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문제 정의
- 이 연구에서는 현재 급속도로 성장하고 있는 물 재이용 산업의 효율적이고 안전한 관리를 위한 최적의 바이러스 지표미생물을 개발하기 위해서 물리적, 화학적, 그리고 형태적으로 특성이 다른 여러 가지 박테리오파지를 선별하여 그들의 하수 처리 과정 중의 염소 소독 과정에 대한 저항성을 측정하였다. 이 연구에서 사용한 박테리오파지들은 하수 처리 과정의 염소 소독 과정에서 박테리아 지표미생물에 비해 상당한 저항성을 보였으며, 그 중에서도 박테리오파지 PRD1과 MS2가 하수처리의 염소 소독과정에 가장 큰 큰 저항성을 보였다.
제안 방법
- 각각의 박테리오파지의 염소에 대한 저항성을 정량적으로 계산하기 위하여 먼저 초기 박테리오파지농도(N0)를 각각의 노출시간에서의 박테리오파지농도(Nt)와 비교하여 그 상대적 감소를 로그값으로 계산하였다(log10(Nt/N0)). 다음으로 각각의 실험에서 (실제 하수처리 과정에서의 상황을 반영하기 위하여) 서로 다른 염소농도를 사용하였기 때문에 그 효과를 표준화시키기 위하여 염소농도와 노출시간을 곱한 값인 CT값 (mg/L*min)을 X축으로 하고, 위에서 구한(log10(Nt/N0)) 값을 Y축으로 하여 이들 간의 상관관계를 그래프로 그렸다.
- 1에서 노출시간 1분일 때의 CT값은 초기 염소농도와 1분에 측정한 농도의 평균값에 시간차인 1을 곱해 구했다. 노출 시간 3분일 때의 CT값은 앞의 방법과 같이 1분과 3분에서의 염소 농도의 평균값과 시간차인 2를 곱해준 뒤 앞의 1분에서 계산한 값에 더해 주어 계산하였다. 나머지 시간에서도 같은 방법으로 계산하였다.
- 간단히 설명하면, 먼저 온도 조절이 가능한 수조 내에 설치된 유리관 속에 여러 지역에서 채집한 하수를 넣고 여기에 적절한 농도의 박테리오파지(~ 106 Plaque Forming Unit(PFU)/mL)를 넣은 다음 충분히 섞어주었다. 다음에 위에서 언급한대로 미리 정해진 농도의 염소가 든 용액을 넣어 준 다음 미리 정해진 시간마다 소량의 시료를 채집하였다. 채집한 시료는 즉시 같은 분량의 sodium thiosulfate(0.
- )). 다음으로 각각의 실험에서 (실제 하수처리 과정에서의 상황을 반영하기 위하여) 서로 다른 염소농도를 사용하였기 때문에 그 효과를 표준화시키기 위하여 염소농도와 노출시간을 곱한 값인 CT값 (mg/L*min)을 X축으로 하고, 위에서 구한(log10(Nt/N0)) 값을 Y축으로 하여 이들 간의 상관관계를 그래프로 그렸다. 이 연구에서는 각각의 실험에서 시간에 따른 염소 농도의 변화를 측정하였으며, Fig.
- 간략히 설명하면, 우선 각각의 박테리오파지를 이중 한천층 플라크기법(double agar layer plaque technique) (Adams, 1959)으로 각각의 적절한 숙주에서 배양하였다. 다음으로 박테리오파지에 의해 숙주가 100% 분해가 일어난 용기들을 선택하여 그 용기에 소량의 완충용액을 첨가하여 상층의 한천층만을 끌어내었다. 다음에 새로운 박테리오파지가 들어있는 이 한천용액에 같은 분량의 클로로포름을 첨가하여 빠른 속도에서 잘 섞은 다음, 저온에서 원심분리(4000 g, 30분)한 후 그 상층액만을 분리하였다.
- 25-75 mg/L*min에 이르는 등 큰 차이를 보였다. 본 연구에서도 실제 하수에서의 염소소독에 앞서 예비실험으로 완충용액에서의 실험을 수행하였다. 완충용액으로서는 pH 7.
- 즉, 매 실험 당일 표백제를 증류수로 희석하여 그날 사용할 염소 농도로 맞추어 준비하였다. 실제 하수처리과정에서 사용되는 다양한 염소농도를 반영하기 위해서 한 종류의 하수에 대해 여러 가지 염소농도를 적용하였다(Table 3). 잔류 염소의 농도는 N, N diethyl-pphenylenediamine (DPD) 발색법(American Public Health Association, 1995)으로 측정하였다.
- Table 2는 이 연구에 사용된 하수의 물리적, 화학적 특성을 나타낸다. 염소 소독에 대한 박테리오파지의 저항성이 하수의 다양한 물리적, 화학적 특성에 따라 어떤 영향을 받는지를 알아보기 위해서 지리적으로 다양한 지역(의왕, 당진, 원주)에서 하수를 채취하였다. 연구에 사용된 하수는 각각의 하수처리장의 생물학적 처리과정을 거친 2차 처리수이다.
- 다음으로 각각의 실험에서 (실제 하수처리 과정에서의 상황을 반영하기 위하여) 서로 다른 염소농도를 사용하였기 때문에 그 효과를 표준화시키기 위하여 염소농도와 노출시간을 곱한 값인 CT값 (mg/L*min)을 X축으로 하고, 위에서 구한(log10(Nt/N0)) 값을 Y축으로 하여 이들 간의 상관관계를 그래프로 그렸다. 이 연구에서는 각각의 실험에서 시간에 따른 염소 농도의 변화를 측정하였으며, Fig. 1은 그 한 예로 박테리오파지 MS2를 의왕 하수처리장에서 채집한 2차 처리수에서 5 mg/L의 초기 염소 농도로 30분간 처리할 때의 시간에 따른 염소 농도의 변화를 나타낸다. 이러한 시간에 따른 염소 농도를 바탕으로 특정한 노출시간에 실제로 박테리오파지의 소독에 이용된 정확한 염소의 양을 계산하여 보다 정확한 CT값을 계산할 수 있었다.
- 이 연구에서는 최근에 바이러스 지표미생물로 새로이 관심을 받고 있는 박테리오파지 PRD1을 포함하여 이전 연구에서 병원성 바이러스의 지표 미생물로 제안된 박테리오파지들의 하수처리 과정의 대표적인 소독과정인 염소소독에 대한 저항성을 지리적으로 다른 여러 지역에서 채집한 2차 처리수에서 함께 측정하였다. 이 연구는 지금까지 병원성 바이러스의 지표 미생물로 제안된 대표적인 박테리오파지들을 동일한 조건에서 직접 비교하는 첫 번째 연구이며, 이 연구에서 도출된 결과는 물 재이용 과정의 가장 심각한 문제 중 하나인 병원성 바이러스에 대한 최적의 지표미생물을 개발하는데 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 생각된다.
- 2-4는 지리적으로 다양한 여러 지역의 하수처리장에서 채집한 2차 처리수에서 염소 소독 과정을 실시했을 때 여러 박테리오파지의 저항성을 측정한 것을 정리한 것이다. 재료와 방법에서 언급된 바와 같이 실제 하수처리 과정에서 사용되는 다양한 염소 농도를 반영하기 위해서 각각의 하수에 대해서 여러 염소 농도를 적용하였고, 그 효과를 표준화하기 위해서 미국 환경청 등에서 소독처리의 기준으로 사용하는 CT값(mg/L*min)을 X축으로 하고 불활성 정도(Log (Nt/N0)를 Y축으로 하여 그래프를 그렸다. 이들 Figure에서 보는 바와 같이 이 세 지역 모두에서 박테리오파지 φX174가 염소 소독에 대해 상대적으로 가장 낮은 저항성을 가지는 것으로 나타났다 – 즉, 박테리오파지 φX174는 이 세 지역 모두에서 CT값 5 mg/L*min으로 4 log10 이상의 불활성화가 이루어졌다.
대상 데이터
- 본 연구에서도 실제 하수에서의 염소소독에 앞서 예비실험으로 완충용액에서의 실험을 수행하였다. 완충용액으로서는 pH 7.2의 phosphate buffered saline(PBS)를 이용하였으며, 온도는 하수처리의 최악조건이라 할 수 있는 5˚C를 사용하였다. 비록 이전 연구의 실험조건 중 본 연구의 실험조건과 일치하는 것이 없어 이전 연구와의 직접적인 비교는 불가능하지만, 본 연구의 예비실험에서 얻어진 박테리오파지 MS2와 φX174의 CT값은 이전 연구에서 구한 것들의 범위내에 있는 것으로 나타났다.
데이터처리
- 나머지 시간에서도 같은 방법으로 계산하였다. 각각의 박테리오파지의 염소에 대한 저항성은 EXCEL 통계패키지의 단순 선형 회귀법으로 구하였고, 하수의 다양한 물리적, 화학적요소가 염소 소독에 의한 박테리오파지의 불활성에 미치는 영향은 SAS 통계패키지의 복합 선형 회귀법으로 구하였다.
이론/모형
- 연구에 사용된 하수는 각각의 하수처리장의 생물학적 처리과정을 거친 2차 처리수이다. Table 2에 나타난 수질 특성은 각각의 하수처리장에서 제공한 측정값이며 이들 하수처리장에서 pH, BOD, COD, SS를 수질환경보존법상에 규정된 수질오염공정시험법으로 측정하였으며, T-N과 T-P는 Hach시약을 이용해 각각 과황산염 온침법과 몰리브도바다닌산법으로 측정하였다. 암모니아성 질소의 농도는 의왕 4.
- 이전 연구에서 서술된 바와 같이(Shin et al, 2005) 이러한 박테리오파지들은 적절한 숙주(Table 1)에서 배양한 뒤 클로로포름을 이용하여 추출하였다. 간략히 설명하면, 우선 각각의 박테리오파지를 이중 한천층 플라크기법(double agar layer plaque technique) (Adams, 1959)으로 각각의 적절한 숙주에서 배양하였다. 다음으로 박테리오파지에 의해 숙주가 100% 분해가 일어난 용기들을 선택하여 그 용기에 소량의 완충용액을 첨가하여 상층의 한천층만을 끌어내었다.
- 박테리오파지는 위에서 언급한 이중 한천층 플라크 기법으로 정량하였다(Adams, 1959). 각각의 박테리오 파지는 각각에 적절한 배지와 배양조건에서 배양하였으며, 그 최종정량은 플라크 형성 정도(PFU)/mL)로 나타내었다.
- 염소 소독 실험은 우리 연구실에서 제작하여 이전 연구에 성공적으로 사용하였던 화학소독장치에서 실행하였다(Shin and Sobsey, 2008). 간단히 설명하면, 먼저 온도 조절이 가능한 수조 내에 설치된 유리관 속에 여러 지역에서 채집한 하수를 넣고 여기에 적절한 농도의 박테리오파지(~ 106 Plaque Forming Unit(PFU)/mL)를 넣은 다음 충분히 섞어주었다.
- 실제 하수처리과정에서 사용되는 다양한 염소농도를 반영하기 위해서 한 종류의 하수에 대해 여러 가지 염소농도를 적용하였다(Table 3). 잔류 염소의 농도는 N, N diethyl-pphenylenediamine (DPD) 발색법(American Public Health Association, 1995)으로 측정하였다.
성능/효과
- 예를 들어 무기성 질소인 암모니아는 염소와 반응하여 모노클로라민(monochloramine)이나 디클로라민(dichloramine) 등을 생성하는데(Hass, 2000) 이들은 염소에 비해 수인성 병원성에 대해 현저히 낮은 소독 능력을 보인다(Sobsey, 1989). 마지막으로 이 연구에서는 부유물질이 하수에서의 염소 소독에 의한 박테리오파지의 불활성에 상대적으로 큰 영향을 보이는 것으로 나타났는데 이는 하수에 있는 입자상물질, 특히 유기물들이 염소와 반응하면서 소모되어 염소의 박테리오파지에 대한 소독 능력을 현저히 저하시킨 것으로 생각된다.
- 비록 이전 연구의 실험조건 중 본 연구의 실험조건과 일치하는 것이 없어 이전 연구와의 직접적인 비교는 불가능하지만, 본 연구의 예비실험에서 얻어진 박테리오파지 MS2와 φX174의 CT값은 이전 연구에서 구한 것들의 범위내에 있는 것으로 나타났다.
- 이 연구에서는 현재 급속도로 성장하고 있는 물 재이용 산업의 효율적이고 안전한 관리를 위한 최적의 바이러스 지표미생물을 개발하기 위해서 물리적, 화학적, 그리고 형태적으로 특성이 다른 여러 가지 박테리오파지를 선별하여 그들의 하수 처리 과정 중의 염소 소독 과정에 대한 저항성을 측정하였다. 이 연구에서 사용한 박테리오파지들은 하수 처리 과정의 염소 소독 과정에서 박테리아 지표미생물에 비해 상당한 저항성을 보였으며, 그 중에서도 박테리오파지 PRD1과 MS2가 하수처리의 염소 소독과정에 가장 큰 큰 저항성을 보였다. 이들 박테리오파지들은 병원성바이러스에 비해 그 정량법이 훨씬 쉽고, 간단하고 저렴하며 또한 하수 처리 과정 중의 염소 소독 과정에 대한 강한 저항성을 보여 물 재이용 과정의 병원성바이러스의 지표미생물로 적절할 것으로 생각된다.
- 이 연구의 결과들을 종합해 보면 하수 처리 과정 중의 염소 소독에 대한 병원성 바이러스의 지표미생물로 박테리오파지 PRD1이나 박테리오파지 MS2가 적절한 것으로 보인다. 먼저 이들 박테리오파지들은 하수에서 병원성 바이러스에 비해 상대적으로 많은 수가 존재하며, 또한 그 정량법이 병원성 미생물에 비해 훨씬 쉽고, 간단하고 저렴하다(Sobsey et al, 1995).
- 1은 그 한 예로 박테리오파지 MS2를 의왕 하수처리장에서 채집한 2차 처리수에서 5 mg/L의 초기 염소 농도로 30분간 처리할 때의 시간에 따른 염소 농도의 변화를 나타낸다. 이러한 시간에 따른 염소 농도를 바탕으로 특정한 노출시간에 실제로 박테리오파지의 소독에 이용된 정확한 염소의 양을 계산하여 보다 정확한 CT값을 계산할 수 있었다. 즉, Fig.
- 즉, 이 연구에서 보는 바와 같이 하수처리에서는 비록 CT값은 같다고 하더라도 소독제의 농도가 높고 접촉시간이 짧은 경우가 소독제의 농도가 낮고 접촉시간이 긴 경우에 비해 일반적으로 높은 소독능력을 보이는 것으로 나타났다(실제로 복합 선형 회귀법에 의한 분석에서도 박테리오파지들의 불활성은 접촉시간(p값: 0.4485 (MS2), 0.0218 (PRD1), 0.0001 (φX174))보다는 농도 (p값: 0.0112 (MS2), <0.0001 (PRD1), 0.0001 (φX174))에 더 많이 의존하는 것으로 나타났다).
- 하수의 여러 물리적, 화학적 요소가 염소소독에 의한 박테리오파지의 불활성에 미치는 영향을 복합 선형 회귀법으로 분석한 결과, 하수의 부유물질이 염소소독에 의한 박테리오파지의 불활성에 상대적으로 큰 영향을 보이는 것으로 나타났으며(p값: 0.0272 (MS2), 0.0383 (PRD1), 0.0043 (φX174)).
후속연구
- 이들 바이러스 중에는 최근 한국에서도 많은 집단식중독 사고를 일으키고 있는 노로바이러스나 수구족병이나 뇌수막염을 일으키는 콕사키바이러스 등의 고 위험성 바이러스들도 포함되어 있다. 그러므로 광범위한 물재이용을 위해서는 하수/폐수처리 과정, 특히 병원성 바이러스 제거에 중요한 소독 과정에서 이들 병원성 바이러스들을 효과적으로 제거하고 또 그 제거된 정도를 검증하는 방법(지표미생물)의 개발이 시급하다 할 것이다.
- 이 연구에서는 최근에 바이러스 지표미생물로 새로이 관심을 받고 있는 박테리오파지 PRD1을 포함하여 이전 연구에서 병원성 바이러스의 지표 미생물로 제안된 박테리오파지들의 하수처리 과정의 대표적인 소독과정인 염소소독에 대한 저항성을 지리적으로 다른 여러 지역에서 채집한 2차 처리수에서 함께 측정하였다. 이 연구는 지금까지 병원성 바이러스의 지표 미생물로 제안된 대표적인 박테리오파지들을 동일한 조건에서 직접 비교하는 첫 번째 연구이며, 이 연구에서 도출된 결과는 물 재이용 과정의 가장 심각한 문제 중 하나인 병원성 바이러스에 대한 최적의 지표미생물을 개발하는데 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 생각된다.
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