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문제 정의
- 토착미생물을 이용한 미생물 제제는 화학농약에 비해 약효가 낮고, 환경에 따른 효과의 변동이 심한 문제점이 있으나, 화학적으로 안전하고 농업생태계에 미치는 영향 또한 낮다는 이점이 있어 생물학적 방제의 한 방법으로 많은 연구가 진행되고 있다. 본 연구는 수확기에 발생하여 여러 과실의 상품성저하를 유발하는 T. roseum을 제어하기 위한 길항균을 선발, 동정하여 보고한다.
제안 방법
- 길항균을 분리하기 위해 채집한 토양 1 g을 멸균증류수 9 ㎖에 첨가하여 이 중 1 ㎖을 취하여 10-5 배까지 희석하였다. 혼합한 희석액을 미리 준비한 NA (Nutrient broth, MBcell) 배지에 0.
- roseum과 대치배양(dual culture)을 통한 억제환 생성법(inhibition zone method)으로길항균을 선발하였다. 길항균 선발을 위한 후보 균주 colony들을 병원균의 가장자리로부터 1 ㎝ 떨어진 위치에 접종하고 25℃, 암조건에서 7일간 배양한 후 두 병원균의 생장을 억제하는 생육 억제 환이 10 ㎜~20 ㎜ 이상 보이는 균주들을 최종적으로 선발하였다. 최종 선발된 길항균주는 0.
- roseum 균주를 액체 배양하여 사용하였다. 먼저 길항세균은 Nutrient broth 배지에서 28℃, 48시간 미리 배양하여 2.4% Potato dextrose broth (PDB) 에 10% vol로 첨가하고 T. roseum의 균사체를 접종하여 28℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 건조 중량은 미리 무게를 측정해 놓은 Whatman No.
- roseum의 균사체를 접종하여 28℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 건조 중량은 미리 무게를 측정해 놓은 Whatman No. 2 filter paper에 병원균의 균체 발육량으로 측정하여 항진균 활성을 조사하였다.
- 최종 선발된 균주는 다양한 생화학적 및 분자생물학적 방법에 의해 균주 동정을 하였다. 생화학적 동정으로는 API 50 CHB® Kit (BioMerieux, France)를 이용하여 균의 탄소원 이용능을 분석하였고, 분자생물학적 동정으로는 균의 16S rDNA의 염기서열을 비교하였다.
- 의해 균주 동정을 하였다. 생화학적 동정으로는 API 50 CHB® Kit (BioMerieux, France)를 이용하여 균의 탄소원 이용능을 분석하였고, 분자생물학적 동정으로는 균의 16S rDNA의 염기서열을 비교하였다. HK2 균주를 TSA (Tryptic soy agar) 배지에도 말 후 single colony를 nutrient broth (NB) 배지에서 접종하여 24시간동안 배양한 배양액을 API 50 CHB에 접종하여 48시간 이후의 반응결과를 관찰하였다.
- 생화학적 동정으로는 API 50 CHB® Kit (BioMerieux, France)를 이용하여 균의 탄소원 이용능을 분석하였고, 분자생물학적 동정으로는 균의 16S rDNA의 염기서열을 비교하였다. HK2 균주를 TSA (Tryptic soy agar) 배지에도 말 후 single colony를 nutrient broth (NB) 배지에서 접종하여 24시간동안 배양한 배양액을 API 50 CHB에 접종하여 48시간 이후의 반응결과를 관찰하였다. 16S rDNA 증폭을 위해 universal primer 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 와 1492R (5'-AGG GAG GTG ATC CAG CCG C-3') primer를 사용하였다(Min, 2011).
- 길항세균 배양액에 함유된 항진균물질이 휘발성물질에 의한 균사 생장 억제 효과인지 판단하기 위해 I-plate petri-dish를 사용하여 실험하였다. I-plate petri-dish 한 쪽에는 Potato dextrose agar (PDA)배지를 분주하여 T.
- HK2 균주의 항진균 물질 분리는 먼저 조추출물에 증류수와 methanol을 첨가하여 고체상추출 catridge를 이용한 추출과정을 수행하였다. 추출을 위해 Strata C18-E (55㎛, 70A, Phenomenex) catridge를 Methanol과 증류수를 각각 10 ㎖로 활성화하고 시료를 5~6 ㎖/min의 유속으로 용출시켰다.
- 수행하였다. 추출을 위해 Strata C18-E (55㎛, 70A, Phenomenex) catridge를 Methanol과 증류수를 각각 10 ㎖로 활성화하고 시료를 5~6 ㎖/min의 유속으로 용출시켰다. Catridge에 흡착된 대상 물질은 methanol 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100%로 조정된 용액을 10 ㎖씩 순차적으로 주입하여 용출시켰다.
- 추출을 위해 Strata C18-E (55㎛, 70A, Phenomenex) catridge를 Methanol과 증류수를 각각 10 ㎖로 활성화하고 시료를 5~6 ㎖/min의 유속으로 용출시켰다. Catridge에 흡착된 대상 물질은 methanol 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100%로 조정된 용액을 10 ㎖씩 순차적으로 주입하여 용출시켰다. 용출액은 speed vaccum evaporator (CVE-100D, EYELA, Japan)로 농축한 다음 시료의 무게를 잰 후 각각의 농도별 Methanol로 10,000 ppm이 되도록 농도를 조정하였다.
- 추출을 위해 Strata C18-E (55㎛, 70A, Phenomenex) catridge를 Methanol과 증류수를 각각 10 ㎖로 활성화하고 시료를 5~6 ㎖/min의 유속으로 용출시켰다. Catridge에 흡착된 대상 물질은 methanol 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100%로 조정된 용액을 10 ㎖씩 순차적으로 주입하여 용출시켰다. 용출액은 speed vaccum evaporator (CVE-100D, EYELA, Japan)로 농축한 다음 시료의 무게를 잰 후 각각의 농도별 Methanol로 10,000 ppm이 되도록 농도를 조정하였다.
- Catridge에 흡착된 대상 물질은 methanol 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100%로 조정된 용액을 10 ㎖씩 순차적으로 주입하여 용출시켰다. 용출액은 speed vaccum evaporator (CVE-100D, EYELA, Japan)로 농축한 다음 시료의 무게를 잰 후 각각의 농도별 Methanol로 10,000 ppm이 되도록 농도를 조정하였다. 용출액은 0.
- 용출액은 speed vaccum evaporator (CVE-100D, EYELA, Japan)로 농축한 다음 시료의 무게를 잰 후 각각의 농도별 Methanol로 10,000 ppm이 되도록 농도를 조정하였다. 용출액은 0.2 ㎛ filter로 filtering 을 한 후 T. roseum를 대상으로 항진균 활성을 조사하였다.
- Catridge에 흡착된 대상물질은 methanol 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100%로 조정된 용액을 10 ㎖씩 순차적으로 주입하여 용출시켰다. 용출액은 speed vac (CVE-100D, EYELA, Japan)으로 농축한 다음 시료의 무게를 잰 후 각각의 농도별 methanol로 10000 ppm이 되도록 농도를 조정하였다. 용출액은 0.
- 용출액은 speed vac (CVE-100D, EYELA, Japan)으로 농축한 다음 시료의 무게를 잰 후 각각의 농도별 methanol로 10000 ppm이 되도록 농도를 조정하였다. 용출액은 0.2 ㎛ filter 로 filtering을 한 후 T. roseum을 대상으로 항진균 활성을 조사하였다. 실험 결과 80~100%의 methanol 용출분획이 높은 항균 활성을 나타내었다.
- 최종 선발한 HK2 균주에 대한 생화학적 및 분자생물학적 동정을 하였다. 먼저 API kit (BioMerieux, France)를 이용한 당기 질에 대한 이용능 시험(Table 2)과 이에 대한 API 분석프로그램(Biomerieux, France)의 동정 결과, HK2 균주는 Bacillus 속에 속하는 균주로 확인되었다.
- 대치배양결과 T. roseum의 균사 생장을 억제한 물질이 휘발성인지 알아보기 위하여 I-plate Petri-dish를 사용하여 배양한 결과 억제 기작을 보이지 않았다. 따라서 HK2 균주가 생성하는 항균물질의 특성이 휘발성 물질은 아닌 것임을 확인하였다 (Table 3).
- Bacillus subtilis HK2의 항균 물질 추출을 위해 Strata C18-E (55 ㎛, 70A, Phenomenex) catridge를 methanol과 증류수 각 10 ㎖로 활성화하고 시료를 5~6 ㎖/min의 유속으로 용출시켰다. Catridge에 흡착된 대상물질은 methanol 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100%로 조정된 용액을 10 ㎖씩 순차적으로 주입하여 용출시켰다.
대상 데이터
- 2012년부터 2013년에 걸쳐 전국 12개 지역의 잡초 근권과 비근권 토양을 수집하여 4℃의 저온실에 보관하고 실험에 이용하였다. 길항균을 분리하기 위해 채집한 토양 1 g을 멸균증류수 9 ㎖에 첨가하여 이 중 1 ㎖을 취하여 10-5 배까지 희석하였다.
- 길항균주가 T. roseum 생육을 억제하는 길항 효과를 측정하기 위해 선발된 길항미생물 배양액과 T. roseum 균주를 액체 배양하여 사용하였다. 먼저 길항세균은 Nutrient broth 배지에서 28℃, 48시간 미리 배양하여 2.
- HK2 균주를 TSA (Tryptic soy agar) 배지에도 말 후 single colony를 nutrient broth (NB) 배지에서 접종하여 24시간동안 배양한 배양액을 API 50 CHB에 접종하여 48시간 이후의 반응결과를 관찰하였다. 16S rDNA 증폭을 위해 universal primer 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 와 1492R (5'-AGG GAG GTG ATC CAG CCG C-3') primer를 사용하였다(Min, 2011). PCR 반응조건은 predenaturation을 94℃에서 5분, denaturation을 94℃에서 30초, annealing을 58℃에서 40초, elongation을 72℃에서 90초간 진행하여 30회 반복한 후 final extension을 72℃에서 5분간 실시하였다.
이론/모형
- 1 ㎖씩 도말하여 25℃의 인큐베이터(Eyela, JP/LTI-1001ED) 에서 3일간 배양하였다. 평판배지에 형성된 세균 균총의 색과 형태적 특징에 따라 선발된 세균의 single colony를 백금이로 순수 분리한 782개 균주를 tryptic soy agar (TSA)배지와 PDA (patato dextrose agar)배지에서 T. roseum과 대치배양(dual culture)을 통한 억제환 생성법(inhibition zone method)으로길항균을 선발하였다. 길항균 선발을 위한 후보 균주 colony들을 병원균의 가장자리로부터 1 ㎝ 떨어진 위치에 접종하고 25℃, 암조건에서 7일간 배양한 후 두 병원균의 생장을 억제하는 생육 억제 환이 10 ㎜~20 ㎜ 이상 보이는 균주들을 최종적으로 선발하였다.
- Phylogenetic position of HK2 within the genus Bacillus. The branching pattern was generated by neighbor-joining tree method. The Gene bank accession numbers of the 16S rDNA nucleotide sequences are indicated in brackets.
성능/효과
- roseum과 분리균들을 대치배양한 결과 몇몇 균의 경우 저지 원이 형성되었다. 저지원이 형성된 부분의 T. roseum 균사를 광학현미경으로 관찰한 결과 무처리 대조구의 정상적인 균사의 형태와 비교해 세포 내 공포화가 진행되고 부풀어 오르는 등의 기형적인 형태를 띠는 것을 확인하였다(Fig. 1). 이와 같은 저지원 주변 균사의 기형적인 형태는 길항미생물의 다양한 길항물질에 의한 전형적인 증상으로 알려져 있다(Sang et al.
- HK2 균주와 병원균을 NB배지에서 액체배양 한 결과 88% 이상의 균사 생육 억제효과를 보였다(Table 1). 액체배지 상에서 균사가 자라지 못하고 배지가 현탁되어 뿌옇게 되는 것을 볼 수 있었다.
- 하였다. 먼저 API kit (BioMerieux, France)를 이용한 당기 질에 대한 이용능 시험(Table 2)과 이에 대한 API 분석프로그램(Biomerieux, France)의 동정 결과, HK2 균주는 Bacillus 속에 속하는 균주로 확인되었다. 선발 세균을 16S rDNA의 염기서열을 비교 분석한 결과 HK2 균주는 그람양성 세균 중 Bacillus 속에 속하는 Bacillus subtilis와 99.
- roseum을 대상으로 항진균 활성을 조사하였다. 실험 결과 80~100%의 methanol 용출분획이 높은 항균 활성을 나타내었다. T.
- 먼저 API kit (BioMerieux, France)를 이용한 당기 질에 대한 이용능 시험(Table 2)과 이에 대한 API 분석프로그램(Biomerieux, France)의 동정 결과, HK2 균주는 Bacillus 속에 속하는 균주로 확인되었다. 선발 세균을 16S rDNA의 염기서열을 비교 분석한 결과 HK2 균주는 그람양성 세균 중 Bacillus 속에 속하는 Bacillus subtilis와 99.9%의 유사성을 갖는 것으로 나타났다. 한편, 균주들의 16S rDNA 염기서열을 기준으로 균주들 간의 유연관계를 조사한 결과 HK2 균은 B.
- 9%의 유사성을 갖는 것으로 나타났다. 한편, 균주들의 16S rDNA 염기서열을 기준으로 균주들 간의 유연관계를 조사한 결과 HK2 균은 B. subtilis에 속하는 균주들 외에 B. amyloliquefaciens, B. pumilus 등의 균주들과도 매우 가까운 유연관계에 있음을 알 수 있었다(Fig. 2).
- roseum의 균사 생장을 억제한 물질이 휘발성인지 알아보기 위하여 I-plate Petri-dish를 사용하여 배양한 결과 억제 기작을 보이지 않았다. 따라서 HK2 균주가 생성하는 항균물질의 특성이 휘발성 물질은 아닌 것임을 확인하였다 (Table 3).
후속연구
- roseume 포도의 흰얼룩병, 멜론의 분홍빛 썩음병 등 여러 과실의 수확 후 병을 일으켜 상품성 저해 및 경제적 손실을 유발하고 있다. 따라서 본 결과는 여러 농산물에서 문제가 되는 T. roseum을 생물학적 방법으로 제어하기 위한 기초자료로 활용 될 수 있을 것이다.
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