[논문]심장사상충에 감염된 개의 혈액에서 심장사상충 유전자를 검출할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응 기법 개발

오인영; 김경태; 전진현; 신재호; 성호중

doi:10.15324/kjcls.2016.48.2.88

심장사상충에 감염된 개의 혈액에서 심장사상충 유전자를 검출할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응 기법 개발
Development of Real-time PCR Assays for Detection of Dirofilaria immitis from Infected Dog Blood 원문보기

Korean journal of clinical laboratory science : KJCLS = 대한임상검사과학회지, v.48 no.2, 2016년, pp.88 - 93

오인영 (을지대학교 임상병리학과) , 김경태 ((주)알파젠) , 전진현 (을지대학교 임상병리학과) , 신재호 (을지대학교 임상병리학과) , 성호중 (을지대학교 임상병리학과)

초록
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선형 사상충의 일종인 심장사상충은 개의 심폐 사상충증을 유발한다. 이에 본 연구의 목적은 심장사상충을 효과적으로 검출할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응 기법을 개발함에 있다. 연구에 있어서 사용된 프라이머 및 프로브는 선행연구에서 제작된 심장사상충 특이 프라이머 및 새롭게 제작된 TaqMan 프로브를 이용하였다. 선행연구에서 제작된 프라이머 및 농도별로 희석된 게놈유전자와 플라스미드유전자가 SYBR Green 실시간 중합효소연쇄반응 수행에 이용되었으며, 중합효소연쇄반응 과정 중 증폭 이후의 녹는 곡선의 결과를 분석하였다. 분석결과 사용된 프라이머는 각각 게놈유전자 및 플라스미드 유전자에서 특이 녹는 곡선을 나타냄에 따라 심장사상충 특이 사이토크롬 C 산화효소 유전자만을 증폭하고 있음을 확인 할 수 있었다. 새롭게 제작된 TaqMan 프로브는 SYBR Green 실시간 중합효소연쇄반응과의 결과를 농도별로 희석된 플라스미드 유전자를 이용하여 비교 분석하였고, 분석결과 TaqMan 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응이 검출효율 및 특이도에 있어서 우수함을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 개발한 실시간 중합효소연쇄반응은 기존의 전통적인 진단기법의 한계를 극복할 수 있는 신속하고 정확한 향상된 진단기법을 제시한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Dirofilaria immitis is a filarial nematode parasite that causes cardiopulmonary dirofilariasis in dogs. The purpose of this study was the development of real-time PCR assays for efficient detection of D. immitis. The D. immitis-specific primers confirmed in our previous study and a newly designed TaqMan probe were used for quantitative diagnostics. First, SYBR Green real-time PCR was performed using the specific primers and serially diluted genomic DNA or plasmid DNA, and melting curve analyses were performed after amplification. The melting curve showed one specific peak in each of the genomic and plasmid DNA reactions, suggesting that the primers specifically amplify the D. immitis cytochrome c oxidase subunit I gene. Comparison of SYBR Green and TaqMan real-time PCR using serially diluted plasmid DNA showed higher efficiency and specificity with TaqMan real-time PCR. The real-time PCR assays developed in this study will provide improved diagnostic methods to overcome the limitations of conventional diagnostic tools and facilitate more rapid and accurate diagnoses.

주제어

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문제 정의

This study aimed to develop quantitative PCR methods for detecting D. immitis. In our previous study, we designed primers targeting a D.
새롭게 제작된 TaqMan 프로브는 SYBR Green 실시간 중합효소연쇄반응과의 결과를 농도별로 희석된 플라스미드 유전자를 이용하여 비교 분석하였고, 분석결과 TaqMan 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응이 검출효율 및 특이도에 있어서 우수함을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 개발한 실시간 중합효소연쇄반응은 기존의 전통적인 진단기법의 한계를 극복할 수 있는 신속하고 정확한 향상된 진단기법을 제시한다.
선형 사상충의 일종인 심장사상충은 개의 심폐 사상충증을 유발한다. 이에 본 연구의 목적은 심장사상충을 효과적으로 검출할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응 기법을 개발함에 있다. 연구에 있어서 사용된 프라이머 및 프로브는 선행연구에서 제작된 심장사상충 특이 프라이머 및 새롭게 제작된 TaqMan 프로브를 이용하였다.

제안 방법

In this study, to confirm primer specificity, we performed melting curve analyses after amplification in the SYBR Green real-time PCR assays. DNA samples were serially diluted as follows: pDNA was 10-fold serially diluted from 5×10⁷ copies to 50 copies, and gDNA was twofold serially diluted from 12.
immitis-specific region of COI based on multiple sequence alignment of seven filarial COI genes. Primer specificities were evaluated by end-point PCR experiments and sequencing.
Researchers developed methods to differentiate filarial nematodes using high resolution melt (HRM) real-time qPCR which were performed PCR amplification and then melting curve analysis which showed different melting peaks among filarial nematodes. However, those developed methods could be used for only detection and differentiation [10,24].
TaqMan real-time PCR was performed with D. immitis COI primers and TaqMan probe (5'-/56-FAM/TGC TTT ATC /ZEN/TTT TTG GAT TAC TTT TGT TGC GTT GTT GAT GG/3IABkFQ/-3').
Genomic DNA (gDNA) from blood samples collected in EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) tubes was extracted using the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer’s protocol. The concentration of gDNA was determined with a NanoDrop spectrophotometer (ThermoFisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA), and twofold serial dilutions were prepared for analysis.
To determine the detection limit, SYBR Green and TaqMan real-time PCR assays were performed with serially diluted pDNA, from 5×108 to 50 and 25 copies.
연구에 있어서 사용된 프라이머 및 프로브는 선행연구에서 제작된 심장사상충 특이 프라이머 및 새롭게 제작된 TaqMan 프로브를 이용하였다. 선행연구에서 제작된 프라이머 및 농도별로 희석된 게놈유전자와 플라스미드유전자가 SYBR Green 실시간 중합효소연쇄반응 수행에 이용되었으며, 중합효소연쇄반응 과정 중 증폭 이후의 녹는 곡선의 결과를 분석하였다. 분석결과 사용된 프라이머는 각각 게놈유전자및 플라스미드 유전자에서 특이 녹는 곡선을 나타냄에 따라 심장사상충 특이 사이토크롬 C 산화효소 유전자만을 증폭하고 있음을 확인 할 수 있었다.

대상 데이터

instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in 20 μL total volume. All analyses were performed in triplicate. Three samples without DNA template were routinely included as a no-template control.
The PCR mixture was prepared with 1× SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 500 nM primers, and serially diluted pDNA or gDNA.
immitis-infected blood samples isolated from random infected source dogs were gifted from Seoul National University. The peripheral blood samples were from 51 blood donation dogs, Beagle species, and were collected in July 2015 in the Republic of Korea. Genomic DNA (gDNA) from blood samples collected in EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) tubes was extracted using the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer’s protocol.

이론/모형

이에 본 연구의 목적은 심장사상충을 효과적으로 검출할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응 기법을 개발함에 있다. 연구에 있어서 사용된 프라이머 및 프로브는 선행연구에서 제작된 심장사상충 특이 프라이머 및 새롭게 제작된 TaqMan 프로브를 이용하였다. 선행연구에서 제작된 프라이머 및 농도별로 희석된 게놈유전자와 플라스미드유전자가 SYBR Green 실시간 중합효소연쇄반응 수행에 이용되었으며, 중합효소연쇄반응 과정 중 증폭 이후의 녹는 곡선의 결과를 분석하였다.

성능/효과

1. Ct values were analyzed by linear regression analysis and showed good linearity (pDNA: R² value, 0.9998; slope, -3.464; PCR efficiency, 94% and gDNA: R² value, 0.9984; slope, -0.9684; PCR efficiency, 104%). The gDNA melting curves matched those of pDNA with one specific peak at a melting temperature of 76.
immitis COI pDNA was 10-fold serially diluted from 5×10⁷ copies to 5×10² copies the template for SYBR Green and TaqMan real-time PCR assays. Ct values were analyzed by linear regression analysis, and the results showed good linearity (SYBR Green real-time PCR: R² value, 0.9998; slope, -3.4213; PCR efficiency, 96% and TaqMan real-time PCR: R² value, 0.9999; slope, -3.4624; PCR efficiency, 94%) (Fig. 2).
In this study, the SYBR Green real-time PCR assay using primers targeting D. immitis COI showed high PCR efficiency, specificity, and sensitivity. The Ct values of gDNA (12.
immitis COI between the forward and reverse primers. The results from TaqMan real-time PCR showed efficiency similar to SYBR Green real-time PCR with high specificity and sensitivity. The detection limit was 25 copies for both assays.
선행연구에서 제작된 프라이머 및 농도별로 희석된 게놈유전자와 플라스미드유전자가 SYBR Green 실시간 중합효소연쇄반응 수행에 이용되었으며, 중합효소연쇄반응 과정 중 증폭 이후의 녹는 곡선의 결과를 분석하였다. 분석결과 사용된 프라이머는 각각 게놈유전자및 플라스미드 유전자에서 특이 녹는 곡선을 나타냄에 따라 심장사상충 특이 사이토크롬 C 산화효소 유전자만을 증폭하고 있음을 확인 할 수 있었다. 새롭게 제작된 TaqMan 프로브는 SYBR Green 실시간 중합효소연쇄반응과의 결과를 농도별로 희석된 플라스미드 유전자를 이용하여 비교 분석하였고, 분석결과 TaqMan 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응이 검출효율 및 특이도에 있어서 우수함을 확인할 수 있었다.
분석결과 사용된 프라이머는 각각 게놈유전자및 플라스미드 유전자에서 특이 녹는 곡선을 나타냄에 따라 심장사상충 특이 사이토크롬 C 산화효소 유전자만을 증폭하고 있음을 확인 할 수 있었다. 새롭게 제작된 TaqMan 프로브는 SYBR Green 실시간 중합효소연쇄반응과의 결과를 농도별로 희석된 플라스미드 유전자를 이용하여 비교 분석하였고, 분석결과 TaqMan 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응이 검출효율 및 특이도에 있어서 우수함을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 개발한 실시간 중합효소연쇄반응은 기존의 전통적인 진단기법의 한계를 극복할 수 있는 신속하고 정확한 향상된 진단기법을 제시한다.

후속연구

However, end-point PCR only allows determination of whether a sample is infected. For more precise therapeutic monitoring, therefore, additional development of a method for quantitative analysis is needed.

참고문헌 (24)

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Liu CM, Kachur S, Dwan MG, Abraham AG, Aziz M, Hsueh PR, et al. FungiQuant: a broad-coverage fungal quantitative real-time PCR assay. BMC Microbiol. 2012;12:255.

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Latrofa MS, Montarsi F, Ciocchetta S, Annoscia G, Gantas-Torres F, Ravaqnan S, et al. Molecular xenomonitoring of Dirofilaria immitis and Dirofilaria repens in mosquitoes from north-eastern Italy by real-time PCR coupled with melting curve analysis. Parasite Vectors. 2012;5:76.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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