한약진흥재단(NIKOM)의 640-천연물 라이브러리를 PC12세포에 10 μg/ml/day로 처리하였다. 면역강화에 관여하는 ERAP1 (Endoplasmic Reticulum AminoPeptidase 1)과 수명연장에 관여하는 FOXO1 (FOXO-family transcription factor) 유전자발현을 RT-PCR로 확인하였다. ERAP1 유전자를 1.5-2배까지 상승시킨 것은 22개, 2배 이상 발현시킨 것은 14개였다. FOXO1 유전자를 1.5-2배까지 상승시킨 것은 총 24개, 2배 이상 발현시킨 것은 4개였다. 동시에 ERAP1과 FOXO1 유전자를 2배 이상 상승시키는 것은 족도리풀(Asiasari radix)에서 분리된 (±)-Car-3-ene-2,5-dione, 두꺼비(Bufonis venenum)에서 분리된 Cinobufagin, 대국(Euphorbiae pekinensis)에서 분리된 Corilagin, 현호색(Corydalis tuber)에서 분리된 Corydaline 4종이다. 이들 4종의 천연물은 초파리를 이용한 개체의 수명연장실험에 사용될 것이다.
한약진흥재단(NIKOM)의 640-천연물 라이브러리를 PC12세포에 10 μg/ml/day로 처리하였다. 면역강화에 관여하는 ERAP1 (Endoplasmic Reticulum AminoPeptidase 1)과 수명연장에 관여하는 FOXO1 (FOXO-family transcription factor) 유전자발현을 RT-PCR로 확인하였다. ERAP1 유전자를 1.5-2배까지 상승시킨 것은 22개, 2배 이상 발현시킨 것은 14개였다. FOXO1 유전자를 1.5-2배까지 상승시킨 것은 총 24개, 2배 이상 발현시킨 것은 4개였다. 동시에 ERAP1과 FOXO1 유전자를 2배 이상 상승시키는 것은 족도리풀(Asiasari radix)에서 분리된 (±)-Car-3-ene-2,5-dione, 두꺼비(Bufonis venenum)에서 분리된 Cinobufagin, 대국(Euphorbiae pekinensis)에서 분리된 Corilagin, 현호색(Corydalis tuber)에서 분리된 Corydaline 4종이다. 이들 4종의 천연물은 초파리를 이용한 개체의 수명연장실험에 사용될 것이다.
We have screened four natural products against 640 single compounds, which shows more two folds gene expression for both endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 (ERAP1) and FOXO-family transcription factor (FOXO1). The results were as follows. (±)-Car-3-ene-2,5-dione from Asarum sieboldii Miq. i...
We have screened four natural products against 640 single compounds, which shows more two folds gene expression for both endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 (ERAP1) and FOXO-family transcription factor (FOXO1). The results were as follows. (±)-Car-3-ene-2,5-dione from Asarum sieboldii Miq. is C10H12O2 molecular formula and the 164 kDa molecular weight. Cinobufagin from Bufonis Venennum is C26H34O6 molecular formula and 442 kDa molecular weight. So far reported main biological function is Na+/K+-ATPase inhibition. Corilagin from Euphorbia pekinensis is C27H22O18 molecular formula and 634 kDa molecular weight. Carbonic anhydrase inhibition is well known its biological function. Corydaline from Corydalis turtschaninovii is C22H27NO4 molecular formula and 369 kDa molecular weight. The main biological function is acetylcholinesterase inhibition. In the short future, four types of natural products will be used in longevity experiments with insects. The results may give one of the clues for studying new drug development candidates of the longevity.
We have screened four natural products against 640 single compounds, which shows more two folds gene expression for both endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 (ERAP1) and FOXO-family transcription factor (FOXO1). The results were as follows. (±)-Car-3-ene-2,5-dione from Asarum sieboldii Miq. is C10H12O2 molecular formula and the 164 kDa molecular weight. Cinobufagin from Bufonis Venennum is C26H34O6 molecular formula and 442 kDa molecular weight. So far reported main biological function is Na+/K+-ATPase inhibition. Corilagin from Euphorbia pekinensis is C27H22O18 molecular formula and 634 kDa molecular weight. Carbonic anhydrase inhibition is well known its biological function. Corydaline from Corydalis turtschaninovii is C22H27NO4 molecular formula and 369 kDa molecular weight. The main biological function is acetylcholinesterase inhibition. In the short future, four types of natural products will be used in longevity experiments with insects. The results may give one of the clues for studying new drug development candidates of the longevity.
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제안 방법
ERAP1 & FOXO1 유전자에 해당하는 primer를 이용하여 reverse transcription-PCR을 수행하였다. 본 실험에 사용된 primer는 다음과 같다.
본 실험에 사용된 primer는 다음과 같다. ERAP1-F 5’-GCC TGA AGA ACC ACT GAA GC-3’ & ERAP1-R 5’- AGC AGC TGT GGG TTC AAA CT-3’, FOXO1-F 5’-AAC CAG CTC AAA CGC TAG CAC CAT C-3’, FOXO1-R 5’-CAG AAG GTT CTC CAT GTT TTC TGG A-3’. Total RNA 3 μg과 oligo-dT를 섞어 80℃에서 3분 동안 열 변성 시킨 후, 10 x buffer, dNTP, MML-V, RNase inhibitor 등이 포함된 용액과 혼합하여 42℃에서 90분간 반응 시켜 cDNA를 합성하였다.
PC12세포를 25 mM HEPES, 25 mM sodiumbicarbonate, 10% fetal bovine serum, 50 units/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin이 포함된 RPMI 1640배지에 접종하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 본 실험에 사용된 천연물 라이브러리는 한약진흥재단(NIKOM)에서 제공받았으며, 총 640개의 물질을 DMSO를 용매로 하여 1 mg/ml의 농도로 제공되었으며, 각 세포에 적용된 최종 농도는 10 μg/ml/day로 처리되었다.
Total RNA 3 μg과 oligo-dT를 섞어 80℃에서 3분 동안 열 변성 시킨 후, 10 x buffer, dNTP, MML-V, RNase inhibitor 등이 포함된 용액과 혼합하여 42℃에서 90분간 반응 시켜 cDNA를 합성하였다. cDNA를 증폭시키기 위해서 해당 primer를 이용하여 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 30초로 28회 반응하여 전기영동으로 확인하였다. 전기영동 결과 생성된 PCR 밴드측정의 강약측정은 모두 3회 반복 실시한 평균값이다.
면역강화에 관여하는 ERAP1와 수명연장에 관여하는 FOXO1 유전자 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 각각의 유전자발현이 1.
특히 Caenorhabditis ele- gans 돌연변이 실험에서 FOXO1는 life-span extension을 조절하는 핵심유전자로 밝혀짐으로 인하여 mammalian longevity 와 cancer/diabetes와 같은 age-related diseases측면에서 크게 주목을 받고 있다[4, 8, 9]. 본 연구에서 ERAP1 & FOXO1 유전자 발현을 각각의 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) RT-PCR 실험 후에 전기영동하여 생긴 밴드의 강약 정도를 control 과 비교하여 정량화하였다; ERAP1 & FOXO1 유전자가 동시에 1.5배, 2배 이상 상승한 것을 다음 실험을 위한 1차후보군으로 선정하였다.
대상 데이터
면역강화에 관여하는 ERAP1와 수명연장에 관여하는 FOXO1 유전자 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 각각의 유전자발현이 1.5배와 2 배 이상 상승한 것을 대상으로 정리하였다. ERAP1유전자를 1.
PC12세포를 25 mM HEPES, 25 mM sodiumbicarbonate, 10% fetal bovine serum, 50 units/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin이 포함된 RPMI 1640배지에 접종하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 본 실험에 사용된 천연물 라이브러리는 한약진흥재단(NIKOM)에서 제공받았으며, 총 640개의 물질을 DMSO를 용매로 하여 1 mg/ml의 농도로 제공되었으며, 각 세포에 적용된 최종 농도는 10 μg/ml/day로 처리되었다. Total RNA분리는 Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다.
본 연구에 사용된 천연물은 한약진흥재단에서 분양 받아 사용하였으며, 본 성과물(논문)은 농촌진흥청 연구사업(세부과제번호: PJ01086401)의 지원에 의해 이루어진 것임.
이상의 실험결과 우선적으로 ERAP1와 FOXO1 유전자를 함께 2배 이상 발현시키는 4종류 천연물[(±)-Car-3-ene-2, 5-di- one, Cinobufagin, Corilagin, Corydaline]은 면역을 통한 수명연장 실험에 사용될 것이다. 초파리를 이용한 개체의 수명연장실험 후, 유의적인 천연물은 약제화하기 위한 안정성, 안전성과 유효성을 극대화하고 부작용을 최소화할 수 있는 신약개발의 중요한 원천소재로서 사용되어 무병장수 관련 천연물신약으로 발전할 것이다.
실험에 사용될 것이다. 초파리를 이용한 개체의 수명연장실험 후, 유의적인 천연물은 약제화하기 위한 안정성, 안전성과 유효성을 극대화하고 부작용을 최소화할 수 있는 신약개발의 중요한 원천소재로서 사용되어 무병장수 관련 천연물신약으로 발전할 것이다.
참고문헌 (18)
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