조건에서 활발한 방출 특성을 보여주어 drug carrier로써 적절한 역할을 할 것이라 사료된다[4].
- 그림 5B는 같은 농도로 하여 loading 횟수를 5회, 그림 5C는 loading 횟수를 8회로 한 결과이다. 각 template surface roughness를 측정한 결과, 그림 5A의 Rq는 2.23 nm, Ra값은 1.71 nm이며, 그림 5B의 Rq는 5.09 nm, Ra는 4.05 nm, 그림 5C의 Rq는 1.35 nm, Ra는 1.08 nm으로 각각 측정되었다.
- 세포에 bound 된 입자의 양을 측정하기 위해 ImageJ프로그램으로 촬영된 이미지 면적과 나노 입자 형광의 면적을 비교하여 분석하였다. 그 결과 세포 배양 시간이 길어질수록 암세포에 bound 되는 입자 수가 증가하는 경향을 나타내었다(그림 7). 한편 디스크 나노 입자가 세포 내로 축적되는 현상은 관찰되지 않았다.
- 배양 시간을 달리하였고, 세포와 반응하지 않은 입자들은 PBS로 제거 한 후, 형광 현미경으로 확인하였다. 그 결과 입자를 처리하지 않은 Control에서는 RhB가 관찰되지 않았으며, 전체 관찰 면적(126957 pixels)에 대하여 Normalized particle area를 각각 구하면 입자와 함께 세포를 배양한 시간이 4h가 경과했을 때는 445 pixels, 8h는 1638 pixels, 12h는 5901 pixels로 입자의 처리 시간이 증가할수록 동일 면적당 세포에 부착된 입자의 수가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(그림 7). 또한 이러한 디스크 입자가 가지는 세포 독성에 대한 평가는 선행 연구에서 XTT assay를 통하여 검증되었으며, 50 µg / 100 µl까지는 약 80% 이상의 cell survival이 관찰되었다[4].
- 생산된 입자에서 불순물을 제거하는 purification 과정의 경우, centrifuge와 membrane filter를 사용하여 입자의 purification을 수행하였고, 입자의 생산 시간과 생산되는 입자의 양을 고려하여 비교하였을 때, 생산된 디스크 나노입자 보다 크기가 큰 PVA template의 잉여물이나 polymer mixture로 부터 방출된 작은 분자들의 경우, membrane filtration 과정을 통하여 효율적으로 제거할 수 있었다. 또한 정화된 디스크 나노입자는 13,500rpm 이상의 고속 원심분리 과정을 통해서 효율적으로 집적시킬 수 있다는 결론을 내릴 수 있었다.
- 본 연구에서는 500 nm 디스크 모양의 나노 입자를 생산하기 위한 최적화 조건에 관한 실험을 진행하였으며, 기존의 연구에서 표적 Ligand가 없는 디스크 모양의 나노 입자가 혈관벽에 축적되는 것이 확인되었으며, 특정 암세포 표적을 위한 Ligand를 이용함으로써 암 조직의 병적 혈관 및 세포 간극에 효과적으로 반응할 것으로 예상된다[7]. 또한 세포 실험 결과를 기반으로 판단하였을 때, 제안된 입자는 EPR Effect를 통하여 병적 혈관벽 혹은 암 세포벽을 표적으로 한 후[2], 입자 내에 있는 약물이 시간에 따라 방출되어 암세포와 암 주변 혈관세포를 사멸시키는 형태의 항암제 전달체로써 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 이는 500nm 디스크 모양 입자를 만들기 위하여 생산 단계의 최적화가 필요함을 보여주는 동시에 본 연구에서 제시한 알고리즘 내에서 최적화 조건을 결정할 수 있는 근거가 되었다. 생산된 입자에서 불순물을 제거하는 purification 과정의 경우, centrifuge와 membrane filter를 사용하여 입자의 purification을 수행하였고, 입자의 생산 시간과 생산되는 입자의 양을 고려하여 비교하였을 때, 생산된 디스크 나노입자 보다 크기가 큰 PVA template의 잉여물이나 polymer mixture로 부터 방출된 작은 분자들의 경우, membrane filtration 과정을 통하여 효율적으로 제거할 수 있었다. 또한 정화된 디스크 나노입자는 13,500rpm 이상의 고속 원심분리 과정을 통해서 효율적으로 집적시킬 수 있다는 결론을 내릴 수 있었다.
- 하지만 같은 농도에서 loading 횟수를 5회까지 증가시킨 결과 scum layer도 함께 늘어났고, 입자의 크기는 일정하지 않은 값을 보였으며 평균 크기는 나노 범위에서 벗어난 값에서 높은 수치(1791 nm)를 나타내었다(그림 6b). 이는 500nm 디스크 모양 입자를 만들기 위하여 생산 단계의 최적화가 필요함을 보여주는 동시에 본 연구에서 제시한 알고리즘 내에서 최적화 조건을 결정할 수 있는 근거가 되었다. 생산된 입자에서 불순물을 제거하는 purification 과정의 경우, centrifuge와 membrane filter를 사용하여 입자의 purification을 수행하였고, 입자의 생산 시간과 생산되는 입자의 양을 고려하여 비교하였을 때, 생산된 디스크 나노입자 보다 크기가 큰 PVA template의 잉여물이나 polymer mixture로 부터 방출된 작은 분자들의 경우, membrane filtration 과정을 통하여 효율적으로 제거할 수 있었다.
- 71 nm로 나타났다. 이러한 조건에서 입자를 생산하여 DLS로 분석한 결과 나노 입자의 평균 크기는 487.5 nm, PdI는 0.104였다. 이러한 결과는 PVA template 상에 새겨져있는 디스크 모양 pore의 크기와 매우 흡사하였다(그림 5A, 그림 6A).
- 05 nm으로 측정되었다. 이러한 조건으로 나노 입자를 생산하여 DLS로 분석한 결과, 입자의 평균 크기가 1791 nm, PdI는 0.432로 입자의 생산 질이 좋지 않음을 확인 할 수 있었다(그림 5B, 그림 6B). 이는 PVA template상의 pore가 scum layer로 인하여 서로 연결이 된 상태로 AFM 결과 확인할 수 있었고, 이러한 상태로 입자를 생산한 경우, 입자의 생산률이 매우 저조하고 동일한 크기의 입자를 생산할 수 없을 것으로 판단된다.
- 그리고 각각의 경우에 대한 생산된 입자의 분포와 loading 후의 scum layer를 AFM을 이용하여 비교하였다(그림 4). 제시한 알고리즘 내에서 Polymer 용액의 농도가 90 mg / 1.8 ml (PLGA: 45 mg, PEG: 45 mg, DCM: 0.9 ml, CHCl3: 0.9 ml)이고, loading횟수가 2회인 경우에서 PVA template의 roughness를 측정한 결과 Rq의 값은 2.23 nm, Ra의 값은 1.71 nm로 나타났다. 이러한 조건에서 입자를 생산하여 DLS로 분석한 결과 나노 입자의 평균 크기는 487.
- 5 nm)의 디스크 입자였고, 다량으로 생산됨을 광학 영상과 DLS를 통해 확인 할 수 있었다(그림 3, 그림 6a). 하지만 같은 농도에서 loading 횟수를 5회까지 증가시킨 결과 scum layer도 함께 늘어났고, 입자의 크기는 일정하지 않은 값을 보였으며 평균 크기는 나노 범위에서 벗어난 값에서 높은 수치(1791 nm)를 나타내었다(그림 6b). 이는 500nm 디스크 모양 입자를 만들기 위하여 생산 단계의 최적화가 필요함을 보여주는 동시에 본 연구에서 제시한 알고리즘 내에서 최적화 조건을 결정할 수 있는 근거가 되었다.
- 또한 여러 층의 scum layer로 인해 거의 모든 pore가 서로 연결된 상태가 되어 입자의 생산이 불가능 할 것으로 판단된다. 한편 scum layer가 거의 없었던 저농도 solution에서 1~2회의 loading을 수행하였을 때, 생산된 입자는 약 500 nm(평균 크기: 487.5 nm)의 디스크 입자였고, 다량으로 생산됨을 광학 영상과 DLS를 통해 확인 할 수 있었다(그림 3, 그림 6a). 하지만 같은 농도에서 loading 횟수를 5회까지 증가시킨 결과 scum layer도 함께 늘어났고, 입자의 크기는 일정하지 않은 값을 보였으며 평균 크기는 나노 범위에서 벗어난 값에서 높은 수치(1791 nm)를 나타내었다(그림 6b).
후속연구
- 이러한 pH condition에 대한 특이성은 종양 미세환경과 같은 산성 조건에서 활발한 방출 특성을 보여주어 drug carrier로써 적절한 역할을 할 것이라 사료된다[4]. 따라서 향후 연구는 이러한 디스크 나노 입자의 특징을 이용하여, 암세포에 실제로 약물이 전달되는 방식과 세포사멸 효과를 규명하는 연구를 진행할 계획이다. 요컨대 본 연구를 통해 균일한 500 nm 디스크 나노 입자를 생산하는 방식을 소개하였으며, 또한 그러한 입자의 생산량을 개선시키기 위한 입자 생산 방식을 제시할 수 있었다.
- 본 연구에서는 500 nm 디스크 모양의 나노 입자를 생산하기 위한 최적화 조건에 관한 실험을 진행하였으며, 기존의 연구에서 표적 Ligand가 없는 디스크 모양의 나노 입자가 혈관벽에 축적되는 것이 확인되었으며, 특정 암세포 표적을 위한 Ligand를 이용함으로써 암 조직의 병적 혈관 및 세포 간극에 효과적으로 반응할 것으로 예상된다[7]. 또한 세포 실험 결과를 기반으로 판단하였을 때, 제안된 입자는 EPR Effect를 통하여 병적 혈관벽 혹은 암 세포벽을 표적으로 한 후[2], 입자 내에 있는 약물이 시간에 따라 방출되어 암세포와 암 주변 혈관세포를 사멸시키는 형태의 항암제 전달체로써 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 선행 연구에서는 본 연구와 동일한 물질을 사용하여 디스크 모양의 1000 nm 입자를 평가하였으며, RhB를 loading하여 release profile을 제시하였다.
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