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문제 정의
- 본 연구는 국내의 많은 지역에서 발생되고 있는 조이시아 그래스에서의 총생화 현상이 노균병의 원인균인 S.macrospora와 연관성이 있는지의 확인을 위하여 S. macrospora 유전자에 특이적인 마커와 PCR로 S. macrospora의 감염 여부를 신속 정확하게 확인할 수 있는 진단법을 개발하고자 수행하였다.
가설 설정
- A: Mulitiple alignment of the Sm H-AY and known isolates (EU826119, HQ641397, HQ641398, HQ641399, HQ641400, HQ641401, HQ641402) on internal transcribed spacer (ITS) region. B: Taxonomic position of Sm H-AY isolate based on ITS region of ribosomal DNA.
제안 방법
- 난지형 잔디인 세인트오거스틴그래스에서의 S. macrospora 에 의한 노균병이 보고되어 있으며(Jone and Amador, 1969; Bruton et al., 1978), 한국잔디에서 발병중인 총생 잔디의 이병부에서 유주자 증식을 통한 S. macrospora를 관찰하였다(Dernoeden and Jackson, 1980). 이병 잔디의 잎 시료를 광학현미경으로 관찰한 결과, 주로 늦봄과 늦가을에 채집된 총생 잔디들에서 Pythium과 유사한 형태의 50~80 µm 크기의 난포자들이 3개 이상씩 뭉쳐있는 것이 관찰되었다 (Fig.
- macrospora로 확인중인 난포자보다 작은 특성을 보인다(Kim and Park, 1997). 노균병에 감염된 이병부에서 확인한 활물 기생 특성의 S. macrospora 관찰 결과들을 바탕으로, 분자생물학적 유전자 분석법으로 S. macrospora를 확인하기 위해 NCBI 유전자 은행에 등록된 S. macrospora DNA 염기서열 정보를 바탕으로 PCR 프라이머를 제작하였다.
- 병원균의 포자를 관찰하기 위하여 경기도의 한국잔디의 보식지에서 수집된 총생 잔디 20여개체로부터 작은 반점이 형성된 황화 잎을 채집한 후 광학현미경(Olympus SZPT, Japan)을 이용하여 100배로 관찰하였다(Kim et al. 2014). 유주자낭의 관찰을 위하여 난포자가 관찰된 황화 잎들을 2~3 cm 길이로 자른 후, 잎 시료의 표면 소독을 위하여 70％ 알코올에서 30초간 흔든 후 살균수로 3회 이상 세척 하였다.
- 유전자증폭기는 MJ mini thermal cycler (Bio-Rad)를 사용하였으며 PCR 조건으로 95°C에서 5분간 denaturation을 시킨 다음 95°C에서 denaturation 10초, 58°C에서 annealing 15초, 72°C에서 extension 20초로 35 cycle을 반응시키고 마지막으로 72°C에서 extension을 5분간 수행하였다.
- 2014). 유주자낭의 관찰을 위하여 난포자가 관찰된 황화 잎들을 2~3 cm 길이로 자른 후, 잎 시료의 표면 소독을 위하여 70％ 알코올에서 30초간 흔든 후 살균수로 3회 이상 세척 하였다. 시약병에 표면 소독된 시료를 넣고 충분히 잠길 정도의 살균수를 첨가한 후 빛이 없는 18~20°C 항온기에서 24시간 증식하였다(Dernoeden and Jackson, 1980).
- 유주자낭이 관찰된 과분얼 잔디와 건전한 잔디를 액체질소에 각각 냉각시켜 곱게 마쇄한 동량의 시료와, 당사 보유중인 7종류의 곰팡이 균사들로부터 Genomic DNA Prep Kit (SolGent, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 유전자증폭기는 MJ mini thermal cycler (Bio-Rad)를 사용하였으며 PCR 조건으로 95°C에서 5분간 denaturation을 시킨 다음 95°C에서 denaturation 10초, 58°C에서 annealing 15초, 72°C에서 extension 20초로 35 cycle을 반응시키고 마지막으로 72°C에서 extension을 5분간 수행하였다.
- , 2003). 이러한 옥수수나 벼에서의 S. macrospora에 감염된 병리학적 결과들이 노균병징을 보이는 잔디에서도 매우 유사하게 관찰되었기에 잔디에서도 S. macrospora에 감염으로 인해 나타난 증상으로 추측하였다.
- 이병잔디의 이병부에서 분리하여 동정한 후 보유중인 7 가지 종의 곰팡이성 병원균(Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Curvularia trifolii, Sclerotinia homoeocarpa, Rhizoctonia solani AG1-1A, Pythium arrhenomanes, Rhizoctonia cerealis)과 총생화 잔디의 DNA를 추출한 후, 제작된 프라이머로 PCR을 수행하여 S. macrospora의 특이적인 검출 가능성을 확인하였다. 총 8가지 종의 시료에서 추출한 DNA에 대하여 한 쌍의 프라이머 ITS5 / ITS4 로 PCR 후 DNA 상태를 확인하였다(Fig.
- 전국의 잔디식재지 중 전라남도 지역의 잔디 재배지와 경기도, 강원도 및 경상남도의 골프장들의 총생 잔디들에서 DNA 추출 후 각각의 DNA에 대한 S. macrospora 프라이머를 이용한 병원균 DNA 증폭 실험을 하였다. 건강한 잔디에서는 S.
- 전국적으로 재배중인 한국잔디에서 확대되고 있는 총생잔디에서 현미경을 이용하여 피시움균의 난포자와 유사하지만 다소 큰 사이즈인 50~80 µm의 난포자를 관찰하였다.
- 증식이 끝난 시약병을 약 30초간 vortex 위에서 진동시킨 다음, 원심 분리기를 이용하여 700 Xg에서 1분간 원심분리한 후 하층액 20 µl를 취하여 confocal(Zeiss LSM 510 META, Germany)로 관찰하였다(Han et al., 2013).
- , 1990). 증폭된 밴드가 포함된 아가로스 겔을 Gel elution kit(RBC Bioscience, Korea)를 이용하여 PCR 산물을 회수 후 Genotech Corp. (Korea)에 염기서열 분석을 의뢰 후 확인하였으며, Kim et al. (2014)에서 제시된 방법으로 염기서열간의 유사성을 비교하였다.
- macrospora의 특이적인 검출 가능성을 확인하였다. 총 8가지 종의 시료에서 추출한 DNA에 대하여 한 쌍의 프라이머 ITS5 / ITS4 로 PCR 후 DNA 상태를 확인하였다(Fig. 3A 아래). 7가지 종의 곰팡이성 병원균들에서는 PCR 증폭 밴드가 나타나지 않았으나, S.
대상 데이터
- 2015년 5월과 10월에 경기도 군포의 한국잔디가 이식된 현장에서 직경 5 cm 이내의 뭉쳐진 과분얼성 황화잔디가 광범위하게 확산되고 있는 것이 관찰되었다. 초기 증상은 주변의 개체들 보다 생장이 저해되어 잎이 넓어지고 두꺼워 보이는 현상을 보이다가, 증상이 진전되면서 발육 부진한 연녹색의 잔디 개체들이 천근 현상과 함께 황화된 총생 형태의 모양으로 뭉쳐나는 현상을 보였다(Fig.
- 2015년 전국 각 지역별 골프장, 잔디재배지, 공원 중에서 전라남도 지역의 잔디 재배지와 경기도, 강원도 및 경상남도의 골프장에서 과분얼된 총생 증상이 밀집된 지역에서 대표 시료를 20여점씩 각각 수집하여 분석에 사용하였다.
- S. macrospora에 보존적인 380 bp 지역의 염기서열에서 199 bp 크기를 증폭할 수 있는 한 쌍의 프라이머 S. macrospora_F (5’-gat agc ata caa gta ccg tga g-3’)와 S. macrospora_R (5’-aca aac atg cat tat ata cac a-3’)를 제작하였다.
- 미국 국립생물정보센터 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 유전자 은행(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록된 S. macrospora (GenBank accession No. EU826119)의 염기서열을 분석에 사용하였다. S.
성능/효과
- 3A 아래). 7가지 종의 곰팡이성 병원균들에서는 PCR 증폭 밴드가 나타나지 않았으나, S. macrospora의 유주자낭이 관찰된 감염 시료에서만 특이적으로 증폭된 밴드가 보였다(Fig. 3A 위).
- macrospora 프라이머를 이용한 병원균 DNA 증폭 실험을 하였다. 건강한 잔디에서는 S. macrospora DNA가 미검출 되었으며, 4곳에서 수집된 총생 잔디 시료 모두에서 S. macrospora DNA가 검출되어 병 감염이 전국적으로 확산되고 있음을 확인하였다(Fig. 5). 또한 총생이 진행중인 zoysiagrass에서 새로 뻗어나가는 지상 포복경을 세 부분 A, B, C로 나눈 후 각 부분별로 PCR 증폭 DNA 밴드를 정량화 한 결과, 총생이 진행 중인 A와 B에서 증폭량이 가장 많으며 총생 증상이 관찰되지 않으면서 새로운 개체가 발달 중인 C부분은 A부분에 비해 79% 수준만 증폭됨이 3반복 확인되었다(Fig.
- 동일 시료들을 암상태의 저온 다습한 조건에서 24시간 증식한 후 현미경으로 관찰한 결과 80~100 µm 크기의 Sclerophthora macrospora 유주자낭이 확인되었다.
- 4). 따라서 제작된 프라이머는 PCR을 통해 S. macrospora를 특이적으로 검출이 가능한 것으로 확인되었다.
- 또한 S. macrospora 유주자낭이 관찰된 시료의 DNA를 희석시킨 후 S. macrospora 특이적인 프라이머를 사용한 PCR 실험에서도, 희석 배수와 비례하여 S. macrospora 의 유전자가 증폭되었다(Fig. 3B). 증폭된 lane 1-5 밴드에서 확인된 염기서열을 Sm H-AY로 임의로 명명하였으며 잘 알려져 있는 S.
- 5). 또한 총생이 진행중인 zoysiagrass에서 새로 뻗어나가는 지상 포복경을 세 부분 A, B, C로 나눈 후 각 부분별로 PCR 증폭 DNA 밴드를 정량화 한 결과, 총생이 진행 중인 A와 B에서 증폭량이 가장 많으며 총생 증상이 관찰되지 않으면서 새로운 개체가 발달 중인 C부분은 A부분에 비해 79% 수준만 증폭됨이 3반복 확인되었다(Fig. 6). 이러한 실험 결과로 잔디의 라이좀 생장에 따라 S.
- 또한, 동일 시료들을 암 상태의 저온 다습한 조건에서 24시간 증식한 후 현미경으로 관찰한 결과, 80~100 µm 크기의 S. macrospora 유주자낭이 관찰되었다(Fig. 2B).
- 동일 시료들을 암상태의 저온 다습한 조건에서 24시간 증식한 후 현미경으로 관찰한 결과 80~100 µm 크기의 Sclerophthora macrospora 유주자낭이 확인되었다. 유전자 분석을 통한 확인을 위해 유전자 은행에 등록된 S. macrospora 염기서열 정보를 바탕으로 제작된 프라이머와 감염된 조직에서 추출한 DNA로 PCR 후, S. macrospora 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과로 S.
- macrospora 특이적인 밴드가 증폭되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과로 S. macrospora가 한국잔디 총생 증상에 관여하는 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 6). 이러한 실험 결과로 잔디의 라이좀 생장에 따라 S. macrospora 의 감염도 동반 진행되어 새로운 개체가 총생으로 될 가능성을 확인하였다. 추후에는 건전한 잔디에 S.
- 1B). 전라남도 한국잔디 재배지의 지상 포복경에서 옥수수(Zea mays L.) crazy top 형태의 과분얼 된 잔디가 확인되었으며 (Fig. 1C), 강원도와 경상남도 골프장의 한국잔디에서도 라이좀이 짧아진 절간부에서 황화된 개체가 보이거나 짧아진 절간부에서 비정상적으로 과분얼된 개체가 확인되는 등 다양한 형태의 잔디가 관찰되었다(Fig. 1D and 1E).
- 3B). 증폭된 lane 1-5 밴드에서 확인된 염기서열을 Sm H-AY로 임의로 명명하였으며 잘 알려져 있는 S. macrospora의 염기서열들과 비교한 결과 99% 이상 일치하였다(Fig. 4). 따라서 제작된 프라이머는 PCR을 통해 S.
- 2015년 5월과 10월에 경기도 군포의 한국잔디가 이식된 현장에서 직경 5 cm 이내의 뭉쳐진 과분얼성 황화잔디가 광범위하게 확산되고 있는 것이 관찰되었다. 초기 증상은 주변의 개체들 보다 생장이 저해되어 잎이 넓어지고 두꺼워 보이는 현상을 보이다가, 증상이 진전되면서 발육 부진한 연녹색의 잔디 개체들이 천근 현상과 함께 황화된 총생 형태의 모양으로 뭉쳐나는 현상을 보였다(Fig. 1A and 1B) 주변의 건전한 잔디와 달리 비정상적으로 밀도가 높은 과분얼된 형태의 잔디들은 뿌리 생육이 매우 부진하여 쉽게 뽑히며, 가뭄에 의한 건조 스트레스와 이상 고온에 의해 쉽게 시들고 갈색으로 변하면서 고사하는 것이 관찰되었다. 이러한 현상은 그린-업 되는 시기부터 늦은 봄까지 그리고 가을철에 최고조에 달했으며, 5 cm 내외의 총생화 잔디의 형태가 노균병과 매우 유사한 것으로 확인되었다(Fig.
후속연구
- macrospora 의 감염도 동반 진행되어 새로운 개체가 총생으로 될 가능성을 확인하였다. 추후에는 건전한 잔디에 S. macrospora 접종 후 시간 경과별로 노균병 병징의 관찰을 통한 총생의 직접 원인균 여부 확인뿐만 아니라, real time-PCR을 통한 DNA 증폭량의 수치화 및 정량적인 분석 연구에 활용 가능할 것이다.
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