[논문]NF-κB 억제를 통한 대회향(大茴香)의 항염증효능

금수연; 박상미; 제갈경환; 황보민; 조일제; 박정아; 김상찬; 지선영

doi:10.14374/hfs.2016.24.4.243

NF-κB 억제를 통한 대회향(大茴香)의 항염증효능
Anti-inflammatory Effects of Illicium verum Hook. f. via Suppression of NFκB Pathway 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.24 no.4, 2016년, pp.243 - 257

금수연 (대구한의대학교 한의과대학) , 박상미 (대구한의대학교 한의과대학) , 제갈경환 (대구한의대학교 한의과대학) , 황보민 (대구한의대학교 한의과대학) , 조일제 (대구한의대학교 한의과대학) , 박정아 (대구한의대학교 한의과대학) , 김상찬 (대구한의대학교 한의과대학) , 지선영 (대구한의대학교 한의과대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Illicium verum Hook. f. has been known to possess antimicrobial, antioxidant, antifungal, anti-inflammatory, insecticidal, analgesic, sedative, convulsive activities, it has been rarely conducted to evaluate the immuno-biological activity. The present study was examined to evaluate the anti-inflammatory effects of the Illicium verum Hook. f. water extracts (IVE) in vivo and in vitro. Methods : Cell viability was measured by MTT assay. The relative levels of NO were measured with Griess reagent. iNOS, COX-2, $NF-{\kappa}B$ and target proteins were detected by immunoblot analysis, and levels of cytokines were analyzed by ELISA kit. Anti-edema effect was determined in the carrageenan (CA)-induced paw edema model in rats. Results : All dosages of IVE used in MTT assay had no significant cytotoxicity. The increases of NO production and iNOS expression were detected in LPS-treated cells compared with control. However, these increases were attenuated by treatment with IVE. Also, IVE reduced the elevated production of $TNF-{\alpha}$, $IL-1{\beta}$ and IL-6 by LPS. IVE inhibited the $p-I{\kappa}B$ and translocation of $NF-{\kappa}B$ to nuclear. Furthermore, IVE significantly inhibited the increases of hind paw swelling, skin thicknesses and inflammatory cell infiltrations induced by CA injection. Therefore, IVE will be favorably inhibited the acute edematous inflammations. Conclusion : These results provide evidences that anti-inflammatory effect of IVE is partly due to the reduction of some inflammatory mediators by suppression of $NF-{\kappa}B$ pathway.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

이에 저자는 LPS를 이용한 in vitro 모델과, CA를 이용한 in vivo 모델에서 大茴香추출물(IVE; Illicium verum Hook. f. Extract)이 염증성병변을 억제할 수 있는지를 평가하였다.

제안 방법

4일째 약물을 투여하고 1시간 후 CA를 주입하여 paw edema를 유발시켰다. Paw edema의 측정은 CA 주입 후 0, 1, 2, 3, 4시간에 부종측정기 (Plethysmometer, LE 7500; LETICA Scientific Instruments, Spain)를 이용하여 부종 정도를 측정하였다.
CA를 주입한 rat의 오른쪽 발목아래를 절단하여 조직을 채취하여, 後肢의 발등 (dorsum pedis) 및 발바닥 (ventrum pedis)의 피부 실질조직을 분리하여 10% 중성포르말린에 6시간 이상 고정시킨 다음 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고, 3∼4 μm의 longitudinal 절편을 제작하여 Hematoxylin-Eosin 염색을 실시하고, 광학현미경 (Nikon, Japan)하에서 관찰하였다.
0 g/kg IVE군으로 나누었으며, 각 군당수는 5마리로 하였다. Dexamethasone과 IVE는 4일 동안 매일 1회 투여하였으며, 마지막 약물투여 1시간 후 carrageenan을 100 ㎕/rat로 rat의 오른쪽 발바닥에 주입하였다.
IVE가 LPS로 활성화된 Raw 264.7 cells에서 유도된 NO의 생성을 감소시킨 것이, IVE와 LPS의 세포독성으로 세포수의 감소에서 기인한 것인지를 관찰하기 위하여, IVE + LPS의 세포독성을 MTT assay로 측정하였다. Control군을 100.
IVE를 10∼300 ㎍/ml의 농도로 24시간 세포에 처리하여 생성되는 NO양을 측정하였다.
IVE의 NO생성 억제에 관련되는 iNOS의 발현을 세포질 내에서의 평가하였다. LPS 처치시에는 iNOS 단백질의 발현이 증가되었으나, LPS에 IVE를 처치한 실험군에서는 iNOS의 발현량이 감소하였다 (Fig.
IVE의 in vitro에서의 항염증작용을 확인하고, in vivo에서 carrageenan으로 유도된 rat의 paw edema 에 대한 IVE의 효과를 평가하였다. CA는 염증세포의 침윤을 동반한 급성부종을 초래하므로, 현재 항염증물질의 급성 염증에 대한 평가에 다용되고 있는 모델이다^40-42) .
Kim 등¹⁶⁾ 의 방법을 변형시켜, 발등 및 발바닥 피부 (상피에서 진피)의 두께를 ㎛ 단위로 40배 현미경 시야에서 자동영상분석장치 (iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Canada)를 이용하여 측정하였으며, 각각 mm²의 발등 및 발바닥 파부에 침윤된 염증세포의 수 역시 자동영상분석장치를 이용하여, 200배 현미경 시야에서 측정하였다.
/ml)을 분주하고 IVE를 농도별로 처치한 다음, 1시간 후에 LPS를 처치하였다. LPS 처치 후 각 cytokine 및 PGE₂ 마다 특정 시간에 배지를 수거하여 측정하였다. Tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β와 IL-6, PGE₂는 ELISA Kit (Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였다.
4일째 약물을 투여하고 1시간 후 CA를 주입하여 paw edema를 유발시켰다. Paw edema의 측정은 CA 주입 후 0, 1, 2, 3, 4시간에 부종측정기 (Plethysmometer, LE 7500; LETICA Scientific Instruments, Spain)를 이용하여 부종 정도를 측정하였다.
Raw 264.7 cells로부터 생성된 NO의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂- 의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. IVE를 1시간 전처치한 후, LPS를 24시간 처치한 다음, 세포배양 상등액 50 ㎕에 Griess 시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H₂O) 50 ㎕를 96 well plate에 혼합하고 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)로 흡광도를 측정하였다.
Raw 264.7 cells에서 IVE의 NO 생성억제정도를 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. IVE를 10∼300 ㎍/ml의 농도로 24시간 세포에 처리하여 생성되는 NO양을 측정하였다.
Raw 264.7 cells에서 IVE의 세포독성을 MTT assay로 조사하였다. Raw 264.
Tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β와 IL-6, PGE2는 ELISA Kit (Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였다.
大茴香추출물 (IVE)의 항염증효능을 평가하기 위하여 in vitro에서 Raw 264.7 cells을 LPS로 활성화시킨 후 NO, iNOS, NFκB의 발현 및 cytokine, PGE2에 미치는 영향을 관찰하고, in vivo에서는 CA로 유도된 rat의 paw edema에 미치는 영향을 관찰한 바 다음과 같은 결론을 얻었다.
그러나 大茴香의 항염증효과의 기전연구는 극히 제한적인 실정으로, 본 연구에서는 大茴香 추출물의 항염증기전 및 염증관련 cytokine의 발현에 대한 연구를 lipopolysaccharaide (LPS)로 활성화된 Raw 264.7 cells모델에서, carrageenan (CA)으로 유도된 rat의 paw edema에 대한 항염증효과를 수행하였다.
또한 LPS와 IVE의 동시처리에 의한 세포생존율도 IVE를 10∼300 ㎍/ml의 농도로 1시간 동안 처치하고, LPS를 후처치하여 24시간 배양한 후, 동일한 방법으로 세포생존율을 구하였다.
또한, iNOS의 발현에는 전사인자 NFκB가 핵심적 역할을 하므로, 세포질에서 p-IκBα, 핵내에서의 NFκB의 발현을 평가하였다.
CA는 염증세포의 침윤을 동반한 급성부종을 초래하므로, 현재 항염증물질의 급성 염증에 대한 평가에 다용되고 있는 모델이다^40-42) . 본 연구에서도 CA는 1, 2, 3, 4 시간에 유의한 paw edema를 유발하였으며, IVE 0.3 g/kg를 투여한 군에서는 1, 4 시간에, IVE 1.0 g/kg를 투여한 군에서는 1, 3, 4시간에 유의한 억제를 나타내었다. 또한 CA의 국소적용은 염증세포 침윤을 동반한 급성부종을 초래하고, 조직학적으로는 투여부위에 국소적 염증세포 침윤을 동반한 피부 조직의 부종이 관찰되는 것으로 알려져 있다^43-46) .
세포독성을 나타내지 않은 IVE의 10∼300 ㎍/ml 농도에서 Raw 264.7 cells에서 생성되는 NO의 양을 평가하 였다.
실험은 아무런 처치를 하지 않은 군을 Control군으로 하고 기염제인 carrageenan (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA; 100 ㎕/rat)만을 피하주사한 군을 CA군으로 하였으며, carrageenan과 dexamethasone (1 mg/kg, p.o.)을 투여한 DEXA군, carrageenan과 0.3 g/kg의 IVE를 투여한 0.3 g/kg IVE군, carrageenan과 1.0 g/kg의 IVE를 투여한 1.0 g/kg IVE군으로 나누었으며, 각 군당수는 5마리로 하였다. Dexamethasone과 IVE는 4일 동안 매일 1회 투여하였으며, 마지막 약물투여 1시간 후 carrageenan을 100 ㎕/rat로 rat의 오른쪽 발바닥에 주입하였다.

대상 데이터

大茴香은 대원약업사 (대구)에서 구입하였으며, 大茴香 300 g을 물 1.5 L에 넣고 약탕기(대웅, 한국)로 3시간 추출한 후, 거어즈로 1차 여과하고 3000×g에서 3분간 원심분리하였다.
본 연구에 사용된 Murine macrophage cell line인 Raw 264.7 cells은 한국세포주연구재단 (Seoul, Korea)에서 구입하였으며, DMEM에 10% fetal bovine serum(FBS), 100 U/ml penicillin 및 100 ㎍/ml streptomycin 을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂환경이 유지 되는 배양기에서 배양하였다. 실험과정의 모든 cells은 80〜90%의 confluence에서 실험하였고, 20 passages를 넘기지 않은 cells만 사용하였다.
7 cells은 한국세포주연구재단 (Seoul, Korea)에서 구입하였으며, DMEM에 10% fetal bovine serum(FBS), 100 U/ml penicillin 및 100 ㎍/ml streptomycin 을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂환경이 유지 되는 배양기에서 배양하였다. 실험과정의 모든 cells은 80〜90%의 confluence에서 실험하였고, 20 passages를 넘기지 않은 cells만 사용하였다.
실험동물은 4주령 된 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐 (130-160 g)를 1주일 동안 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 사육실 환경은 온도 20-23℃, 습도 60%, 12시간 light/dark cycle을 유지하고, 사료 (Nestle Purina Petcare Korea, Seoul, Korea)와 음료는 자유롭게 섭취하도록 하였다.

데이터처리

실험 결과는 mean ± SD로 나타내었으며, 처치군 간의 유의성은 one way analysis of varience (ANOVA)로 검정한 후 Newman-Kleuls test로 검정하였다.

이론/모형

단백질의 발현은 ECL western blotting detection reagents (Amersham) 를 사용하여 manufacturer's instruction에 따라 발색 하였다.

성능/효과

1. IVE는 세포독성을 나타내지 않았으며, LPS에 의해 증가된 NO의 생성량을 유의하게 억제하였다.
2. IVE는 LPS로 증가된 세포질에서의 p-IκBα의 발현을 억제하였으며, 핵분획에서의 NFκB의 발현을 억제하였다.
4. IVE는 CA로 유도된 rat의 paw edema 및 이에 따른 급성 염증 소견을 유의하게 억제하였다.
Control군을 100.00 ± 3.64 %으로 하였을 때, LPS군은 71.93 ± 0.60 %이었으며, IVE처리군은 10, 30, 100 and 300 ㎍/ml의 농도에서 각각 73.85 ± 0.42, 79.24 ± 3.06, 81.90 ± 0.46, 89.04 ± 6.52 (%)를 나타내어 LPS단독처리군에 비교하여 유의한 세포독성을 나타내지 않았다 (Fig. 3A) 또한 세포생존율 대비 NO를 비교하였을 때에도 IVE는 10, 30, 100 및 300 ㎍ /ml의 농도에서 LPS 단독처리군에 비교하여 각각 321.35 ± 19.23, 301.08 ± 9.14, 243.02 ± 6.81, 165.00 ± 2.72 (%)로 NO의 생성을 억제하였다 (Fig. 3B).
IL-1β는 LPS에 의해 2.17 ± 0.20배로 유의하게 증가하였으며, IVE는 100, 300 (㎍/ml)의 농도에서 1.48 ± 0.07, 0.69 ± 0.04배로 모두 유의하게 IL-1β의 생성량을 줄였다 (Fig. 5B).
IVE 0.3 g/kg 투여 군에서는 1∼4 시간에 각각 1.18 ± 0.07, 1.55 ± 0.11, 1.58 ± 0.09, 1.45 ± 0.13배를 나타내어 1, 4 시간에 각각 paw edema를 유의하게 억제하였으며, IVE 1.0 g/kg 투여 군에서는 각각 1.14 ± 0.04, 1.50 ± 0.06, 1.52 ± 0.05, 1.38 ± 0.05배로 1, 3, 4시간에 유의한 억제를 나타내었다 (Fig. 7).
IVE가 in vitro에서 염증매개물질을 억제함을 확인하고, in vivo 모델로서 CA로 유도된 paw edema를 측정한 결과, CA군에서는 1, 2, 3, 4 시간에 각각 1.44 ± 0.16, 1.63 ± 0.15, 1.71 ± 0.10, 1.65 ± 0.08배를 나타내어, 전시간 유의한 paw edema가 유발되었다.
LPS는 TNF-α의 분비를 110.56 ± 0.60배로 유의하게 증가시켰으며, IVE는 100, 300 ㎍/ml의 농도에서 TNF-α의 생성량을 각각 77.30 ± 0.14배, 66.12 ± 7.57배로 유의하게 감소시켰다 (Fig. 5A).
IVE는 10과 30 ㎍/ml의 농도에서는 감소하는 경향을 보였으나 유의한 감소를 나타내지 않았으며, 100과 300 ㎍/ml의 농도에서는 각각 유의한 감소를 나타내었다. NO의 측정조건과 동일한 조건인 LPS (+/-) IVE에서의 세포독성은 LPS + IVE처리군은 전농도에서 LPS 단독처리군에 비교하여 유의한 세포독성을 나타내지 않았으며, 전농도에서 LPS군에 비교하여 증가하는 경향을 나타내었다. 이는 Sharifi 등³⁵⁾ 의 연구 결과인 납에 의한 PC-12 cell의 독성은 NO의 과다생성으로 유발되고, L-NAME에 의해 독성이 억제된 것처럼본 연구결과는 LPS에 의해 증가된 NO의 Raw 264.
PGE2는 Control군에서 20.23 ± 8.60 pg/ml을 나타내었고, LPS는 3016.04 ± 34.98로 PGE2를 유의하게 증가시켰으며, IVE는 100과 300 ㎍/ml에서 LPS로 증가된 PGE2를 각각 1350.81 ± 59.56, 300.74 ± 77.66 (pg/ml)로 유의하게 농도의존적으로 감소시켰다 (Fig. 6).
그러나 paw edema 유도 후 dexamethasone 을 처치한 DEXA군에서는 각각 1.10 ± 0.05, 1.11 ± 0.04, 1.16 ± 0.04, 1.08 ± 0.08배로 실험 전시간 동안 유의한 paw edema 억제를 나타내었다.
또한 LPS는 IL-6의 생성을 121.91 ± 2.94배로 유의하게 증가시켰으며, IVE는 100, 300 ㎍/ml의 농도에서 각각 57.27 ± 1.44, 34.00 ± 1.52배로 LPS로 유도된 IL-6를 유의하게 감소시켰다(Fig. 5C).
먼저, IVE가 Raw 264.7 cells에 미치는 세포생존율을 평가한 결과, IVE는 10∼1000 ㎍/ml의 농도의 24시간 처치에서 유의한 세포독성을 나타내지 않았다.
발바닥 부위의 피부두께에 있어서도 Control군은 381.33 ± 42.19이었으나, CA군에 있어서는 864.73 ± 37.75로 유의하게 증가하였으며, 이러한 발바닥 피부의 두께 역시 DEXA군에서 496.88 ± 30.69로 유의하게 감소하였고, IVE 0.3, 1.0 g/kg를 처치한 실험군에서 667.13 ± 45.06, 623.31 ± 54.59 (㎛)으로 유의하게 감소하였다 (Table 1, Fig. 9).
또한 CA의 국소적용은 염증세포 침윤을 동반한 급성부종을 초래하고, 조직학적으로는 투여부위에 국소적 염증세포 침윤을 동반한 피부 조직의 부종이 관찰되는 것으로 알려져 있다^43-46) . 본 실험의 결과에서도 현저한 침윤 염증세포의 수적 증가 및 부종성 변화에 의한 발등 및 발바닥 피부 두께의 증가가 CA 처리에 의해 인정되었 으나, dexamethasone 및 IVE 0.3과 1.0 mg/ml 투여에 의해 CA 유발 급성 부종성 소견 및 염증세포 침윤이 유의하게 억제되었다.
본 연구에서 LPS는 TNF-α, IL-1β, IL-6의 분비를 유의성있게 증가시켰으며, IVE는 100, 300 ㎍/ml의 농도에서 각 cytokine의 생성량을 유의하게 감소시켰다.
부종발의 발등조직에서 침윤 염증세포의 수는 Control군에서는 34.00 ± 13.10이었으며, CA군은 221.40 ± 27.75로 유의하게 증가하였으며, 이러한 염증세포의 증가는 DEXA군에서 54.80 ± 15.32로 유의하게 감소하였고, IVE 0.3, 1.0 g/kg의 처치한 실험군에서는 118.60 ± 18.89, 82.20 ± 7.40 (cells/mm2)을 나타내어 유의하게 감소되었다 (Table 1, Fig. 8).
세포질에서 p-IκBα는 LPS처치에 의하여 뚜렷하게 증가하였으나, IVE의 전처치에 의하여 증가된 p-IκBα가 현저하게 감소되었으며 (Fig. 4B), 핵분획에서의 NFκB는 LPS 처치에 의해 증가하였으나, IVE의 전처치에 의하여 NFκB량이 감소하였다 (Fig. 4C).
이러한 in vitro의 결과는 IVE가 LPS에 의해 활성 화되는 p-IκBα의 인산화를 억제하여 NFκB pathway를 억제함으로서 다양한 염증매개물질을 억제 함을 나타낸다.
이러한 염증세포의 침윤은 발등조직에서와 마찬가지로 DEXA군에서 337.20 ± 94.52로 유의하게 감소하였고, IVE 0.3, 1.0 g/kg의 처치에 의해 535.00 ± 119.19, 426.80 ± 52.22 (cells/mm2)로 유의하게 염증세포의 침윤을 억제하였다 (Table 1, Fig. 9).
이상의 연구결과는 IVE가 in vitro에서 NFκB pathway를 억제함으로써 다양한 염증매개물질을 억제하며, in vivo에서도 투여용량 의존적으로 CA 유발 급성 부종성 염증을 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며, 이는 IVE의 항염증효과를 나타내는 직접적인 증거로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	大茴香이란?	f.)은 주로 아시아의 (아)열대에서 생산되는 상록수의 열매이며, 약재의 모양에 8각형임에 따라 八角香, 八角, 八角大茴, 茴香八角珠라고도 한다. 辛溫하고 脾腎經에 주로 작용하며, 溫陽, 散寒, 理氣하여 中寒嘔吐, 寒疝腹痛, 腎虛腰痛, 乾/濕脚氣를 치료한다 1) .
	大茴香은 약용 및 향신료로서 뿐만 아니라 근래에는 어떤곳에 사용되고 있는가?	大茴香은 약용 및 향신료로서 뿐만 아니라 근래에는 항바이러스약인 Tamiflu (oseltamivir phosphate)를 만드는 기본 성분인 shikimic acid를 만드는 소재로 사용되고 있다. Tamiflu는 조류독감 바이러스인 H5N1 계열의 바이러스를 치료하는 것으로 여겨지고 있으며, 현재 oseltamivir는 조류독감의 심각성을 줄일 수 있는 유일한 약으로 평가받고 있다 3) .
	大茴香은 어디에 주로 작용하는가?	)은 주로 아시아의 (아)열대에서 생산되는 상록수의 열매이며, 약재의 모양에 8각형임에 따라 八角香, 八角, 八角大茴, 茴香八角珠라고도 한다. 辛溫하고 脾腎經에 주로 작용하며, 溫陽, 散寒, 理氣하여 中寒嘔吐, 寒疝腹痛, 腎虛腰痛, 乾/濕脚氣를 치료한다 1) . 大茴香은 중국남서부 및 베트 남북부에서 다량 생산되며 anethol과 같은 oil 및 flavonol (quercetin, kaempferol), anthocyanins, tanins, phenolics acids, gallic acid 등과 같은 polyphenol 을 함유하고 있다 2,3) .

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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