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문제 정의
- 단일클론항체의 경쇄 및 중쇄 mRNA와 결합하도록 제작된 MB (MB-CL, MB-CH)의 결합 특이도를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 경쇄 및 중쇄 mRNA와 같은 서열을 갖는 합성 target DNA (mimic)와 각각의 MB를 용액 중에서 혼합한 후 형광 신호를 측정하였다.
- 세포 내 MB의 효율적인 운반을 위해서는 SLO를 이용한 방법을 사용하였으며, 경쇄와 중쇄를 각각 검출하는 방식과 더불어 둘을 한 세포 내에서 동시에 검출이 가능함을 규명하였다. 본 기술의경우, 항체 발현 세포에서 경쇄와 중쇄 mRNA의 양과 비율에 따라 해당 세포주의 배양 중 항체 발현량과 품질이 미리 결정될 수 있다는 점에 착안하여, MB를 이용한 mRNA의 살아 있는 세포에서의 검출 기술을 적용한 것이다. 이 기술의 경우, 인간 항체의 불변 영역에 해당되는 mRNA 부분을 검출하는 방식이므로 현재 상용화되었거나 개발 중인 모든 항체 치료제에 적용될 수 있다는 장점이 있다.
- 이를 위해서는 살아 있는 세포 내부에서 경쇄와 중쇄의 mRNA를 동시에 검출하는 기술개발이 필요하다. 본 연구에서는 oligonucleotide probe인 molecular beacon (MB)을 이용하여 인간 단일클론항체의 경쇄와 중쇄 mRNA를 살아 있는 세포에서 검출하는 기술을 개발하였다. MB는 stem과 loop 구조로 이루어져 있는 단일 가닥의 oligonucleotide로, 5’ 말단에 fluorescence dye가, 3’ 말단에 quencher가 존재한다.
- 본 연구에서는 단일클론항체를 발현하는 살아 있는 세포에서 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 영역 mRNA를 MB로 검출하는 기술을 소개하였다. 먼저 경쇄와 중쇄의 불변 영역에 있는 mRNA 일부와 결합할 수 있는 MB를 제작하여 용액과 살아 있는 세포 내에서 결합 특이도를 확인하였다.
- 이를 위해서는 치료용 항체를 생산하는 우수한 세포주 제작이 필요하며, 관련된 세포주 제작 기술들이 개발 중에 있다. 본 연구에서는 현재 사용되고 있는 세포 외로 배출되는 항체 단백질을 검출하는 방식이 아닌 세포 내에 발현된 항체의 경쇄와 중쇄 mRNA들을 검출하는 방식의 새로운 기술을 선보였다. 이는 살아 있는 세포 내에서 각 mRNA들에 대해 특이적인 MB를 이용하는 방식으로 실험을 통해 세포 내 발현된 경쇄와 중쇄 mRNA를 검출이 가능함을 규명하였다.
제안 방법
- 이를 위해 항체의 경쇄와 중쇄 mRNA를 발현하는 항체 생산 세포군에 이들 mRNA와 결합할 수 있는 MB를 각각 운반하여 발생하는 형광 신호를 관찰하였다. MB를 살아 있는 세포 내로 효율적으로 운반하기 위해 MB와 함께 SLO를 배지에 첨가하여 사용하였다. 배지에 들어가는 SLO는 동물세포 표면에 존재 하는 콜레스테롤에 달라붙어 이들을 바깥쪽으로 밀어내 30 nm 이내의 구멍을 만들어 주는 역할을 한다.
- 경쇄 결합 MB의 경우에는 excitation과 emission 파장을 각각 550 nm와 570 nm에서, 중쇄 결합 MB의 경우에는 각각 650 nm와 670 nm의 파장을 사용하였다. Mimic의 농도가 0 nM일 때의 형광값을 background 로 하여 S/B ratio를 계산하였다.
- 먼저 RNA 시료 준비를 위해 단일클론항체 생산 벡터가 transfection된 HeLa 세포를 48시간 동안 배양한 후 ISOL reagent (5PRIME)를 이용하여 제작사의 매뉴얼에 따라 RNA 를 추출 및 분리하였다. NanoDrop Lite Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 RNA의 양 및 순도를 측정하였다. Total RNA는 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBO, Japan)를 사용하여 cDNA로 역전사하여 합성한 후, Real-time PCR을 진행하였다.
- SLO를 활성화시킨 뒤, 세포를 탈착시킨 후, 배양배지를 첨가한 뒤 세포 수를 4×105 cells로 맞추어 PBS 버퍼로 washing 후 MB mRNA 검출 실험을 진행하였다.
- Total RNA는 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBO, Japan)를 사용하여 cDNA로 역전사하여 합성한 후, Real-time PCR을 진행하였다.
- )에서 제공하는 anti-sense 제작 프로그램을 활용하였다. 각 MB의 결합 특이도를 확인하기 위해 용액 중에서 경쇄와 중쇄 mRNA에 대한 각각의 mimic을 제작하여 결합 정도를 확인하였다. 각 mimic은 인간 단일항체 경쇄와 중쇄 불변 부위의 일부분으로 서열은 각각 5'-GGAGAGTGT CACAGAGCAGC-3', 5'-GTGGAGTGGGAGAGCAATGG-3' (Cosmogenetech, Inc.
- 결합 실험에 사용된 mimic의 농도는 0, 10, 100, 500 nM였으며, 사용된 MB 농도는 100 nM이다. 경쇄와 중쇄 mimic을 각각 또는 동시에 nuclease free PBS 용액 안에 넣고 MB와 37℃에서 30분간반응시킨후, 형광분석기 (VarioskanTM Flash Multimode Reader, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 결합 정도를 측정하였다. 경쇄 결합 MB의 경우에는 excitation과 emission 파장을 각각 550 nm와 570 nm에서, 중쇄 결합 MB의 경우에는 각각 650 nm와 670 nm의 파장을 사용하였다.
- 세포를 씻은 후 새로운 배지로 바꿔준 뒤 37℃에서 1시간 동안 추가 배양하여 형광 분석기를 통해 형광 값을 측정하였다. 단일클론항체 벡터를 transfection 하지 않은 대조군과 단일클론항체 벡터를 transfection한 비교군 간 결합 정도를 비교하였다. 단일클론항체를 생산하는 세포의 경우 (w/ TF), 생산하지 않는 대조군 세포 (w/o TF)에 비해 MB-CL 과 세포 내 경쇄 mRNA와의 결합 S/B 비율이 1.
- 단일클론항체 벡터를 transfection한 세포에서 발현된 경쇄와 중쇄 mRNA의 정량적 분석을 위해 Real-time PCR을 진행하였다. 먼저 RNA 시료 준비를 위해 단일클론항체 생산 벡터가 transfection된 HeLa 세포를 48시간 동안 배양한 후 ISOL reagent (5PRIME)를 이용하여 제작사의 매뉴얼에 따라 RNA 를 추출 및 분리하였다. NanoDrop Lite Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 RNA의 양 및 순도를 측정하였다.
- 본 연구에서는 단일클론항체를 발현하는 살아 있는 세포에서 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 영역 mRNA를 MB로 검출하는 기술을 소개하였다. 먼저 경쇄와 중쇄의 불변 영역에 있는 mRNA 일부와 결합할 수 있는 MB를 제작하여 용액과 살아 있는 세포 내에서 결합 특이도를 확인하였다. 세포 내 MB의 효율적인 운반을 위해서는 SLO를 이용한 방법을 사용하였으며, 경쇄와 중쇄를 각각 검출하는 방식과 더불어 둘을 한 세포 내에서 동시에 검출이 가능함을 규명하였다.
- 보다 정량적인 실험 결과를 얻기 위해 유세포 분석기를 활용 하여 살아 있는 세포에서 발현된 단일클론항체의 경쇄 및 중쇄 mRNA들을 각각에 대한 MB로 검출할 수 있는지 여부를 확인하였다 (Fig. 4C, D). 먼저 항체 발현 벡터를 transfection 하고 2일간 배양한 후, 항체 경쇄 mRNA를 검출할 수 있는 MB를 세포 내로 운반한 후 분석한 결과, 세포 내 경쇄 mRNA 와 MB-CL간의 결합에 의한 높은 형광 신호를 보이는 세포들이 많이 관찰되었다 (Fig.
- 보다 효율적인 방법 개발을 위해 발현된 항체 경쇄와 중쇄 mRNA들을 살아 있는 세포 내부에서 동시에 검출하기 위한 실험을 수행하였다 (Fig. 5). 항체 발현 벡터로 세포를 transfection시키고 2일 간 배양한 후, 항체 경쇄와 중쇄 mRNA들과 결합하는 MB-CL과 MB-CH를 동시에 세포 내로 운반 하였다.
- 살아 있는 세포 내에서 발현된 단일클론항체 경쇄와 중쇄 mRNA를 각각 MB-CL와 MB-CH MB로 검출하기 위한 실험을 수행 하기에 앞서, 이들의 양을 real-time PCR로 측정하였다.
- 세포 내 단일클론항체 생산을 위해 HeLa 세포를 6 well plate에 6×105개/well로 seeding 하고 24시간 경과 후 단일클론항체 생산 벡터를 jetprime® (Polyplus-transfection Inc., USA)을 이용하여 transfection 하였다.
- 세포가 항체 mRNA를 생산할 수 있도록 단일클론항체 생산 벡터를 transfection 하고 48시간 동안 배양한 후, 세포를 탈착하고 여기에 SLO와 MB가 혼합된 배지를 첨가한 후 37℃에서 15분간 배양하였다. 세포를 씻은 후 새로운 배지로 바꿔준 뒤 37℃에서 1시간 동안 추가 배양하여 형광 분석기를 통해 형광 값을 측정하였다. 단일클론항체 벡터를 transfection 하지 않은 대조군과 단일클론항체 벡터를 transfection한 비교군 간 결합 정도를 비교하였다.
- 용액 및 세포 내에서 MB와 항체 경쇄 및 중쇄 mRNA와의 결합 정도를 측정하기 위해 형광 측정기 (fluorometer, VarioskanTM Flash Multimode Reader, Thermo Scientific, USA)와 유세포 분석기 (flow cytometer, GalliosTM, Beckman coulter, USA) 를 이용하였다. 세포에서의 항체 경쇄 및 중쇄 mRNA 생산을 위해, HeLa 세포를 단일클론항체 생산 벡터를 transfection 한후 48시간 동안 배양하였다.
- )의 결합 특이도를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 경쇄 및 중쇄 mRNA와 같은 서열을 갖는 합성 target DNA (mimic)와 각각의 MB를 용액 중에서 혼합한 후 형광 신호를 측정하였다. 경쇄와 중쇄 mimic 농도를 0, 10, 100, 500 nM로 변화시킨 후 각각에 대해 100 nM의 MB-CL또는 MB-CH와 결합시켰을 경우, 모두 mimic 의 농도 증가에 비례하여 MB의 S/B 값이 증가하였다 (Fig.
- 항체를 생산하는 세포 안에서 만들어진 항체 mRNA를 검출하고 이를 기준으로 우수한 세포주를 분리하기 위해서는 세포가 살아 있는 상태에서 분석이 가능해야 한다. 이를 위해 항체의 경쇄와 중쇄 mRNA를 발현하는 항체 생산 세포군에 이들 mRNA와 결합할 수 있는 MB를 각각 운반하여 발생하는 형광 신호를 관찰하였다. MB를 살아 있는 세포 내로 효율적으로 운반하기 위해 MB와 함께 SLO를 배지에 첨가하여 사용하였다.
- 2A, B). 이어 경쇄 및 중쇄 mimic이 용액 중 동시에 존재할때, MB-CL과 MB-CH를 동시에 혼합한 후, 용액 중에서 각각의 결합 특이도 측정해 보았다. Fig.
- 먼저, 단일클론항체 생산용 벡터를 세포에 transfection한후, 48시간 동안 배양하였다. 이어 세포로부터 전체 RNA를 추출 및 분리한 후 cDNA를 합성을 하였다. 동량의 RNA양을 기준으로 경쇄와 중쇄를 검출할 수 있는 primer를 이용하여 real-time PCR을 수행한 결과, 경쇄 mRNA의 경우 CT (Threshold cycle)값이 18.
- MB 운반 배지를 세포에 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후, 3차례 washing을 통해 운반되지 않은 MB를 제거한 후 새로운 배양배지를 첨가하여 37℃에서1시간 동안 추가 배양하였다. 이와 같이 준비된 시료를 형광 측정기와 유세포 분석기를 통해 결합 신호를 측정하였다.
- 5). 항체 발현 벡터로 세포를 transfection시키고 2일 간 배양한 후, 항체 경쇄와 중쇄 mRNA들과 결합하는 MB-CL과 MB-CH를 동시에 세포 내로 운반 하였다. 유세포 분석기를 통해 각 세포 내 경쇄와 중쇄 mRNA와 결합한 각각의 MB의 형광 신호를 관찰한 결과, 단일 mRNA 검출 결과와 마찬가지로 경쇄 (Fig.
대상 데이터
- Housekeeping 유전자로 인간 Actin mRNA를 사용하였으며 사용된 forward primer는 5'-ATGAAGTGTGACGTTGACATCCG-3', reverse primer는 5'-GCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3' (Cosmogenetech, Inc.) 이다.
- SLO를 활성화시킨 뒤, 세포를 탈착시킨 후, 배양배지를 첨가한 뒤 세포 수를 4×105 cells로 맞추어 PBS 버퍼로 washing 후 MB mRNA 검출 실험을 진행하였다. MB 의 세포 내 운반을 위해 400 nM의 MB와 활성화된 SLO, 그리고 DMEM 배지 (w/o antibiotics, FBS)가 혼합된 MB 운반 배지를 제작하였다. MB 운반 배지를 세포에 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후, 3차례 washing을 통해 운반되지 않은 MB를 제거한 후 새로운 배양배지를 첨가하여 37℃에서1시간 동안 추가 배양하였다.
- 각 mimic은 인간 단일항체 경쇄와 중쇄 불변 부위의 일부분으로 서열은 각각 5'-GGAGAGTGT CACAGAGCAGC-3', 5'-GTGGAGTGGGAGAGCAATGG-3' (Cosmogenetech, Inc.)으로 제작하였다.
- 경쇄와 중쇄 mimic을 각각 또는 동시에 nuclease free PBS 용액 안에 넣고 MB와 37℃에서 30분간반응시킨후, 형광분석기 (VarioskanTM Flash Multimode Reader, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 결합 정도를 측정하였다. 경쇄 결합 MB의 경우에는 excitation과 emission 파장을 각각 550 nm와 570 nm에서, 중쇄 결합 MB의 경우에는 각각 650 nm와 670 nm의 파장을 사용하였다. Mimic의 농도가 0 nM일 때의 형광값을 background 로 하여 S/B ratio를 계산하였다.
- 세포에서의 항체 경쇄 및 중쇄 mRNA 생산을 위해, HeLa 세포를 단일클론항체 생산 벡터를 transfection 한후 48시간 동안 배양하였다. 세포 내 MB 운반을 위해 streptolysin O (SLO, Sigma, USA)를 사용하였다. SLO를 활성화 시키기 위해 0.
- 실험에 사용된 HeLa 세포는 Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM, Biowest, France)를 사용하여 배양하였으며, 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS, Biowest)과 1% (v/v) penicillin을 첨가하여 37℃에서 5% CO2를 공급한 상태로 배양하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 단일클론항체 경쇄 및 중쇄 불변 영역에 상보 적으로 결합하는 MB (각 MB-CL, MB-CH) 서열은 각각 5'- Cy3-GCGGTCCCTGCTCTGTGACACTCTCCGACCGCBHQ2-3', 5'-Cy5-CCGCAGCCATTGCTCTCCCACTCCACC TGCGG-BHQ2-3' (Bio Basic Canada Inc.) 이다.
이론/모형
- 밑줄 친 부분은 MB 구조 중 stem을 나타내며 나머지 부분은 각각 경쇄와 중쇄 mRNA와 결합할 수 있도록 설계된 loop 부분이다. 경쇄와 중쇄 mRNA와 MB와의 결합 부위는 IDT (Integrated DNA Technologies, Inc.)에서 제공하는 anti-sense 제작 프로그램을 활용하였다. 각 MB의 결합 특이도를 확인하기 위해 용액 중에서 경쇄와 중쇄 mRNA에 대한 각각의 mimic을 제작하여 결합 정도를 확인하였다.
- 단일클론항체 벡터를 transfection한 세포에서 발현된 경쇄와 중쇄 mRNA의 정량적 분석을 위해 Real-time PCR을 진행하였다. 먼저 RNA 시료 준비를 위해 단일클론항체 생산 벡터가 transfection된 HeLa 세포를 48시간 동안 배양한 후 ISOL reagent (5PRIME)를 이용하여 제작사의 매뉴얼에 따라 RNA 를 추출 및 분리하였다.
성능/효과
- 이어 경쇄 및 중쇄 mimic이 용액 중 동시에 존재할때, MB-CL과 MB-CH를 동시에 혼합한 후, 용액 중에서 각각의 결합 특이도 측정해 보았다. Fig. 2C에서 보는 것과 같이, 경쇄와 중쇄 mimic이 동시에 있을 경우에도 MB는 각 target 에 대해 높은 S/B 값을 가졌으며, mimic의 농도가 높아질수록 여전히 S/B 값이 증가함을 확인할 수 있었다. 이와 반해, 경쇄와 중쇄 mimic 대신 MB와 상보성이 전혀 없는 random target DNA (R DNA)와의 결합 실험에서는 R DNA의 농도가 500 nM까지 증가되었음에도 불구하고 S/B 값의 변화가 없었다.
- 단일클론항체를 생산하는 세포의 경우 (w/ TF), 생산하지 않는 대조군 세포 (w/o TF)에 비해 MB-CL 과 세포 내 경쇄 mRNA와의 결합 S/B 비율이 1.6배 높은 것을 확인하였다 (Fig. 4A).
- 동량의 RNA양을 기준으로 경쇄와 중쇄를 검출할 수 있는 primer를 이용하여 real-time PCR을 수행한 결과, 경쇄 mRNA의 경우 CT (Threshold cycle)값이 18.9, 중쇄 mRNA의 경우 CT 값이 30.2가 나왔다 (Fig. 3).
- 1) [10-21]. 따라서 MB의 loop 부분을 인간 단일클론항체의 경쇄와 중쇄의 불변 영역 (CL, CH)과 상보적으로 결합하도록 제작하여 각각의 MB를 단일클론항체 생산 세포주에 운반하여 target mRNA들을 검출할 수 있다. 본 기술을 통해 상업용 항체 치료제 생산 공정에서 중요 공정 중 하나인 세포주 구축 단계에서 항체 생산성은 물론 생산된 항체의 품질을 동시에 보장할 수 있는 우수 세포주 확보 할 수 있을 것으로 기대된다.
- 4C, D). 먼저 항체 발현 벡터를 transfection 하고 2일간 배양한 후, 항체 경쇄 mRNA를 검출할 수 있는 MB를 세포 내로 운반한 후 분석한 결과, 세포 내 경쇄 mRNA 와 MB-CL간의 결합에 의한 높은 형광 신호를 보이는 세포들이 많이 관찰되었다 (Fig. 4C). 항체 중쇄 mRNA의 경우에도 마찬가지로, 중쇄 mRNA 결합 MB-CH에 의해 항체를 발현하지 않는 세포군에 비해 증가된 결합 형광 신호가 관찰되었다 (Fig.
- 5B) mRNA 결합 S/B 비율이 항체 발현 세포군에서 모두 증가됨을 확인할 수 있었다 (Fig 5C, D). 본 실험을 통해 살아 있는 세포에서 발현되는 항체의 경쇄와 중쇄 mRNA들을 각 mRNA에 대해 특이적으로 제작된 MB에 의해 각각 검출될수 있음을 확인할 수 있었다. 또한 이는 각 세포에서 발현되는 항체 경쇄와 중쇄 mRNA 양을 기준으로 하여 원하는 세포를 살아 있는 상태에서 선별할 수 있음을 의미한다.
- 먼저 경쇄와 중쇄의 불변 영역에 있는 mRNA 일부와 결합할 수 있는 MB를 제작하여 용액과 살아 있는 세포 내에서 결합 특이도를 확인하였다. 세포 내 MB의 효율적인 운반을 위해서는 SLO를 이용한 방법을 사용하였으며, 경쇄와 중쇄를 각각 검출하는 방식과 더불어 둘을 한 세포 내에서 동시에 검출이 가능함을 규명하였다. 본 기술의경우, 항체 발현 세포에서 경쇄와 중쇄 mRNA의 양과 비율에 따라 해당 세포주의 배양 중 항체 발현량과 품질이 미리 결정될 수 있다는 점에 착안하여, MB를 이용한 mRNA의 살아 있는 세포에서의 검출 기술을 적용한 것이다.
- 항체 발현 벡터로 세포를 transfection시키고 2일 간 배양한 후, 항체 경쇄와 중쇄 mRNA들과 결합하는 MB-CL과 MB-CH를 동시에 세포 내로 운반 하였다. 유세포 분석기를 통해 각 세포 내 경쇄와 중쇄 mRNA와 결합한 각각의 MB의 형광 신호를 관찰한 결과, 단일 mRNA 검출 결과와 마찬가지로 경쇄 (Fig. 5A)와 중쇄 (Fig. 5B) mRNA 결합 S/B 비율이 항체 발현 세포군에서 모두 증가됨을 확인할 수 있었다 (Fig 5C, D). 본 실험을 통해 살아 있는 세포에서 발현되는 항체의 경쇄와 중쇄 mRNA들을 각 mRNA에 대해 특이적으로 제작된 MB에 의해 각각 검출될수 있음을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 현재 사용되고 있는 세포 외로 배출되는 항체 단백질을 검출하는 방식이 아닌 세포 내에 발현된 항체의 경쇄와 중쇄 mRNA들을 검출하는 방식의 새로운 기술을 선보였다. 이는 살아 있는 세포 내에서 각 mRNA들에 대해 특이적인 MB를 이용하는 방식으로 실험을 통해 세포 내 발현된 경쇄와 중쇄 mRNA를 검출이 가능함을 규명하였다. 본 연구에서 제시한 방법을 발전시키면 현재 항체 생산 세포주 제작 방법에 있어 항체의 품질과 생산성을 동시에 확보할 수 있을 것으로 기대하며, 이는 궁극적으로는 항체 기반 바이오의약품 개발에 있어 큰 공헌할 수 있는 공정 기술이 될 것으로 기대된다.
- 4B). 이를 통해 살아 있는 세포에서 발현된 치료용 단일클론항체의 경쇄와 중쇄 mRNA들을 MB를 이용하여 검출할 수 있음을 확인하였다.
- 3). 이를 통해 세포 내에서 경쇄와 중쇄 mRNA 가 발현이 되었음을 확인할 수 있었으며, 경쇄 mRNA양이 중쇄 mRNA 발현량에 비해 높은 것을 확인하였다.
- )에서 발표한 논문에 따르면 몇 가지 선별 방법을 통해 항체의 발현량과 전사체 사이의 관계에 대해 연구를 진행해 왔으며, 중쇄 mRNA의 양이 항체 단백질의 생산성과 연관되어 있음을 확인하였다 [2]. 이와 더불어 경쇄와 중쇄 mRNA의 비율이 1.5이하인 경우, 발현된 항체 단백질의 응집 (aggregation) 비율이 높아져 생산성이 떨어지게 됨을 확인하였다. 즉, 경쇄 (Light Chain)와 중쇄의 mRNA 양적 비율이 생산되는 단일클론항체의 양은 물론 품질 (Quality)을 결정하는 중요한 변수가 된다 [3-9].
- 4A). 항체 중쇄 mRNA의 경우에도 마찬가지로, 단일클론항체 생산 벡터가 transfection된 세포군 (w/ TF)에서 중쇄 mRNA 검출 MB-CH의 결합 S/B 비율이 1.7배 증가한 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 4B). 이를 통해 살아 있는 세포에서 발현된 치료용 단일클론항체의 경쇄와 중쇄 mRNA들을 MB를 이용하여 검출할 수 있음을 확인하였다.
후속연구
- 따라서 MB의 loop 부분을 인간 단일클론항체의 경쇄와 중쇄의 불변 영역 (CL, CH)과 상보적으로 결합하도록 제작하여 각각의 MB를 단일클론항체 생산 세포주에 운반하여 target mRNA들을 검출할 수 있다. 본 기술을 통해 상업용 항체 치료제 생산 공정에서 중요 공정 중 하나인 세포주 구축 단계에서 항체 생산성은 물론 생산된 항체의 품질을 동시에 보장할 수 있는 우수 세포주 확보 할 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 기술이 향후 실제 항체 생산 세포주 선별 공정에 사용되기 위해서는 추가적인 실험이 필요하다. 예를 들면, 본 연구에서는 항체를 일시적으로 발현하는 시스템을 사용하였지만, 세포주 제작을 위해 DHFR (Dihydrofolate reductase)이 결함된 세포 시스템의 경우 methotrexate (MTX)를 사용하여 항체 발현 유전자 증폭 및 세포 선별 과정 중에 MB를 적용하여 경쇄와 중쇄 mRNA의 양을 측정해야 한다.
- 이는 살아 있는 세포 내에서 각 mRNA들에 대해 특이적인 MB를 이용하는 방식으로 실험을 통해 세포 내 발현된 경쇄와 중쇄 mRNA를 검출이 가능함을 규명하였다. 본 연구에서 제시한 방법을 발전시키면 현재 항체 생산 세포주 제작 방법에 있어 항체의 품질과 생산성을 동시에 확보할 수 있을 것으로 기대하며, 이는 궁극적으로는 항체 기반 바이오의약품 개발에 있어 큰 공헌할 수 있는 공정 기술이 될 것으로 기대된다.
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