[논문]식물체에 감염성 질병을 유발하는 바이로이드 검출 및 진단 방법

이세희; 김양훈; 안지영

doi:10.5352/jls.2016.26.5.620

식물체에 감염성 질병을 유발하는 바이로이드 검출 및 진단 방법
The Detection and Diagnosis Methods of Infectious Viroids caused Plant Diseases 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.26 no.5 = no.193, 2016년, pp.620 - 631

이세희 (충북대학교 자연과학대학 미생물학과) , 김양훈 (충북대학교 자연과학대학 미생물학과) , 안지영 (충북대학교 자연과학대학 미생물학과)

초록
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바이로이드는 매우 작은 RNA 분자로 구성되어 있으며, 외피 단백질이 없고 오로지 식물에만 감염되어 질병을 유발한다. 바이로이드 감염 질병을 예방하거나 진단하는 것은 상당히 어려운 일이며, 이는 병징이 초기에는 발견되지 않고 수확기에 접어들어서 발견되기 때문이다. 한편, 혈청학적인 방법은 식물 병원체를 검출하기 위해 주로 사용되었으나 바이로이드는 핵산인 RNA로만 구성되어 있기 때문에 이 방법으로 검출할 수가 없다. 때문에 바이로이드를 검출하기 위해 주로 사용되는 방법은 분자 생물학적인 방법으로, 초기에는 바이로이드의 분자적인 크기와 구조적 특징을 이용한 겔 전기 영동 방법이 주로 사용되었다. 그 후에는 역전사 반응과 중합효소 연쇄반응을 접목시킨 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 방법이 활용되었고, 그에 대한 효율적인 결과 확인을 위해 형광 물질을 도입한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR)이 도입되었다. 그러나 그들은 온도를 변화시키기 위한 값비싼 기기와 전문적인 인력이 필요함으로 현장에서는 활용되기가 어렵다. 최근 개발된 고리 기반의 등온 증폭법(Loop-mediated isothermal amplification)의 경우, 온도의 변화가 필요 없어 비싼 온도 조절 기기가 필요하지 않다. 또한 매우 높은 증폭 효율을 지니며 반응 시간이 짧은 등의 여러 장점을 지니고 있기에 최근 현장 진단용 기술에 도입되고 있다. 이러한 배경으로, 이 총설에서는 바이로이드 유발 질병에 대하여 요약하고 그에 대한 검출 및 진단 방법에 대한 연구 동향에 대하여 기술하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Viroids are about 250-400 base pair of short single strand RNA fragments have been associated with economically important plant diseases. Due to the lack of protein expression capacity associated with replication, it is very difficult to diagnosis viroid diseases in serological methods. For detecting viroid at plants, molecular-based techniques such as agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), DNA-hybridization, blotting analysis and conventional RT-PCR are reliable. Real-time RT-PCR methods that grafted on RT-PCR methods with improved confirmation methods have been also utilized. However, they are still labor-intensive, time-consuming, and require personnel with expertise. Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) method is a nucleic acid amplification method under the isothermal condition. The LAMP methodology has been reported to be simple, rapid, sensitive and field applicable in detecting a variety of pathogens. The results of LAMP method can be colorized by adding a visible material such as SYBR green I, Evagreen, Calcein, Berberine and Hydroxy naphthol blue (HNB) with simple equipment or naked eyes. The combination of LAMP method and nucleic pathogens, viroids, can be used to realize simple diagnosis platform for the genetic point-of care testing system. The aim at this review is to summary viroid-caused diseases and the simple visible approach for diagnosing viroids using Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) method.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이러한 배경으로, 이 총설에서는 개괄적인 바이로이드와 그와 관련된 질병 및 병징에 대하여 살펴본 후, 기존부터 최신까지 사용되고 있는 검출.진단 방법과 관련된 연구동향을 정리하고자 한다.

제안 방법

왔다[27, 47]. 그러나 이는 단순히 식물체에서 추출한 RNA를 폴리아크릴아마이드 겔 등의 겔을 이용하여 전기 영동 후, 기존에 존재하는 바이로이드의 패턴과 비교를 통하여 결과를 분석하였다. 이러한 방법에는 부차적인 물질의 존재 가능성에 의해 겔 상에 나타난 밴드가 정확히 바이 로이드를 나타내는 것인지 확신하기가 어려웠고, 시료 속 바이 로이드의 양이 매우 미량일 경우 검출이 불가하다는 단점이 있었다.
원리는 Fig. 3에 표현된 것처럼 온도의 변화에 따른 것으로 90C 이상의 온도에서 주형이 변성되어 두 가닥 사이가 벌어지고, 온도가 점차 낮아지면서 primer 쌍이 결합하여 다시 온도가 상승하며 신장이 이루어지는 과정이 포함된다. 상기와 같은 과정으로 미량의 주형 가닥이 증폭되고 이를 겔 기반전기 영동 방법 등의 방법으로 확인하는 것으로 바이로이드를 검출할 수 있다.
그러나 아직 바이로이드 질병의 심각성이 널리 인지되지 않고 바이로이드 질병과 바이러스 질병의 구분이 확실하게 인식되어 있지 않는 등의 바이로이드 질병에 대한 연구가 미비한 실정이다. 이러한 배경으로, 이 총설에서는 개괄적인 바이로이드와 그와 관련된 질병 및 병징에 대하여 살펴본 후, 기존부터 최신까지 사용되고 있는 검출.진단 방법과 관련된 연구동향을 정리하고자 한다.
이러한 방법에는 부차적인 물질의 존재 가능성에 의해 겔 상에 나타난 밴드가 정확히 바이 로이드를 나타내는 것인지 확신하기가 어려웠고, 시료 속 바이 로이드의 양이 매우 미량일 경우 검출이 불가하다는 단점이 있었다. 전자의 문제를 해결하기 위한 방안으로 도입된 것이 특이적 올리고 프로브를 활용한 blotting 과정[18, 43, 56]이며, 바이로이드에 특이적인 올리고 프로브를 고체 기판에 고정하여 그 위로 식물체에서 추출한 RNA를 흘려주는 것으로, 바이로이드 서열과 상보적인 혼성화 과정에 기반하여 검출을 수행하였다. 하지만 이 또한 시료 속 바이로이드의 양이 매우 미량일 경우 검출이 불가하다는 한계가 여전히 존재한다.

성능/효과

Table 2에서도 나타나 있는 것처럼, 결과 확인을 위해 사용될 수 있는 여러 물질들 중에서도 Calcein과 Hydroxynaphthol blue (HNB)이 현장 진단용으로써 가장 높은 활용도를 보였다. 그러나 그 중 Calcein의 경우, 사용자의 피부와 눈에 독성을 나타내며 현장에서 활용하기 위해 따로 형광을 측정하기 위한 기기가 필요하다.
그러나 그 중 Calcein의 경우, 사용자의 피부와 눈에 독성을 나타내며 현장에서 활용하기 위해 따로 형광을 측정하기 위한 기기가 필요하다. 그러므로 관찰을 위한 부가적인 장비 없이 육안으로 결과를 확인할 수 있으며, 독성이 가장 약한 HNB가 현장 진단용으로 사용되기에 가장 적합하다고 사료된다.
국내에서 안 등에 의해서 수행된 salmonella spp.의 검출 관련 연구에서는 일반적인 PCR 증폭과 실시간 PCR 증폭 방법과lAMP 결과를 비교하였으며, 일반적인 PCR 증폭 방법보다 lAMP 방법의 검출 능력이 더 높으며, 실시간 PCR 증폭 방법과는 비슷한 양상을 보임을 검증하였다[2]. 그 밖에도 다양한 주형에 대하여 LAMP 방법의 효율이 검증되었다[35, 69, 81].

후속연구

LAMP 방법은 아직 현장 진단용으로 활용되기에는 여러가지 해결할 점이 존재한다. 그러나 상기 서술된 한계점이 극복된다면 LAMP 방법은 바이로이드 진단 방법에서 가장 큰 효용성을 가질 것이며 이와 같은 현장 진단용 방법의 개발로 인하여 단기적으로 농가 경제적 손실을 최소화할 뿐 아니라, 장기적으로 선진형 무병묘목 선발, 국가 주요 종자 관리 및 외래 병종 유입에 대한 관리에서도 주요한 작용을 할 것이라고 사료된다.

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Zhang, G., Brown, E. W. and Gonzalez-Escalona, N. 2011. Comparison of real-time PCR, reverse transcriptase realtime PCR, loop-mediated isothermal amplification, and the FDA conventional microbiological method for the detection of Salmonella spp. in produce. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6495-6501.

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Zhu, L., Shen, D., Zhou, Q., Li, Z., Fang, X. and Li, Q. Z. 2015. A locked nucleic acid (LNA)-based real-time PCR assay for the rapid detection of multiple bacterial antibiotic resistance genes directly from positive blood culture. PLoS One 10, e0120464.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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