자외선과 유사하게 열에 의한 콜라겐 분해와 비정상적인 탄력섬유의 축적을 증가시키는 현상을 열노화라 칭한다. 두날리엘라 살리나는 녹조류로 베타카로틴을 많이 함유하고 있어 건강식품으로 많이 이용되고 있으나 열에 의해 유도된 피부노화에서의 효능은 알려진 바 없다. 본 연구에서는 두날리엘라 살리나 에탄올 추출물의 항-열노화 효능을 확인하였다. 열을 가한 피부섬유아세포를 이용하여 MMP-1과 type I procollagen 발현을 ELISA를 이용해 확인하였다. 두날리엘라 살리나 추출물이 열에 의해 증가된 MMP-1 단백질 발현량을 감소시키며, type I procollagen 단백질 발현량은 증가시킨다는 사실을 확인하였다. 추가적으로, 두날리엘라 살리나 추출물에 의해 콜라겐 합성 과정에 관여하는 것으로 알려진 HSP47 mRNA의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한, 두날리엘라 살리나 추출물이 염증매개인자(TGF-${\beta}$, IL-12 등)의 발현을 감소시킴을 확인하였다. 다음으로 두날리엘라 살리나 추출물이 탄력섬유의 구성성분인 tropoelastin과 fibrillin-1 단백질 발현과 MMP-12 발현 조절을 통해 열에 의해 유도된 일광탄력섬유증을 조절하는 효능을 확인하였다. 이 결과를 통해 두날리엘라 살리나 추출물이 열에 의해 유도된 피부열노화를 효과적으로 예방함을 확인하였다.
자외선과 유사하게 열에 의한 콜라겐 분해와 비정상적인 탄력섬유의 축적을 증가시키는 현상을 열노화라 칭한다. 두날리엘라 살리나는 녹조류로 베타카로틴을 많이 함유하고 있어 건강식품으로 많이 이용되고 있으나 열에 의해 유도된 피부노화에서의 효능은 알려진 바 없다. 본 연구에서는 두날리엘라 살리나 에탄올 추출물의 항-열노화 효능을 확인하였다. 열을 가한 피부섬유아세포를 이용하여 MMP-1과 type I procollagen 발현을 ELISA를 이용해 확인하였다. 두날리엘라 살리나 추출물이 열에 의해 증가된 MMP-1 단백질 발현량을 감소시키며, type I procollagen 단백질 발현량은 증가시킨다는 사실을 확인하였다. 추가적으로, 두날리엘라 살리나 추출물에 의해 콜라겐 합성 과정에 관여하는 것으로 알려진 HSP47 mRNA의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한, 두날리엘라 살리나 추출물이 염증매개인자(TGF-${\beta}$, IL-12 등)의 발현을 감소시킴을 확인하였다. 다음으로 두날리엘라 살리나 추출물이 탄력섬유의 구성성분인 tropoelastin과 fibrillin-1 단백질 발현과 MMP-12 발현 조절을 통해 열에 의해 유도된 일광탄력섬유증을 조절하는 효능을 확인하였다. 이 결과를 통해 두날리엘라 살리나 추출물이 열에 의해 유도된 피부열노화를 효과적으로 예방함을 확인하였다.
Just like UV radiation, heat increases collagen degradation and accumulation of abnormal elastin fiber and this is termed thermal skin aging. Dunaliella salina (DS), a green alga, is known for its beta-carotene accumulation, having various applications in the health and nutritional products. However...
Just like UV radiation, heat increases collagen degradation and accumulation of abnormal elastin fiber and this is termed thermal skin aging. Dunaliella salina (DS), a green alga, is known for its beta-carotene accumulation, having various applications in the health and nutritional products. However, the effects of DS on heat-induced skin aging remain unexplored. In this study, we performed anti-thermal aging tests of the ethanol extract of DS (DSE). We measured the cellular levels of type I procollagen and MMP-1 using ELISA in human dermal fibroblast cells after heat shock. DSE reduced the expression of MMP-1 protein and increased the expression of type I procollagen. In addition, DSE upregulated the mRNA expression of HSP47 reduced by heat shock, which is involved in collagen synthesis. Also, DSE reduced the expression of inflammation mediator (TGF-${\beta}$, IL-12, etc). We demonstrate that DSE regulates the heat-induced solar elastosis through the regulation of tropoelastin and fibrillin-1, two major proteins of elastic fibers, and MMP-12 expression. These results suggest that DSE may be effective for preventing thermally induced skin aging.
Just like UV radiation, heat increases collagen degradation and accumulation of abnormal elastin fiber and this is termed thermal skin aging. Dunaliella salina (DS), a green alga, is known for its beta-carotene accumulation, having various applications in the health and nutritional products. However, the effects of DS on heat-induced skin aging remain unexplored. In this study, we performed anti-thermal aging tests of the ethanol extract of DS (DSE). We measured the cellular levels of type I procollagen and MMP-1 using ELISA in human dermal fibroblast cells after heat shock. DSE reduced the expression of MMP-1 protein and increased the expression of type I procollagen. In addition, DSE upregulated the mRNA expression of HSP47 reduced by heat shock, which is involved in collagen synthesis. Also, DSE reduced the expression of inflammation mediator (TGF-${\beta}$, IL-12, etc). We demonstrate that DSE regulates the heat-induced solar elastosis through the regulation of tropoelastin and fibrillin-1, two major proteins of elastic fibers, and MMP-12 expression. These results suggest that DSE may be effective for preventing thermally induced skin aging.
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문제 정의
두날리엘라 살리나의 주요 성분으로 알려진 베타카로틴은 염료로 사용될 뿐만 아니라 항산화 및 항암 효능이 있는 것으로 알려져 있어 식품 및 화장품, 의약품에 적용하여 사용하고 있다[19-21]. 그러나 열에 의한 피부 노화에 대한 연구는 없어 본 연구자들은 두날리엘라 살리나 추출물을 이용하여 열에 의한 피부노화 억제 효능을 확인하고자 했다.
본 연구는 미세 조류인 두날리엘라 살리나의 피부 열노화 억제 효능을 알아봄으로써 피부노화 화장품원료로서의 가능성을 알아보았다. 열을 가한 섬유아세포를 이용하여 두날리엘라 살리나 추출물의 항주름 효능을 확인해 본 결과, 열에 의해 증가한 MMP-1 발현 감소 및 HSP47 발현 조절을 통한 콜라겐 합성 과정에 관여하는 것으로 판단된다.
제안 방법
배양이 끝난 배지의 상층액을 이용하여 효소면역분석법을 MMP-1 ELISA kit (Abnova, Taiwan), type I prcollagen EIA kit (Takara, Japan), IL-6 ELISA kit (R&D system, USA), IL-12 ELISA kit (R&D system, USA)를 이용하여 시행한 후, 450 nm에서 측정하였다. MMP-1과 type I procollagen발현 확인은 HDF를 이용하였으며, IL-6, IL-12 발현은 HaCaT을 이용하여 확인하였다.
75% 에탄올을 이용하여 7,500 rpm에서 5 min 간 원심분리하여 세척하고 공기 중에서 건조시킨 후, nuclease-free water를 이용하여 녹였다. UV-spectrophotometer (Biochrom, USA)를 이용하여 RNA를 정량하였고 First Strand cDNA synthesis kit (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA는 EmeraldAmp GT PCR Master Mix (Takara, Japan)와 프라이머를 이용하여 타겟유전자를 증폭시켰다.
각 PCR 산물은 1.5 ∼ 2% 아가로즈겔에 로딩하여 100 V 조건에서 20 min 동안 전기 영동을 통하여 분석하였다.
다음으로 type I procollagen의 합성 효과를 알아보기 위하여 열을 가한 섬유아세포에 두날리엘라 살리나 추출물을 처리하여 type I procollagen에 대한 발현량을 측정하였다. 그 결과 열을 주었을 때 type I procollagen의 발현 감소를 확인하였고, 양성대조군인 epidemal growth factor (EGF)에 의해 그 발현이 증가한 것을 확인하였다.
다음으로 열에 의해 활성화되는 염증매개인자인 COX-2의 단백질 발현 변화에 두날리엘라 살리나 추출물이 미치는 영향을 western blot을 통해 확인하였다. 그 결과 열에 의해 증가된 COX-2의 단백질 발현이 두날리엘라 살리나 추출물에 의해 감소한 것을 확인할 수 있었다(Figure 3D).
두날리엘라 살리나 추출물의 세포독성을 측정하기 위해서 MTT assay를 통해 확인하였다. 그 결과, 200 μg/mL 농도에서 약간의 세포 독성이 확인되었으며, 이보다 낮은 농도에서는 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(Figure 1).
또한 두날리엘라 살리나 추출물이 TGF-β유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다.
배양이 끝난 배지의 상층액을 이용하여 효소면역분석법을 MMP-1 ELISA kit (Abnova, Taiwan), type I prcollagen EIA kit (Takara, Japan), IL-6 ELISA kit (R&D system, USA), IL-12 ELISA kit (R&D system, USA)를 이용하여 시행한 후, 450 nm에서 측정하였다.
그 후 열을 가해준 다음 FBS가 첨가되지 않은 배지에 시료를 희석한 후 24 h 동안 추가 배양하였다. 배양한 세포를 회수하여 radioimmuno-precipitation assay buffer (RIPA buffer; Thermo Scientific, USA)를 이용하여 단백질을 추출하고 bicinchoninic acid (BCA) assay에 따라 정량한 후, sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 하여 분리하였다. 전기영동 후 단백질을 gel에서 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막으로 transfer 한 뒤, COX-2 (Santacruz, USA), goat anti-rabbit IgG-HRP (Santacruz, USA) 항체를 결합하여 타겟 단백질을 표지하고 필름 감광하였다.
열에 의한 MMP의 발현에 영향을 주는 것으로 알려져 있는 IL-6, IL-12, TGF-β, COX-2에 대해[7] 두날리엘라 살리나의 조절효과를 평가하기 위해 열을 가한 각질형성세포에 두날리엘라 살리나 추출물을 처리하여 IL-6, IL-12, TGF-β, COX-2에 대한 발현량을 측정하였다.
열에 의해 활성화되는 MMP의 발현에 두날리엘라 살리나 추출물이 주는 영향을 보기 위해, 열을 가한 섬유아세포에 두날리엘라 살리나 추출물을 처리하여 MMP-1에 대한 발현량을 측정하였다. 그 결과 열을 주었을 때 MMP-1의 발현 증가를 확인하였고, 양성대조군인 epigallocatechin gallate (EGCG)에 의해 그 발현이 감소한 것을 확인하였다.
이에 Figure 2C에서는 두날리엘라 살리나 추출물이 HSP47 발현에 미치는 영향을 알아보았다. 열을 가한 섬유아세포에 두날리엘라 살리나 추출물을 처리하여 HSP47 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 열에 의해 HSP47의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 두날리엘라 살리나 추출물에 의해 감소된 HSP47 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
자외선에 의해 피부의 elastin 성분은 증가하고, fibrillin 성분이 줄어들면서 비정상적인 elastin material이 진피 상층에 형성되면서 피부가 노랗게 보이는 현상이 나타난다. 이런 일광탄력섬유증이 열에 의해서도 나타난다고 보고된 바 있으며 [11], 두날리엘라 살리나 추출물이 일광탄력섬유증에 관여하는 인자들 중 tropoelastin, fibrillin-1, MMP-12 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해서 RT-PCR을 수행하였다. 열에 의해 증가된 tropoelastin 발현이 두날리엘라 살리나 추출물에 의해 감소된 것을 확인할 수 있었다.
UV-spectrophotometer (Biochrom, USA)를 이용하여 RNA를 정량하였고 First Strand cDNA synthesis kit (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA는 EmeraldAmp GT PCR Master Mix (Takara, Japan)와 프라이머를 이용하여 타겟유전자를 증폭시켰다. 반응 조건은 95 ℃ 5 min 반응 후, 94 ℃ 30 s, 62 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s를 30회 반복하여 증폭시켰다.
대상 데이터
세포는 피부각질형성세포(human epidermal keratinocytes)주인 HaCaT과 피부섬유아세포(human dermal fibroblasts, HDF)를 이용하였다. HaCaT은 Cell Line Service (CLS, Germany)에서 구입하였으며, HDF는 세포바이오(Cell Engineering for Origin (CEFO), Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 구입한 세포를 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone Lab.
HaCaT은 Cell Line Service (CLS, Germany)에서 구입하였으며, HDF는 세포바이오(Cell Engineering for Origin (CEFO), Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 구입한 세포를 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone Lab., USA), 1% penicillin/streptomycin (Hyclone Lab., USA)을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 실험에 이용하였다.
87 g의 시료를 수득하였으며, 이 분말을 －20 ℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다. 동결건조분말은 실험 시 dimetyl sulfoxide (DMSO, Sigma, USA)에 용해시킨 후 사용하였다.
본 실험에 사용된 두날리엘라 살리나는 한국미세조류은행에서 분양 받아 사용하였다. 두날리엘라 살리나 30 g에 70% 에탄올 600 mL을 처리한 후, 상온 조건에서 3 h 동안 추출하였다.
세포는 피부각질형성세포(human epidermal keratinocytes)주인 HaCaT과 피부섬유아세포(human dermal fibroblasts, HDF)를 이용하였다. HaCaT은 Cell Line Service (CLS, Germany)에서 구입하였으며, HDF는 세포바이오(Cell Engineering for Origin (CEFO), Korea)로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
모든 통계 분석은 t-test를 시행하여 p-value를 구하였으며, p < 0.05인 경우 *, p < 0.01인 경우 **로 유의성이 있다고 표시하였다.
성능/효과
열에 의해 활성화되는 MMP의 발현에 두날리엘라 살리나 추출물이 주는 영향을 보기 위해, 열을 가한 섬유아세포에 두날리엘라 살리나 추출물을 처리하여 MMP-1에 대한 발현량을 측정하였다. 그 결과 열을 주었을 때 MMP-1의 발현 증가를 확인하였고, 양성대조군인 epigallocatechin gallate (EGCG)에 의해 그 발현이 감소한 것을 확인하였다. 두날리엘라 살리나 추출물의 경우 50 ∼ 100 μg/mL 농도에서 열에 의한 MMP-1 증가를 억제 시킴을 확인하였다(Figure 2A).
다음으로 type I procollagen의 합성 효과를 알아보기 위하여 열을 가한 섬유아세포에 두날리엘라 살리나 추출물을 처리하여 type I procollagen에 대한 발현량을 측정하였다. 그 결과 열을 주었을 때 type I procollagen의 발현 감소를 확인하였고, 양성대조군인 epidemal growth factor (EGF)에 의해 그 발현이 증가한 것을 확인하였다. 두날리엘라 살리나 추출물의 경우 50 ∼ 100 μg/mL 농도에서 열에 의한 type I procollagen 감소를 EGF와 비슷한 수준으로 증가시킴을 확인하였다(Figure 2B).
그 결과, 200 μg/mL 농도에서 약간의 세포 독성이 확인되었으며, 이보다 낮은 농도에서는 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(Figure 1).
그 결과, 두날리엘라 살리나 추출물이 열에 의해 증가된 TGF-β 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(Figure 3C).
열을 가한 섬유아세포에 두날리엘라 살리나 추출물을 처리하여 HSP47 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 열에 의해 HSP47의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 두날리엘라 살리나 추출물에 의해 감소된 HSP47 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한 열에 의해 증가한 염증성 사이토카인(IL-6, IL-12, TGF-β)과 염증매개인자(COX-2) 발현 억제 효능을 확인하였다.
열에 의한 MMP의 발현에 영향을 주는 것으로 알려져 있는 IL-6, IL-12, TGF-β, COX-2에 대해[7] 두날리엘라 살리나의 조절효과를 평가하기 위해 열을 가한 각질형성세포에 두날리엘라 살리나 추출물을 처리하여 IL-6, IL-12, TGF-β, COX-2에 대한 발현량을 측정하였다. 먼저, ELISA을 통해 IL-6, IL-12 발현량을 확인해본 결과, 열에 의해 IL-6, IL-12 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 양성대조군으로 사용한 dexamethasone (Dex)에서 열에 의해 증가된 IL-6, IL-12 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 두날리엘라 살리나 추출물의 경우, 열에 의해 증가된 IL-6, IL-12 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(Figure 3A, B).
본 연구는 미세 조류인 두날리엘라 살리나의 피부 열노화 억제 효능을 알아봄으로써 피부노화 화장품원료로서의 가능성을 알아보았다. 열을 가한 섬유아세포를 이용하여 두날리엘라 살리나 추출물의 항주름 효능을 확인해 본 결과, 열에 의해 증가한 MMP-1 발현 감소 및 HSP47 발현 조절을 통한 콜라겐 합성 과정에 관여하는 것으로 판단된다. 또한 열에 의해 증가한 염증성 사이토카인(IL-6, IL-12, TGF-β)과 염증매개인자(COX-2) 발현 억제 효능을 확인하였다.
또한 열에 의해 증가한 염증성 사이토카인(IL-6, IL-12, TGF-β)과 염증매개인자(COX-2) 발현 억제 효능을 확인하였다. 추가적으로 일광탄력섬유증에 관여하는 인자들(tropoelastin, fibrillin-1, MMP-12)의 발현 조절을 통해 일광탄력섬유증 억제 효능을 확인할 수 있었다. 따라서 두날리엘라 살리나 추출물은 항주름 효능 및 항염, 일광탄력섬유증 억제 효능을 나타내는 물질이 함유된 것으로 생각되며, 효능 성분에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
후속연구
추가적으로 일광탄력섬유증에 관여하는 인자들(tropoelastin, fibrillin-1, MMP-12)의 발현 조절을 통해 일광탄력섬유증 억제 효능을 확인할 수 있었다. 따라서 두날리엘라 살리나 추출물은 항주름 효능 및 항염, 일광탄력섬유증 억제 효능을 나타내는 물질이 함유된 것으로 생각되며, 효능 성분에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 최종적으로 본 연구 결과를 통해 볼 때, 두날리엘라 살리나 추출물은 열에 의해 나타나는 피부노화를 타겟으로한 항노화 화장품 원료로서도 활용가능성이 있다고 사료된다.
따라서 두날리엘라 살리나 추출물은 항주름 효능 및 항염, 일광탄력섬유증 억제 효능을 나타내는 물질이 함유된 것으로 생각되며, 효능 성분에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 최종적으로 본 연구 결과를 통해 볼 때, 두날리엘라 살리나 추출물은 열에 의해 나타나는 피부노화를 타겟으로한 항노화 화장품 원료로서도 활용가능성이 있다고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
단세포 녹조류인 두날리엘라 살리나와 일반 식물의 세포 간에는 어떤 중요한 차이가 있는가?
두날리엘라 살리나(Dunaliella salina)는 광합성을 하는 녹조류에 속하는 진핵생물로서, 세포 부피 50 ∼ 100 mm3에 이르는 단세포 녹조류이다. 이들의 세포는 탄성이 있는 얇은 점막질로 둘러싸여 있고 일반 식물과 같은 단단한 다당류 세포벽을 갖고 있지는 않다. 두날리엘라 살리나는 베타카로틴을 다량 함유하고 있다고 알려져 있으며, 강한 빛의 조사와 같이 배양 환경이 악화되면, 광합성에 중요한 엽록소인 클로로필 A(chlorophyll A)를 보호하기 위해 베타카로틴을 합성하여 세포벽 아래에 베타카로틴 막을 형성한다고 알려져 있다.
두날리엘라 살리나는 무엇인가?
두날리엘라 살리나(Dunaliella salina)는 광합성을 하는 녹조류에 속하는 진핵생물로서, 세포 부피 50 ∼ 100 mm3에 이르는 단세포 녹조류이다. 이들의 세포는 탄성이 있는 얇은 점막질로 둘러싸여 있고 일반 식물과 같은 단단한 다당류 세포벽을 갖고 있지는 않다.
피부 온도 상승은 피부에 어떤 영향을 주는가?
정상 체온인 사람은 30 min 간 강렬한 햇볕에 노출 시 최대 섭씨 43 ℃까지 피부 온도가 상승한다[6]. 피부 온도가 올라가면 피부의 주요 구성 물질인 콜라겐을 분해하는 효소가 활성화되어 피부 손상과 노화를 촉진하고 이는 곧 주름으로 이어진다 [7-10,12,13]. 보고된 논문에 의하면 열에 의해서 mitogen-activated protein kinases (MAPK), extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 MAPK의 활성 및 interluekin-6 (IL-6), interluekin-12 (IL-12), transforming growth factor-β (TGF-β) 발현 증가를 통해 matrix metalloproteinase (MMP)-1과 MMP-3의 발현이 증가한다고 보고된 바 있다[7].
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