[논문]변형 유비퀴틴 단백질을 이용하여 탐구한 이온이 단백질 구조의 안정성에 미치는 영향

박순호

doi:10.5012/jkcs.2016.60.1.82

문제 정의

이러한 관찰은 낮은 pH에서 변성된 HubWA의 구조가 Cl^-, Br^-, 그리고 SO₄^2-를 가해주었을 때 다시 native 상태의 구조로 되돌아 온다는 것을 의미한다. 따라서 다양한 농도의 이온이 있는 상태에서 단백질 변성 실험을 통하여서 구한 삼차원 입체구조의 안정성을 비교함으로써 이온이 단백질 구조의 안정성에 끼치는 영향을 탐구해볼 수 있을 것으로 사료되었다.
산성용액에서 변성된 HubWA의 경우 chaotropic anion에 의해서도 정전기적 척력이 차벽되어 refolding이 일어날 수 있으리라 예측되나 chaotropic ion의 경우 농도가 증가할수록 정전기적 척력을 차벽하여 refolding을 일으키는 경향과 Hofmeister series 효과에 의하여 단백질을 변성시 키는 경향이 서로 상충되게 작용하므로 단백질 구조 안정화에 미치는 이온의 효과를 설명하기가 어려울 것으로 여겨졌다. 따라서 본 연구는 kosmotropic 이온이 단백질의 삼차원 입체구조의 안정성에 끼치는 효과에 집중하였다.
6 이러한 관찰은 양전하의 척력이 단백질의 삼차구조의 안정성에 지대한 영향을 주는 상황에서 이온의 역할을 알아보는데 요긴한 모델 단백질이 될 수 있음을 의미한다. 본 연구는 여러 가지 kosmotropic 이온이 정전기적 상호작용과 Hofneister series 효과에 의하여 단백질 구조 안정성에 끼치는 영향을 탐구하는 것이 주목적으로 정전기적 척력이 거의 작용하지 않아 Hofmeister series 효과만 주로 관찰할 수 있는 중성 용액과 정전기적 척력이 강하게 작용하여 Hofmeister series 효과와 정전기적 상호작용의 효과를 모두 관찰할 수 있는 산성용액에서 각 이온이 HubWA의 구조적 안정성에 미치는 영향을 조사하였다. 이러한 목적에 입각하여 pH 2용액에서 변성된 HubWA가 Cl- 이외의 kosmotropic 이온이 존재할 때도 native state로 구조전환이 일어나는지 먼저 탐색하였다.
본 연구에서는 이온이 단백질 삼차원 입체구조의 안정성에 끼치는 영향을 알아보는 것이 주 목적이므로 단백질 변성 실험에는 전하를 띠지 않는 요소를 사용하였다. HubWA의 변성 실험은 요소의 농도를 증가시킬 때 나타나는HubWA의 구조적인 변화가 형광 신호의 증가를 일으키는 점을 이용하여 측정한 이전에 발표한 방법을 사용하였다.

제안 방법

6는 각기 다른 이온의 농도에서 요소에 의한 변성 실험으로 구한 AG°nu를 그린 것이다. 본 연구에서는 Cl이나 Br- 처럼 1가 이온뿐만 아니라 $。42-와 같은 2가 이온도 사용하였으므로 공정한 비교를 위하여 이온강도(ionic strength, 수식 1)에 따른 AG°_nu를 비교하였다. Fig.
HubWA의 변성 실험은 요소의 농도를 증가시킬 때 나타나는HubWA의 구조적인 변화가 형광 신호의 증가를 일으키는 점을 이용하여 측정한 이전에 발표한 방법을 사용하였다.6 이온의 농도에 따른 안정성은 공정한 비교를 위하여서 수식 1로 구할 수 있는 이온강도(ionic strength, IS)를 사용하였다.
본 연구에서는 이온이 단백질 삼차원 입체구조의 안정성에 끼치는 영향을 알아보는 것이 주 목적이므로 단백질 변성 실험에는 전하를 띠지 않는 요소를 사용하였다. HubWA의 변성 실험은 요소의 농도를 증가시킬 때 나타나는HubWA의 구조적인 변화가 형광 신호의 증가를 일으키는 점을 이용하여 측정한 이전에 발표한 방법을 사용하였다.6 이온의 농도에 따른 안정성은 공정한 비교를 위하여서 수식 1로 구할 수 있는 이온강도(ionic strength, IS)를 사용하였다.
본 연구에서 사용된 모델 단백질인 변형 유비퀴틴인 HubWA는 이전에 발표한 방법으로 정제하였고6 coomassie brilliant blue로 염색한 SDS-PAGE 젤을 통하여 순도가 97%이상 임을 확인하였다. 단백질의 안정성을 얻는 변성 실험에 사용된 초순수 요소(ultrapure urea)는 ICN Biomedical Inc.
본 연구는 여러 가지 kosmotropic 이온이 정전기적 상호작용과 Hofneister series 효과에 의하여 단백질 구조 안정성에 끼치는 영향을 탐구하는 것이 주목적으로 정전기적 척력이 거의 작용하지 않아 Hofmeister series 효과만 주로 관찰할 수 있는 중성 용액과 정전기적 척력이 강하게 작용하여 Hofmeister series 효과와 정전기적 상호작용의 효과를 모두 관찰할 수 있는 산성용액에서 각 이온이 HubWA의 구조적 안정성에 미치는 영향을 조사하였다. 이러한 목적에 입각하여 pH 2용액에서 변성된 HubWA가 Cl- 이외의 kosmotropic 이온이 존재할 때도 native state로 구조전환이 일어나는지 먼저 탐색하였다. Fig.

이론/모형

형광 스펙트럼(fluorescence emission spectrum)은 JASCO FP6500 분광형광계(Tokyo, Japan)을 사용하였고, 편광 스펙트럼 (Circular Dichroic spectrum)은 JASCO J-810 분광편광계(Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 스펙트럼 측정의 세세한 사항은 이전에 발표한 방법을 따랐다.

성능/효과

또한 이온은 Hofmeister series 효과로 불리는 성질을 통하여 단백질의 구조적 안정성에 영향을 끼친다.^2,3 그러나 이온이 정전기적 상호작용과 Hofmeister series 효과를 통하여 단백질 구조 안정성에 기여할 시 두 효과가 누적적으로 작용하는지, 협력적으로 작용하여 각각 따로 작용할 때보다 더 강하게 작용하는지 또는 한 요소가 다른 요소의 영향을 압도하는지에 대한 것은 잘 알려지지 않았다.
4,5 이들 변형 유비퀴틴중 45번째 아미노산인 페닐알라닌을 트립토판으로 치환하여 형광분광기로 구조적 변화를 측정할 수 있으며 여기에 더하여 26번째 아미노산인 발린을 알라닌으로 치환하여 삼차원 입체구조의 안정성이 상당히 감소한 변형유비퀴틴(HubWA로 명명함)은 이온의 농도가 낮은 산성 (pH 2) 용액에서 native state와는 다른 형광스펙트럼을 띠는 변성 상태가 되는 것이 관찰되었다.6 유비퀴틴은 중성 pH 에서 양전하를 띠는 라이신과 아르기닌이 각각 7 개와 4 개, 음전하를 띠는 아스파르트산과 글루탐산이 각각 5 개와 6 개 있어서 전기적으로 중성을 띠지만 산성용액(pH 2)에서는 라이신과 아르기닌만이 전하를 띠게 된다.
HubWA의 요소에 의한 변성은 형광신호의 증가로 나타났으며, 형광신호의 증가는 S-자(sigmoid) 형태로 관찰되었다(Fig. 5). 이러한 관찰은 요소에 의한 HubWA의 구조 변화가 native state와 unfolded state만 존재하는 two-state 폴딩 메커니즘을 따른다는 점을 나타낸다,⁸ 본 연구에서는 요소에 의한 HubWA의 구조 변화를 two-state 폴딩 메커 니즘을 기반으로 한 linear extrapolation method(LEM)로 분석하였다(수식 2).
35)과 pH 2에서 각 이온에 의한 안정성의 증가가 서로 일치하는 점은 HubWA의 양전하 주위에 음이온의 분포가 늘어나 정전기적 척력을 차벽하는 효과가 매우 커서 Hofmeister series 효과를 압도하여 정전기적 상호작용만 두드러지게 관찰된 것이라는 해석을 지지하며, 이온에 의한 정전기적 상호작용과 Hofmeister series 효과가 서로 누적적이거나 협력적으로 작용하지는 않는다는 점을 나타낸다고 할 수 있다. HubWA의 이온에 의한 안정성을 측정한 이 연구의 결과는 이온에 의한 단백질 구조의 안정성은 이온의 종류뿐만 아니라 단백질의 전하를 띤 상태에도 크게 영향을 받는다는 점을 시사한다.
98로 분석되었다. Na₂SO₄의 경우 이온강도가 증가함에 따라 KCl이나 KBr의 경우에서와 같이 AG°_nu가 직선의 형태로 증가하는 양상을 보이며, 기울기는 KCl이나 KBr이 존재할 때보다 더 큰 값을 가지는 것으로 나타났다(기울기 =2.40, R² = 0.99).
이온이 단백질의 용해도, 단백질의 구조적인 안정성에 끼치는 영향은 오랫동안 관심의 대상이 되어왔다. 그러나 본 연구는 이온이 정전기적 상호작용과 Hofmeiser series 효과에 의하여 단백질의 구조적인 안정성에 영향을 끼치지만 정전기적 상호작용과 Hofmeister series 효과가 서로 누적적이거나 협력적이지 않으며, 이온이 단백질의 구조적 안정성에 끼치는 영향은 이온 자체의 성질뿐만 아니라 단백질의 전하를 띠는 상태에도 크게 영향을 받는다는 것을 시사한다. 단백질의 구조적 안정성을 향상시키기 위하여 이온을 사용할 때에는 이온에 의한 안정화 효과와 더불어 보존하려는 단백질의 성질도 고려하여야 할 것으로 여겨진다.
이온에 의한 HubWA의 구조적 안정성의 증가는 중성용액에서는 Hofmeister series 효과만 주로 나타나지만, 산성용액에서는 정전기적 상호작용과 Hofmeister series 효과가 모두 나타난다고 할 수 있다. 따라서 산성용액에서 Cl-에 의하여 refolding된 HubWA는 단백질 구조 안정성에 미치는 정전기적 상호작용과 Hofmeister series 효과가 단순히 누적적(additive)인지 혹은 두 효과의 영향이 협력적(cooperative)으로 일어나 두 효과를 단순히 합한 것보다 더 크게 나타나는 지 등을 알아볼 수 있는 좋은 모델 단백질이 될 것으로 여겨졌다. 산성용액에서 변성된 HubWA의 경우 chaotropic anion에 의해서도 정전기적 척력이 차벽되어 refolding이 일어날 수 있으리라 예측되나 chaotropic ion의 경우 농도가 증가할수록 정전기적 척력을 차벽하여 refolding을 일으키는 경향과 Hofmeister series 효과에 의하여 단백질을 변성시 키는 경향이 서로 상충되게 작용하므로 단백질 구조 안정화에 미치는 이온의 효과를 설명하기가 어려울 것으로 여겨졌다.
만약 이온과 단백질의 특이적인 결합이 관여한다면 이온강도에 따른 단백질의 구조적인 안정성이 직선으로 나타나는 것이 아니라 쌍곡선(hyperbolic curve)으로 나타나야 하는데 실험을 실시한 이온의 농도 구간에서는 쌍곡선이라기 보다는 직선에 휠씬 가깝게 나타났다. 또한 X-ray crystallography 방법으로 구한 WT 유비퀴틴의 입체 구조에서도 이온이 특정부위에 결합한다는 증거는 보이지 않았다.12 용액의 pH가 5인 조건에서 HubWA는 11 개의 양전하와 11 개의 음전하를 띠어 전기적으로 중성이므로 이 상태에서 단백질 구조적 안정성에 끼치는 이온의 역할은 정전기적 상호작용보다는 Hoffneister series 효과가 주된 효과일 것으로 여겨진다.
이온강도에 따른 단백질의 구조적인 안정성이 직선으로 나타난 점은 이들 이온에 의하여 단백질의 구조적 안정성이 증가하는 것이 이온이 HubWA의 특정부위에 특이적으로 결합(specific binding)하기 때문에 일어나는 것은 아니라는 것을 의미한다. 만약 이온과 단백질의 특이적인 결합이 관여한다면 이온강도에 따른 단백질의 구조적인 안정성이 직선으로 나타나는 것이 아니라 쌍곡선(hyperbolic curve)으로 나타나야 하는데 실험을 실시한 이온의 농도 구간에서는 쌍곡선이라기 보다는 직선에 휠씬 가깝게 나타났다. 또한 X-ray crystallography 방법으로 구한 WT 유비퀴틴의 입체 구조에서도 이온이 특정부위에 결합한다는 증거는 보이지 않았다.
용액의 pH가 2일 때도 pH 5 일 때와 마찬가지로 이온강도가 증가 함에 따라 HubWA의 구조적 안정성의 증가가 직선으로 관찰되었으며, 흥미롭게도 세가지 이온에서 측정한 결과가서로 겹쳐지는 것이 관찰되었다. 세가지 이온에서의 결과를 하나의 직선으로 가정하였을 때 기울기는 3.35, R2는 0.99로 분석되었다. 용액의 pH가 2일 때 얻은 이온강도에 따른 HubWA의 구조적 안정성도 중성 pH에서 측정한 것과 마찬가지로 직선으로 나타난 점은 HubWA의 구조적 안정성이 HubWA의 특정 부위에 이온이 특이적으로 결합하여 나타난 것이라기 보다 이온에 의한 정전기적 척력의 차벽과 Hofmeister series 효과에 의한 것이라는 점을 시사한다.
4는 pH 2 용액에 여러 가지 다른 이온이 존재하는 상황에서 측정한 HubWA의 far-UV Circular Dichroic(CD) 스펙트럼을 보여준다. 용액의 pH가 2이고이온의 농도가 낮은 상태에서 관찰된 HubWA의 far-UV CD 스펙트럼(Fig. 4 점선)은 native 상태의 스펙트럼(Fig. 4실선)과는 현저하게 다르게 나타났는데 이 용액에 0.4 M KCl(Fig. 4 짧은 대시)이나 0.2 M NazSO4 (Fig. 4 긴 대시)를 가하면 native 상태의 스펙트럼과 일치하는 스펙트럼을 보였다. 또한 0.
6에서 열린 기호(open symbols)는 용액의 pH가 2일 때 이온강도에 따른 &G°nu의 변화를 보여준다. 용액의 pH가 2일 때도 pH 5 일 때와 마찬가지로 이온강도가 증가 함에 따라 HubWA의 구조적 안정성의 증가가 직선으로 관찰되었으며, 흥미롭게도 세가지 이온에서 측정한 결과가서로 겹쳐지는 것이 관찰되었다. 세가지 이온에서의 결과를 하나의 직선으로 가정하였을 때 기울기는 3.
6에서 보여진 결과가 나왔을 것으로 여겨진다. 이온강도에 따른 HubWA의 안정성이 증가하는 정도가 pH 5 일 때보다 pH 2일 때 더 큰 점(기울기 1.22와 2.40 대 3.35)과 pH 2에서 각 이온에 의한 안정성의 증가가 서로 일치하는 점은 HubWA의 양전하 주위에 음이온의 분포가 늘어나 정전기적 척력을 차벽하는 효과가 매우 커서 Hofmeister series 효과를 압도하여 정전기적 상호작용만 두드러지게 관찰된 것이라는 해석을 지지하며, 이온에 의한 정전기적 상호작용과 Hofmeister series 효과가 서로 누적적이거나 협력적으로 작용하지는 않는다는 점을 나타낸다고 할 수 있다. HubWA의 이온에 의한 안정성을 측정한 이 연구의 결과는 이온에 의한 단백질 구조의 안정성은 이온의 종류뿐만 아니라 단백질의 전하를 띤 상태에도 크게 영향을 받는다는 점을 시사한다.

후속연구

중성 pH와는 달리 산성 pH에서는 HubWA가 양전하만 띠므로 정전기적 상호작용과 Hofmeister series 효과가 모두 HubWA의 안정성에 기여하게 될 것으로 여겨진다. 따라서 pH 2 용액에서 HubWA의 구조적 안정성을 측정하면 정전기적 상호작용과 Hofmeister series 효과가 서로 누적적인지, 두 작용이 구조적 안정성을 더욱 더 강하게 하는 시너지 효과를 보이는 지 등을 알아볼 수 있을 것으로 여겨졌다. Fig.

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