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문제 정의
- 최근에는 ginsenoside 관련 시료 및 가공품들에 있어서의 함 량을 정량화하기 위하여 LC/MS 또는 LC/MS/MS 방법을 이용하여 함량을 정량분석화 하였다[17]. 본 저자는 새로운 CAD 검출기를 이용하여 산양삼내의 gensenoside 함량을 검량선을 토대로 정량화 하고자 한다.
제안 방법
- CAD (Ther- mo Scientific) detector를 이용하였고 질소는 35 psi로 도입되었다. HPLC분석은 C18 column (4.6 mm × 150 mm, 5 μm particle size, Phenomenex, USA) 컬럼을 사용하였고 이동상 은 water과 acetonitrile를 이용하여 gradient를 이용하여 분석 하였다(Table 1). 이동상의 유속, 분석시간, 검출파장은 각각 1 ml/min, 60분, 230 nm로 분석하였다.
- 따라서 이 표준곡선을 기준으로 시료의 ginsenoside 함 량을 정량 할 수 있었다. 또한, 분석의 정확성, 정밀성, 분석의 정량한계를 확인하기 위하여 표준곡선에 사용된 4가지 농도를 이용하였다. 대표적으로 ginsenoside의 Re를 이용하여 확 인 하였으며, 정확성에 있어서는 사용된 이론적인 농도값을 나타내었으며, 정밀성에 있어서는 the coefficients of variation (%CV) 값이 적절한 범위 내에 있음을 확인하였다(Table 2).
- 미량 사포닌의 검출이 어려운 점의 한계점으로 인해 정량분석을 위한 연구가 더욱 필요한 실정인데, 본 실험에서는 산양 삼을 에탄올 용매로 추출하여 얻어진 추출물내의 ginsenoside 종류를 Charged Aerosol Detection (CAD)를 이용하여 gin- sendoside를 분석 및 정량화 연구를 진행하였다.
- C에서 실험 전까지 보관하였다. 산양삼은 mechanical slicer를 이용하여 잘게 부 순 후 80oC에서dry tray (VISION, Kyungki, Korea)를 이용하여 건조하였다. 건조된 산양삼을 다시 갈고 난 뒤 건조된 산양삼 10 g에 95% EtOH 100ml을 넣어 80oC에서 24시간 동안 추출하였다.
- Table 1과 같egradient 방법으로 분석 시 모든 표준품들의 peak가 중첩되는 현상 없이 분리능이 우수한 결과를 나타내었 으며, 60분 내에서 분석이 가능한 분석법을 확립할 수 있었다.이 분석법을 토대로 표준품 ginsenoside Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb, Rde 10, 21, 42, 84, 168 μg/ml 농도로 희석하여 분석하고 여기에서 얻은 주성분에 대한 피크 표준품 농도(X축)와 면적 비(Y축)에 대한 검량선을 각각 작성하여 함수와 상관계수 R값을 나타내었다(Fig. 1). Fig.
- 6 mm × 150 mm, 5 μm particle size, Phenomenex, USA) 컬럼을 사용하였고 이동상 은 water과 acetonitrile를 이용하여 gradient를 이용하여 분석 하였다(Table 1). 이동상의 유속, 분석시간, 검출파장은 각각 1 ml/min, 60분, 230 nm로 분석하였다. 이러한 분석 조건으로 ginsenoside 표준품들은 MeOH를 이용하여 용해 시킨 뒤 HPLC-CAD 분석법에 의해 함량 및 산양삼 시료의 ginseno- side 함량을 정량 분석하였으며, 내부표준물질로는 digoxin을 이용하였다.
- 이동상의 유속, 분석시간, 검출파장은 각각 1 ml/min, 60분, 230 nm로 분석하였다. 이러한 분석 조건으로 ginsenoside 표준품들은 MeOH를 이용하여 용해 시킨 뒤 HPLC-CAD 분석법에 의해 함량 및 산양삼 시료의 ginseno- side 함량을 정량 분석하였으며, 내부표준물질로는 digoxin을 이용하였다.
대상 데이터
- Ethanole Merck (Germany)로부터 구입하였고, Ginseno- side 표준품 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rf, Rg1 Rg3, Rh1는 Aembo Institute (Daejeon, Korea)로부터 구입하였다. 내부표준물질 인 Digoxine Sigma (St.
- 산양삼은 경상남도 함양군에 위치한 농장으로부터 획득하 였고, 산양삼은 불순물을 제거한 후 -80oC에서 실험 전까지 보관하였다. 산양삼은 mechanical slicer를 이용하여 잘게 부 순 후 80oC에서dry tray (VISION, Kyungki, Korea)를 이용하여 건조하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복으로 진행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 통계 프로그램은 Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft, USA)를 사용하였다. 유의차 검증은 분산분석 (Analysis of variance ANOVA)을 한 후, P<0.
- 모든 실험은 3회 반복으로 진행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 통계 프로그램은 Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft, USA)를 사용하였다. 유의차 검증은 분산분석 (Analysis of variance ANOVA)을 한 후, P<0.05 수준에서 Student’s t-test에 의해 유의성을 분석하였다.
성능/효과
- Corbit [7] 등은 100% MeOH로 60oC에서 환류추출이 ginsenoside 함량이 높다는 보고가 있어 본 실험에서도 정확한 분리능을 확인 하기 위하여 95% MeOH로 80oC로 추출하였다. 10 g의 건조 산양삼을 이용하여 추출하였을 때 0.996~1.005 g의 추출물이 나왔으며, 이 중 산양삼 추출물의 구성 ginsenoside 함량을 보면 Rb1 (5.48±0.12 mg/g), Rd (5.33±0.14 mg/g), Rg1 (12.80±0.05 mg/g), Rf (19.08 ±0.68 mg/g), Re (19.87±0.05 mg/g), 및 Rh1 (16.47±0.16 mg/g)으로 나타났다(Fig. 3). PT 그룹이 PD 그룹의 ginsenosides의 함량보다 높게 나타났다.
- Table 1과 같egradient 방법으로 분석 시 모든 표준품들의 peak가 중첩되는 현상 없이 분리능이 우수한 결과를 나타내었 으며, 60분 내에서 분석이 가능한 분석법을 확립할 수 있었다.이 분석법을 토대로 표준품 ginsenoside Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb, Rde 10, 21, 42, 84, 168 μg/ml 농도로 희석하여 분석하고 여기에서 얻은 주성분에 대한 피크 표준품 농도(X축)와 면적 비(Y축)에 대한 검량선을 각각 작성하여 함수와 상관계수 R값을 나타내었다(Fig.
- 또한, 분석의 정확성, 정밀성, 분석의 정량한계를 확인하기 위하여 표준곡선에 사용된 4가지 농도를 이용하였다. 대표적으로 ginsenoside의 Re를 이용하여 확 인 하였으며, 정확성에 있어서는 사용된 이론적인 농도값을 나타내었으며, 정밀성에 있어서는 the coefficients of variation (%CV) 값이 적절한 범위 내에 있음을 확인하였다(Table 2). 최근에는 ginsenoside 관련 시료 및 가공품들에 있어서의 함 량을 정량화하기 위하여 LC/MS 또는 LC/MS/MS 방법을 이용하여 함량을 정량분석화 하였다[17].
- PD/PT 비율은 최근 당뇨병에 관한 치료에 있어 중요한 약리작용을 나타낸다는 보고가 되고 있어 중요한 요소로 평가 받고 있다[21]. 중추 신 경계에 작용하여 진정효과를 보이는 Rb1은 0.55%, 항피로작 용을 나타내는 Rg1은 1.30%로 다소 높게 나타났다. Rb1은 홍 삼을 이용하여 식품공전법으로부터 추출한 결과와 유사하였 다[12].
- Rb1은 홍 삼을 이용하여 식품공전법으로부터 추출한 결과와 유사하였 다[12]. 항 당뇨성분으로 알려져 있는 Re는 1.98%로 함량이 높게 차지함을 확인하였다. 혈관이완효과와 혈관신생억제효과가 있는 것으로 알려져 있는 Rg3는 아주 미량으로 검출되어 정량화는 하지 않았으며, 여러 추출방법을 통하여 정량화 하 여야 할 것이다[4].
- 5%이다. 현재의 결과에서는 3.26%, 3.81%로 인 삼의 기준인 중국수입의약품 등록기준에도 적합함을 확인 하였다. Ginsenoside 함량은 가공삼의 종류, 추출 방법등에 의해 함량이 크게 차이가 난다.
후속연구
- Ginsenoside 함량은 가공삼의 종류, 추출 방법등에 의해 함량이 크게 차이가 난다. 산양삼의 추출물에 대하여 여러 약 리 활성을 확인하고 제품화 하기 위하여서는 정확한 Ginseno- side 분석법을 제공하여야 할 것이다.
- 일반적으로 증숙/건조 과정을 거치거나 수삼이 사포닌 함량이 높다[4]. 현, 실험에서도 산양 삼을 건조가 아닌 증숙/건조 과정을 거쳐 PD/PT 비율을 높일 수 있는 연구가 필요 할 것으로 사료된다. PD/PT 비율은 최근 당뇨병에 관한 치료에 있어 중요한 약리작용을 나타낸다는 보고가 되고 있어 중요한 요소로 평가 받고 있다[21].
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