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문제 정의
- 따라서 핵이식 효율의 증가를 위한 Oct4를 transfection한 중배엽줄기세포를 공여세포로 이용한 핵이식 연구 결과가 보고되고는 있지만(Lee 등, 2014), Oct4를 발현하는 세포의 배반포 내 분포 및 세포 자멸사에 관한 연구는 여전히 미흡하다. 따라서 본 연구에서는 Oct4를 transfection한 세포를 핵이식 공여세포로 사용하였을 때 나타나는 수정란에서의 영향을 확인하기 위하여, Red Fluorescent Protein(RFP)을 마커로 이용한 Oct4-RFP를 transfection한 미니돼지 골수 유래 중간엽줄기세포를 이용하여 핵이식을 수행하고, 핵이식 배반포에서 transfection된 Oct4-RFP의 발현위치 및 총 세포 수와 세포 자멸사의 변화를 확인하였다.
- 하지만, 다른 연구에서는 Oct4 단백질뿐만 아니라, Oct4의 mRNA가 11일이 되어서도 elongating 돼지 수정란의 extra-embryonic tissue에서 발현이 확인되었다고 보고하였다(Keefer 등, 2007). 본 연구에서는 Oct4-RFP를 transfection한 돼지 골수유래 중간엽줄기세포를 공여세포로 핵이식하였을 때, 핵이식 수정란에서의 Oct4의 발현위치를 확인하였다. 그 결과, Oct4를 transfection 한 핵이식 수정란의 ICM과 trophectoderm 모두에서 RFP 발현을 확인할 수 있었다.
제안 방법
- 100개의 난구-난자 복합체를 500 μl의 같은 배지에서 22시간 동안 38.5℃, 5% CO2 환경의 배양기에서 성숙시킨 다음 FSH와 LH가 첨가되지 않은 같은 조성의 TCM 199 배지에서 19시간 더 성숙시켰다.
- 3∼6 mm 직경의 난포에서 10 ml 주사기에 부착된 18-gauge needle을 사용하여 난구-난자 복합체(cumulus-oocyte complexes)를 흡입하였다.
- 30개의 핵이식 수정란을 paraffin oil 아래에 만들어진 30 μl의 3 mg/ml BSA, 20 μg/ml eagle amino acid(EAA), 10 μg/ml nonessential amino acids(NEAA)가 포함된 체외 배양 배지인 porcine zygote medium 5(PZM5)에 넣어 38.5℃, 5% O2, 5% CO2와 90% N2 환경에서 배양한 후, 10% FBS가 포함된 체외 배양 배지를 5일 후에 교환하였다(Ock 등, 2007).
- 5계대의 1×105개의 골수유래 중간엽줄기세포에 20MOI hOct3/4-RFP(OR) (Fig. 1a. ABP-SC-LVIOCT3R, Allelebiotech, San Diego, USA)와 4 μg/ml polybrene을 10% FBS가 포함된 2 ml의 ADMEM에 넣어준 다음, 온도 38.5℃에 5% CO2 환경의 배양기에서 배양하였다.
- Ham’s F10에 모은 다음, 일정한 세포질과 3겹 이상의 난구 세포를 가진 난구-난자 복합체를 선택하고, FBS(5% w/v), 10 ng/ml(w/v) epidermal growth factor(EGF), 0.57 mM cysteine, 0.5 μg/ml(w/v), 2.5 mM sodium pyruvate, 1 mM L-glutamine, 1% penicillin-streptomycin(10,000 IU and 10,000μg/ml), 0.5 μg/ml(w/v) follicular stimulating hormone(FSH)와 0.5 μg/ml(w/v) luteinizing hormone(LH)가 포함된 TCM 199배지에 두 번 세척하였다.
- Oct4-RFP가 transfection된 골수유래 중간엽줄기세포에서 Oct4 발현은 형광현미경(Leica CTR600, Switzerland)의 red filter(excitation wave length 450∼490 nm, dichronic wave length 510 nm와 wave length의 high band pass 515∼560 nm)를 통해 RFP 발현을 확인하였다.
- Oct4-RFP가 transfection된 중간엽줄기세포에서 RFP 발현을 확인한 세포만을 공여세포로 Oct4-RFP 핵이식란을 생산하였으며, 배반포에서 RFP 발현이 확인된 25개의 Oct4-RFP 핵이식 배반포에서 RFP발현 패턴을 관찰하였다. Fig.
- 50 μg/ml RNase A를 첨가하여 1시간 더 배양하고, 대조 염색으로 10 μg/ml 4',6-diamidino-2-phenylindole에서 1시간 동안 염색하였다. Vecta SheildTM로 고정시킨 후, 형광현미경을 통해 관찰하였다. 핵은 형광현미경 상에서 UV filter를 통한 파란색으로 관찰되며, 세포 자멸사는 green filter(excitation wave length 512∼560 nm, dichronic wave length 580 nm와 wave length의 high band pass 590 nm)를 통하여 녹색으로 관찰된다.
- 각각의 핵이식 수정란은 0.5 mM HEPES, 0.1 mM MgSO4, 0.05mM CaCl2와 0.01% BSA를 포함한 0.28 M mannitol 용액에서 BTX Electro Square porator(ECM 830, BTX, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 2.0 KV/cm direct current for 30 μsec로 두 번 전기 자극시켜 융합시켰다.
- 그러나 형광단백질 마커인 RFP의 관찰에 의하여 배반포 내 Oct4의 발현 패턴과 세포 자멸사 발현의 위치 등에 대한 확인은 이뤄지지 못했다. 따라서 본 연구에서는 Oct4-RFP를 transfection한 중간엽줄기세포를 이용하여 핵이식 하였을 경우 수정란에서의 Oct4 발현 위치, 총 세포 수와 배반포 내의 세포 자멸사 조각을 측정하였다.
- Oct4를 과발현시킨 돼지 섬유아세포를 이용하여 핵이식을 수행한 결과, 배반포 생성률이 높아졌다는 연구결과가 있었으며(Kim 등, 2014), Nanog를 과발현시킨 돼지 섬유아세포를 이용하여 핵이식을 한 경우 배반포 생성률 및 총 세포 수는 유의적인 차이가 없다는 연구결과가 있었다(Zhang 등, 2011). 또한 본 실험실의 이전 논문에서는 Oct4 발현량이 낮은 후기 계대의 돼지 골수 유래 중간엽줄기세포를 핵이식 공여세포로 사용한 경우, 배반포 발달율이 5.6%로 초기 계대 공여세포의 17.2%에 비하여 배반포 발달율이 낮은 것을 확인하고, 후기 계대의 중간엽줄기세포에 Oct4를 transfection하여 핵이식을 수행하였다. 그 결과, 핵이식 효율이 초기 계대의 중간엽줄기세포를 공여세포로 사용한 수준만큼 개선되진 않았지만 배반포 발달율이 13.
- 모든 배지의 pH와 삼투압은 각각 7.2와 285±5 mOsm/l로 조정하였다.
- 탈핵란은 상온에서 2분 동안 Hoechst33342 염색을 한 다음, 형광현미경(wave length 350nm)으로 탈핵 여부를 확인하였다. 미세 조작 기기를 이용하여 형광현미경상에서 RFP 발현이 확인된 공여세포를 탈핵란의 위란강 부분으로 넣어주었다. 모든 미세 조작 과정은 paraffin oil 아래 HEPES-buffered TCM 199 배지에서 수행하였다.
- 분리된 세포층을 추출한 다음, DPBS와 Advanced-Dulbecco modified Eagle Medium(ADMEM)를 사용하여 500 ×g에서 10분 동안 원심분리로 두 번 세척하였다.
- , CA)에 고정시킨 후 형광현미경 하에서 관찰하였다. 세포 자멸사는 in situ Cell Death Detection Kit(Roche, Germany) 키트를 사용하여 제조사의 실험방법에 따라 TUNEL 염색을 통해 확인하였다. 핵이식 수정란을 4% formaldehyde 용액에 넣어 4℃에서 1시간 동안 고정시킨 다음, 0.
- 체외 배양 7일째 되는 날 핵이식 수정란을 수집하여 Oct4-RFP의 분포, 총 세포수와 세포 자멸사를 확인하였다. 핵이식 수정란의 Oct4-RFP의 분포를 확인하기 위하여 핵이식 수정란을 4% formaldehyde 용액에 넣어 4℃에서 1시간 동안 고정시킨 다음, Vecta SheilTM(Vetor Laboratories Inc.
- 체외 성숙 41시간 후, 0.1%(w/v) hyaluronidase가 포함된 DPBS에서 1분 동안 피펫팅하여 난자에서 난구 세포를 제거 후, 7.5 µg/ml cytochalasin B(CCB), 0.3% BSA와 12 mM sorbitol가 포함된 HEPES-buffered TCM199에서 미세 조작 기술을 이용하여 난자에서 핵을 제거하였다.
- 제 1극체와 소량의 세포질을 내경 15∼20 µm의 micropippet을 사용하여 제거하였다. 탈핵란은 상온에서 2분 동안 Hoechst33342 염색을 한 다음, 형광현미경(wave length 350nm)으로 탈핵 여부를 확인하였다. 미세 조작 기기를 이용하여 형광현미경상에서 RFP 발현이 확인된 공여세포를 탈핵란의 위란강 부분으로 넣어주었다.
- 체외 배양 7일째 되는 날 핵이식 수정란을 수집하여 Oct4-RFP의 분포, 총 세포수와 세포 자멸사를 확인하였다. 핵이식 수정란의 Oct4-RFP의 분포를 확인하기 위하여 핵이식 수정란을 4% formaldehyde 용액에 넣어 4℃에서 1시간 동안 고정시킨 다음, Vecta SheilTM(Vetor Laboratories Inc., CA)에 고정시킨 후 형광현미경 하에서 관찰하였다. 세포 자멸사는 in situ Cell Death Detection Kit(Roche, Germany) 키트를 사용하여 제조사의 실험방법에 따라 TUNEL 염색을 통해 확인하였다.
대상 데이터
- 10% FBS가 포함된 ADMEM를 사용하여 35 mm cell culture dish에 1×105개의 세포를 온도 38.5℃에 5% CO2 환경의 배양기에서 배양하였다.
- Oct4가 transfection된 5∼10계대의 골수유래 중간엽줄기세포가 핵이식 공여세포로 사용되었다.
- 별도로 표시된 경우가 아니면, 모든 시약과 배지는 Gibco(Life Technologies, Burlington, ON, Canada)와 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하였다. 모든 배지의 pH와 삼투압은 각각 7.
- 핵이식 배반포와 RFP 발현이 확인된 Oct4-RFP 핵이식 배반포 각 25개를 실험에 공시하였다. 핵이식 수정란의 총 세포 수와 세포 자멸사는 Fig.
데이터처리
- 데이터는 SPSS 18.0 프로그램을 사용하여 One-way ANOVA와 Games-Howell 사후 분석을 통해 분석하였다. 통계적 유의성은 P<0.
- 데이터는 평균±표준평균오차로 나타내었다.
성능/효과
- 본 연구에서는 Oct4-RFP를 transfection한 돼지 골수유래 중간엽줄기세포를 공여세포로 핵이식하였을 때, 핵이식 수정란에서의 Oct4의 발현위치를 확인하였다. 그 결과, Oct4를 transfection 한 핵이식 수정란의 ICM과 trophectoderm 모두에서 RFP 발현을 확인할 수 있었다. 특히 유전자를 transfection한 공여세포 이식에 의한 형질전환 핵이식란의 경우, 형광단백질 마커의 발현에 mosaicism이 나타날 수도 있는 것으로 알려져 있다.
- 1b에 나타내었다. 대부분의 transfection된 중간엽줄기세포에서 Oct4-RFP가 발현되는 것을 확인하였다.
- 반대로, in vivo와 in vitro에서 생산된 돼지와 소수정란에서는 ICM과 trophectoderm 모두에서 Oct4 발현을 확인하였다(Kirchhof 등, 2000). 또한, Oct4-promoter-enhanced green fluorescent protein(EGFP)가 transfection된 토끼 수정란에서는 ICM과 trophectoderm 모두에서 Oct4-EGFP 발현을 확인하였다. 돼지 난자에서의 Oct4 전사체는 착상 전부터 epiblast로 될 때까지의 과정 동안 발현이 확인되었다(Magnani와 Cabot, 2008; Hall 등, 2009).
- 따라서 자가 사멸사와 총 세포 수를 통해 착상과 뒤이은 성장을 위한 수정란 평가를 할 수 있다(Machaty 등, 1998; Hao 등, 2003; Fabian 등, 2005). 본 실험에서는 Oct4를 transfection한 중간엽줄기세포를 이용하여 핵이식하였을 경우 총 세포 수는 차이가 없었지만, 세포 자멸사는 Oct4를 transfection한 핵이식 수정란에서 유의적으로 적게 나타나는 것을 확인하였다. 본 실험 결과와 유사하게 Oct4를 transfection한 공여 세포를 이용하여 핵이식을 수행한 결과, 유의적으로 높은 배반포 생성률과 낮은 배반포 세포 자멸사를 확인하였다(Ji 등, 2014).
- 본 실험을 통하여 Oct4를 transfection한 세포를 핵이식 공여 세포를 사용했을 때, 배반포에서 전체적으로 Oct4 발현이 나타났으며, Oct4 transfection이 핵이식 수정란의 총 세포 수에는 영향을 끼치지 않았으나, 세포 자멸사가 대조군보다 적게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
- EGFP를 transfection한 소 체세포를 돼지 난자 내에 이식한 이종간 형질전환 핵이식란에서 mosaicism이 관찰되지 않았다고 보고(Uhm 등, 2007)하지만, 돼지의 경우 EGFP를 transfection 한 귀섬유아세포 유래 돼지 형질전환 핵이식란의 경우 59%에서 mosaicism이 관찰되었다고 보고(Park 등, 2002)하는 등 형질전환 핵이식란의 mosaicism 발생은 불분명한 상황이며, 본 연구에서는 Oct4-RFP를 transfection한 핵이식 배반포의 세포 밀집 정도에 따라서 형광발현 정도의 차이는 관찰되었지만, 명확한 mosaicsim은 관찰되지 않았다. 특히 배반포의 해칭된 부분에서 높은 발현을 확인되었는데, 이는 할구가 비교적 밀집되어 있기 때문에 관찰되는 결과이며, 돼지 체외배양란의 경우 배반포 내 ICM과 trophectoderm의 경계가 비교적 불분명하기 때문에 배반포 내 명확한 부위를 판별이 어려운 편이지만, Oct4-RFP의 trophectoderm에서의 발현은 확인할 수 있었다.
- 하지만, Oct4-transfection 하지 않은 핵이식 수정란의 세포 자멸사는 Oct4가 transfection 된 핵이식 수정란과 비교하였을 때, 유의적으로(P<0.05) 높은 개수를 확인할 수 있었다.
- 핵이식란과 Oct4-RFP 핵이식 배반포의 총세포수는 각각 42.29±3.44개와 40.33±3.28개였으며, 해당 배반포 내의 apoptotic body는 각각 5.29±1.17개와 0.5±0.29개로 확인되었다.
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