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문제 정의
- 따라서 본 연구는 인을 축적하는 능력을 가진 미생물(Phosphate Accumulating Organisms, PAOs)로 알려진 Alcaligenes sp.에 5가지 중금속들(Cd, Cu, Zn, Pb, Zn)을 단일, 2종 처리 시 미생물의 생장 및 인 제거에 미치는 영향을 비교분석함으로써 중금속들이 인 제거 미생물의 생장과인 제거에 미치는 상승효과(synergistic effect) 또는 길항효과(antagonistic effect) 효과에 관한 연구를 수행하는 것을 목적으로 한다.
제안 방법
- Alcaligenes sp.에 대한 단일 중금속 처리에 따른 저해효과를 확인하기 위해 각 미생물에 처리한 중금속과 그 농도에 따른 균주의 생장, IC50, 인 제거율, EC50을 측정하였다. 생장의 경우, 처리한 중금속의 농도가 증가할수록 미생물의 OD600 값이 감소하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 3-4). 각 중금속 처리구의 처리 농도에 따른 Alcaligenes sp.의 생장저해정도 (GI, %) 를 계산 후, 결과 값을 선형회귀 분석하여 2종 중금속 처리 시 중금속 별 IC50에 해당하는 농도를 추정하였다. 또한, 2종 중금속을 균주에 적용시킬 경우 중금속 간 교호작용을 판단하기 위해 상호작용을 평가하였으며, 그 결과는 Table 4 와 같다.
- 1). 균주의 중금속 처리 별 생장곡선을 이용하여 중금속 처리구에 따른 균주의 Growth Inhibition (GI, %)를 계산하였으며, 결과 값을 선형회귀 분석하여 중금속 처리 시 균주의 생장이 절반이 되는 농도인 IC50 (mg.L-1) 에 해당하는 농도를 추정하였다. Alcaigenes sp.
- 다음으로, 중금속 혼합 처리가 균주의 인 제거에 미치는 영향을 확인하기 위해 초기 인 농도와 최종 인 농도를 측정하였으며, 각각의 중금속 처리구 별 인 제거율은 Fig. 5 와 같다.
- 반수 생장 저해 농도(half of inhibition concentration of bacterial growth, IC50) 및 반수 인 제거 효율 저해 농도(half of effective concentration of phosphorus removal efficiencies, EC50)의 계산은 흡광도 값에 자연로그를 취한값을 시간별로 최소 제곱 추정에 의해 나타나는 선형 회귀식을 이용하였다. 반수치사농도인 IC50를 추정하기 위한 Log gamma 분포는 생장저해 결과를 회귀 분석하여 결정하였고 (Asami et al., 1996), EC50은 중금속 처리에 따른 인 제거가 대조구의 절반이 되는 지점으로 추정하였다(Chen et al., 1997).
- 채취한 시료는 분광광도계(Model UV Mini 1240 Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 600 nm 의 파장에서 3 시간마다 1회 흡광도를 측정하였으며, 배지 내 총 인 농도는 ascorbic acid에 의한 몰리브덴 청법을 변형하여 측정하였다(Kim, 2012). 분광광도계(Model UV Mini 1240 Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 880 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 초기 및 최종 인 농도의 비교를 통해 단일 미생물 및 혼합 미생물 처리구 간 인 제거 효율을 비교 분석하였다.
- 2종류의 중금속을 처리하였을 때의 저해효과의 확인을 위해 Alcaligenes sp. 에 처리한 중금속과 그 농도에 따른 균주의 생장, IC50, 인 제거율 및 EC50을 측정하였다. 중금속 동시 처리에 따른 미생물 생장저해 효과의 비교를 통해 중금속을 단일물질로 처리할 경우와 2종으로 처리할 경우 생기는 교호작용의 판단은 additive index value를 이용하였다.
- 에 처리한 중금속과 그 농도에 따른 균주의 생장, IC50, 인 제거율 및 EC50을 측정하였다. 중금속 동시 처리에 따른 미생물 생장저해 효과의 비교를 통해 중금속을 단일물질로 처리할 경우와 2종으로 처리할 경우 생기는 교호작용의 판단은 additive index value를 이용하였다. 2종의 중금속 처리 시 Alcaligenes sp.
- 중금속이 균주의 인 제거에 미치는 영향을 확인하기 위해 초기 인 농도와 최종 인 농도를 측정하였으며, 각각의 중금속 처리구 별 인 제거율은 Fig. 2 와 같다.
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중금속 처리
처리구의 설정은 실험배지에 균주를 처리하지 않은 blank, 배지에 균주만 처리한 대조구, 단일 및 2종 중금속을 중금속 별로 4개의 농도로 처리한 중금속 처리구로 하였다. 실험에 사용된 중금속 표준용액은 Cd standard solution, Cu standard solution, Zn standard solution, Pb standard solution, Ni standard solution (1,000mg/kg, Kanto chemical Co.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 미생물은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양받은 Alcaligenes sp. KCTC 12036 이다. 미생물 배양에 사용된 배지는 basic medium solution, phosphate solution 1000 mg.
- 본 연구에 사용된 미생물은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양받은 Alcaligenes sp. KCTC 12036 이다.
데이터처리
- 1 (SAS Institute, Cary, North Carolina, USA)를 이용하여 실시하였다. 실험결과의 유의한 차이를 조사하기 위해 ANOVA(analysis of variance) 분석과 Tukey’s HSD(honest significant difference) test를 실시하였으며, 신뢰구간은 95% 수준으로 설정하였다. 모든 실험은 3반복 실시되었다.
이론/모형
- 반수 생장 저해 농도(half of inhibition concentration of bacterial growth, IC50) 및 반수 인 제거 효율 저해 농도(half of effective concentration of phosphorus removal efficiencies, EC50)의 계산은 흡광도 값에 자연로그를 취한값을 시간별로 최소 제곱 추정에 의해 나타나는 선형 회귀식을 이용하였다. 반수치사농도인 IC50를 추정하기 위한 Log gamma 분포는 생장저해 결과를 회귀 분석하여 결정하였고 (Asami et al.
- 중금속 혼합 처리 시, 중금속 간 교호작용을 확인하기 위해 additive toxicity index method(Marking and Mauck, 1975)를 이용하였다. Additive toxicity index method는 각각의 화학물질의 IC50 및 EC50 값과 혼합되었을 때의 IC50 및 EC50 값을 구해 이를 이용하여 혼합물질의 독성에 대한 각각 화학물질의 기여도를 평가하는 방법으로 계산식은 아래와 같다.
성능/효과
- L-1) 에 해당하는 농도를 추정하였다. Alcaigenes sp.에 대한 중금속의 생장저해효과에 대해 알아본 결과, 카드뮴 처리구의 GI (%)는 각각 40.7%, 57.4%, 62.4%, 87.6% 이었고, 구리 처리구 별 GI (%)는 1.9%, 2.2%, 26.8%, 67.4% 였으며, 아연의 경우, GI (%)는 17.3%, 18.6%, 26.9%, 65.0% 이었다. 납 처리구에서 GI (%)는 23.
- 중금속의 생장저해효과를 이용하여 각 중금속 처리에 따른 IC50에 해당하는 농도를 추정하였으며, 그 결과는 Table 2 와 같다. IC50에 해당하는 농도를 기준으로 중금속 저해효과를 비교한 결과, 균주에 대한 중금속의 생장 저해효과는 Cd>Pb≥Zn>Ni>Cu 의 순으로 강하였다. 이는 Cho 등(2004)이 실시한 중금속에 의한 대장균 생장저해의 정량적 평가 연구 결과 중, 카드뮴에 대한 내성이 다른 중금속에 비해 낮다는 연구결과와 유사하였다.
- 4% 감소한 것을 확인할 수 있었다. 구리 처리구는 대조구에 비해 인 제거효율이 각각 20.3%, 39.1%, 52.6%, 82.1% 감소하였고, 아연 처리구의 경우, 대조구에 비해 인 제거효율이 36.4%, 54.4%, 76.8%, 92.0% 감소한 것을 확인할 수 있었다. 납 처리구에서는 대조구에 비해 인 제거효율이 47.
- 또한, 2종 중금속을 균주에 적용시킬 경우 중금속 간 교호작용을 판단하기 위해 상호작용을 평가하였으며, 그 결과는 Table 4 와 같다. 균주의 생장에 미치는 저해효과가 가장 강한 처리구는 Cd + Cu 처리구로, IC50에 해당하는 농도가 9.55 mg/L 임을 확인할 수 있었다. 반면, 균주 생장 저해효과가 가장 약한 중금속 처리구는 Zn + Pb 처리구였으며, IC50에 해당하는 농도가 27.
- 이러한 결과는 2 종의 중금속 혼합 처리 시 중금속 간 교호작용은 대부분 상가적(additive) 또는 상승적 상호작용(synergistic interaction) 이라고 보고하였던 Buhl과 Hamilton(1997), Tao 등(1999) 의 연구보고와 상이하였다. 그러나, 독성의 연구에 활용한 bioassay의 method에 따라 혼합독성의 양상이 다르게 나타날 수 있으며, 실험 결과 중금속 간 상호작용이 길항효과(antagonistic effect) 로 나타난 결과가 더 많은 것은 생물학적 독성평가에서 일반적으로 사용하는 미생물(E. coli, Vibrio Fischeri)이 아닌 인 축적능을 갖는 미생물을 선별하였기 때문인 것으로 사료된다.
- 0% 감소한 것을 확인할 수 있었다. 납 처리구에서는 대조구에 비해 인 제거효율이 47.1%, 62.4%, 73.8%, 92.4% 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 니켈 처리구는 대조구에 비해 인 제거효율이 각각 34.6%, 60.6%, 69.7%, 98.3% 감소한 것을 확인할 수 있었다. 중금속 처리에 따른 인 제거효율의 저해효과를 기초로 하여 Alcaligenes sp.
- coli, Vibrio Fischeri)이 아닌 인 축적능을 갖는 미생물을 선별하였기 때문인 것으로 사료된다. 또한, 인 제거 반응이 절반이 되는 농도인 EC50이 미생물의 생장이 절반이 되는 농도인 IC50에 비해 전체적으로 낮은 경향을 보이는 것으로 나타났다(Tables 2–5). 이는 Diamantino 등(2001) 이 Daphnia magna의 lactate 가수분해효소의 활성에 아연이 미치는 독성에 대한 연구 결과 중 IC50와 EC50의 농도를 비교한 내용과 일치하였다.
- 55 mg/L 임을 확인할 수 있었다. 반면, 균주 생장 저해효과가 가장 약한 중금속 처리구는 Zn + Pb 처리구였으며, IC50에 해당하는 농도가 27.64 mg/L 인 것을 확인할 수 있었다. 중금속 혼합 처리에 따른 교호작용을 additive index value를 이용하여 평가한 결과, 상승효과(synergistic effect)를 보인 처리구는 Cu + Zn, Cu + Pb, Cu + Ni, Pb + Ni 처리구인 것을 확인할 수 있었다.
- 에 대한 단일 중금속 처리에 따른 저해효과를 확인하기 위해 각 미생물에 처리한 중금속과 그 농도에 따른 균주의 생장, IC50, 인 제거율, EC50을 측정하였다. 생장의 경우, 처리한 중금속의 농도가 증가할수록 미생물의 OD600 값이 감소하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 2종의 중금속 처리 시 Alcaligenes sp. 의 생장은 중금속 처리농도가 증가할수록 감소하는 경향을 보였으며, 미생물의 활성이 급격히 증가하기 시작하는 log phase에 도달하는 시간이 지연되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3-4).
- 2 와 같다. 인 제거효율 또한 처리한 중금속의 종류에 관계없이 중금속 처리 농도가 증가할 수록 감소하는 경향을 보였다. 인 제거효율은 미생물만을 처리한 대조구에서 가장 높았으며, 처리구별 인 제거 효율을 이용하여 중금속 처리농도에 따른 인 제거 저해효과를 평가하였다.
- 인 제거효율 또한 처리한 중금속의 종류에 관계없이 중금속 처리 농도가 증가할 수록 감소하는 경향을 보였다. 인 제거효율은 미생물만을 처리한 대조구에서 가장 높았으며, 처리구별 인 제거 효율을 이용하여 중금속 처리농도에 따른 인 제거 저해효과를 평가하였다. 평가 결과, 카드뮴 처리구의 인 제거효율은 대조구에 비해 각각 37.
- 측정 결과, 인 제거효율은 중금속의 종류에 관계없이 처리한 중금속의 농도가 증가할수록 감소하는 경향을 보였다. 인 제거효율은 중금속을 처리하지 않은 대조구에서 가장 높았으며, 처리구별 인 제거 저해효과를 계산 후, 결과 값을 선형회귀 분석하여 인 제거반응이 절반이 되는 지점인 EC50을 추정하였다. 중금속 혼합 시, 교호작용의 판단은 위해 additive index value를 이용하였다(Table 5).
- 41 mg/L 이었다. 중금속 간 교호작용 평가 결과, Cu + Ni 처리구는 상승효과(synergistic effect)를 보였으며, Cu + Zn, Pb + Ni 처리구에서는 상가효과(additive effect)를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 2 종의 중금속 혼합 처리 시 중금속 간 교호작용은 대부분 상가적(additive) 또는 상승적 상호작용(synergistic interaction) 이라고 보고하였던 Buhl과 Hamilton(1997), Tao 등(1999) 의 연구보고와 상이하였다.
- 의 인 제거효과가 절반이 되는 농도인 EC50을 추정하였으며, 그 결과는 Table 3과 같다. 중금속 처리에 따른 인 제거 저해효과는 Cd>Zn>Pb>Cu>Ni 순으로 강한 것을 확인할 수 있었다.
- 64 mg/L 인 것을 확인할 수 있었다. 중금속 혼합 처리에 따른 교호작용을 additive index value를 이용하여 평가한 결과, 상승효과(synergistic effect)를 보인 처리구는 Cu + Zn, Cu + Pb, Cu + Ni, Pb + Ni 처리구인 것을 확인할 수 있었다.
- 0% 였다. 중금속의 종류에 상관없이 모든 처리구에서 중금속의 농도가 증가할수록 미생물의 생장에 미치는 저해효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 중금속의 생장저해효과를 이용하여 각 중금속 처리에 따른 IC50에 해당하는 농도를 추정하였으며, 그 결과는 Table 2 와 같다.
- 5 와 같다. 측정 결과, 인 제거효율은 중금속의 종류에 관계없이 처리한 중금속의 농도가 증가할수록 감소하는 경향을 보였다. 인 제거효율은 중금속을 처리하지 않은 대조구에서 가장 높았으며, 처리구별 인 제거 저해효과를 계산 후, 결과 값을 선형회귀 분석하여 인 제거반응이 절반이 되는 지점인 EC50을 추정하였다.
- 인 제거효율은 미생물만을 처리한 대조구에서 가장 높았으며, 처리구별 인 제거 효율을 이용하여 중금속 처리농도에 따른 인 제거 저해효과를 평가하였다. 평가 결과, 카드뮴 처리구의 인 제거효율은 대조구에 비해 각각 37.4%, 51.6%, 73.8%, 89.4% 감소한 것을 확인할 수 있었다. 구리 처리구는 대조구에 비해 인 제거효율이 각각 20.
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