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문제 정의
- 한약처방이 임상에서 당뇨병에 효과가 있더라도 정확하게 어떤 기전으로 효과가 나타나는지에 대한 과학적 입증이 쉽지않아 문헌에 근거한 효능만을 설명할 뿐 객관적 근거를 제시하지 못하는 경우가 대부분이었다. 따라서 저자는 임상경험상 효과를 보이는 가감생혈윤부음이 어떠한 기전에 의해 당뇨병을 치료할 수 있는지 확인할 필요가 있었고, 처방 각각 약제의 화학적 분석과 개개 약물의 처방효과발현에 대한 약리기전 분석을 통해 치료 기여도와 과학적인 효능입증을 함으로써 한약에 대한 신뢰도를 향상시키고자 하는 목적으로 본 연구를 수행하였고, 다음과 같은 결과들을 도출하였다.
- 이어서 생약별 유효물질들을 포함한 각 추출물에 대하여 몇 가지 지표(DGAT-1, GPR-119)에 대한 in vitro 실험을 수행하였다. 이후 가감생혈윤부음의 in vivo 실험으로 c57bl/6 mice에 경구 포도당 부하시험(Oral glucose tolerance test, 이하 OGTT)을 수행하여 당뇨치료 효과에 대한 의미있는 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- •가감생혈윤부음의 당뇨치료에 대한 in vivo 효력 비교실험은 동물실험으로 쥐를 이용하였으며 경구 포도당부하시험(Oral glucose tolerance test, OGTT)을 아래의 실험 프로토콜을 설정하여 실시하였다.
- •가감생혈윤부음의 약리시험에 영향을 줄 수 있는 물질의 존재와 양을 판단하기 위하여 아래 Table 4과 같은 국립농산물품질관리원에 등재되어 있는 농약 245종에 대한 함량시험을 식품의약품안전처고시를 참조하여, 순천향대학교 고부가생물소재산업화지원 지역혁신센터의 도움을 얻어 다음과 같은 방법과 시료 전처리 후 GC 및 HPLC를 사용하여 분석하였다.
- 본 처방은 『東醫寶鑑』6)의 생혈윤부음을 근간으로 저자의 임상경험에 따라 당뇨병에 치료효과가 있는 약재를 가감하여 장복을 위해 환제로 처방하며, 가감생혈윤부음(加減 生血潤膚飮, Add-Omit-Saenghyeoryunbu-eum, AO-SHU)으로 명명하였고 전체 조성은 Table 1과 같다. 약재들은 울산한 약품(한국)에서 규격품을 구입, 정선하여 각 생약별로 분쇄기를 사용하여 분말(100mesh, 약 0.
- 이에 저자는 화학적 분석에 따른 효과를 입증할 목적으로 가감생혈윤부음을 구성하는 각 생약성분들을 문헌고찰8-24)하고 당뇨치료 약리물질의 표준품을 대조물질로 하여 HPLC-MS/MS을 통해 당뇨병 치료에 유용한 성분들에 대한 정성 및 정량분석을 실시하였으며, 잔류농약 시험을 추가로 실시하였다. 이어서 생약별 유효물질들을 포함한 각 추출물에 대하여 몇 가지 지표(DGAT-1, GPR-119)에 대한 in vitro 실험을 수행하였다. 이후 가감생혈윤부음의 in vivo 실험으로 c57bl/6 mice에 경구 포도당 부하시험(Oral glucose tolerance test, 이하 OGTT)을 수행하여 당뇨치료 효과에 대한 의미있는 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 화학적 분석에 따른 효과를 입증할 목적으로 가감생혈윤부음을 구성하는 각 생약성분들을 문헌고찰8-24)하고 당뇨치료 약리물질의 표준품을 대조물질로 하여 HPLC-MS/MS을 통해 당뇨병 치료에 유용한 성분들에 대한 정성 및 정량분석을 실시하였으며, 잔류농약 시험을 추가로 실시하였다. 이어서 생약별 유효물질들을 포함한 각 추출물에 대하여 몇 가지 지표(DGAT-1, GPR-119)에 대한 in vitro 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 생약 표준품으로 사용한 물질인 Citrullin, Cucurbitacin E, Bryonolic acid, Catalpol, Loganin(Iridoid glycoside), Conjugated linoleic acid(CLA), Sesamin, Kaempferol, Berberine chloride, Ginsenoside Rb1, Ginsenoside Rg1, Oleanolic acid, β-Sitosterol, Ferulic acid, Betulinic acid, Mangiferin, Schizandrin, Tolbutamide는 Sigma-Aldrich 및 Fluka사 한국지사에서 구입하였고, 세포 및 동물실험용 대조약물인 GSK263은 ChemieTek(영국)에 합성 주문하여 구입하였다. 실험동물인 C57BL/6(standard abbreviation: B6) mice는 9-11주령의 수컷으로 군당 5마리씩 나누었으며 순천향대학교 IACUC 규정을 준수하여 다물사이언스(한국)에서 구입하여 사용하였고, 실험실동물의 관리와 사용에 대해서는 NIH 가이드라인에 따라 시행되었다.
- 생약 표준품으로 사용한 물질인 Citrullin, Cucurbitacin E, Bryonolic acid, Catalpol, Loganin(Iridoid glycoside), Conjugated linoleic acid(CLA), Sesamin, Kaempferol, Berberine chloride, Ginsenoside Rb1, Ginsenoside Rg1, Oleanolic acid, β-Sitosterol, Ferulic acid, Betulinic acid, Mangiferin, Schizandrin, Tolbutamide는 Sigma-Aldrich 및 Fluka사 한국지사에서 구입하였고, 세포 및 동물실험용 대조약물인 GSK263은 ChemieTek(영국)에 합성 주문하여 구입하였다. 실험동물인 C57BL/6(standard abbreviation: B6) mice는 9-11주령의 수컷으로 군당 5마리씩 나누었으며 순천향대학교 IACUC 규정을 준수하여 다물사이언스(한국)에서 구입하여 사용하였고, 실험실동물의 관리와 사용에 대해서는 NIH 가이드라인에 따라 시행되었다.
- 본 처방은 『東醫寶鑑』6)의 생혈윤부음을 근간으로 저자의 임상경험에 따라 당뇨병에 치료효과가 있는 약재를 가감하여 장복을 위해 환제로 처방하며, 가감생혈윤부음(加減 生血潤膚飮, Add-Omit-Saenghyeoryunbu-eum, AO-SHU)으로 명명하였고 전체 조성은 Table 1과 같다. 약재들은 울산한 약품(한국)에서 규격품을 구입, 정선하여 각 생약별로 분쇄기를 사용하여 분말(100mesh, 약 0.245mm)로 하고 분량대로 잘 섞어서 찹쌀풀로 직경 5mm의 환으로 제환 후 건조기를 이용하여 50℃에서 12시간 건조하여 완성하였다.
성능/효과
- 4) 농축 : GC분석용 시료는 상등액 10 mL를 취한 후 N2 gas로 미세농축 후 아세톤:헥산 (20:80 v/v) 1 mL로 재용해하여 사용하고, HPLC 분석용 시료는 상등액 10 mL를 취한 후 N2 gas로 미세농축 후 methylene chloride 2 mL로 재용해하여 사용하였다.
- 추출용매 및 시간에 따른 가감생혈윤부음의 생리 활성 성분분석을 위하여 아래의 Table 2에서와 같이 분말 형태로 하여 각 시간동안 침적한 후 여과 직전에 진탕기(sonicator)로 30분간 진탕하고, 0.2 ㎛ 마이크로 필터로 여과한 후, rotary evaporator로 감압 농축하여 시료를 준비하였다. 추출물은 −20℃에 보관하였다가 분석실험 직전 메탄올에 녹여 사용하였다.
- •Glucose-Dependent Insulinotropic Receptor (GDIR, GPR119) Agonists는 현재까지 약으로 시판되는 것이 없는 타깃 약물이며 세포외부의 신호 물질(hormones, neurotransmitters 등)에 반응하여 신호전달을 일으키는 단백질로써 transmembrane receptor이다. 특히 GPCR 계열 receptor 중 에너지 대사와 관련된 단백질은 cannnabinoid receptor, melanocortin-4 receptor, melanin-concentrating hormone receptor, beta-3 Adrenergic receptor, GPR35, GPR55, GPR119 등이 있음. GPCR의 일종인 orphan receptor GPR119는 pancreas, gastrointestinal tract, rodent brain에 많이 발현되어 있으며, 당뇨 및 비만치료제 target26)으로 밝혀져 있다.
- 가감생혈윤부음 구성 한약재 12종 각각의 생약에 함유되어 있는 알려진 항당뇨 성분을 검사하기 위해 Citruline, Cucurbitacin E, Bryonolic acid, Catalpol, Loganin(Iridoid glycoside), Conjugated linoleic acid (CLA), Sesamin, Kaempferol, Berberine chloride, Ginsenoside Rb1, Ginsenoside Rg1, Oleanolic acid, β-Sitosterol, Ferulic acid, Betulinic acid, Mangiferin, Schizandrin 및 Tolbutamide 등 18가지 지표성분에 대한 복방 및 각 생약별로 메탄올 용매추출을 하여 LC-Ms/Ms로 함량 분석한 결과, 문헌조사로부터 설정된 지표물질 중 Oleanolic acid, Berberine, Citruline, β-Sitosterol, Catalpol, Schizandrin, Mangiferin, Ginsenoside Rb1 및 Ginsenoside Rg1 등의 순으로 9가지 성분이 검출되었으며, 나머지는 검출되지 않았다. 검출되지 않은 성분들은 추출용매에 따른 미추출 또는 기원에 따른 성분 미포함으로 보인다.
- 3. 가감생혈윤부음 제환분말의 MeOH 추출물(AO-SHU-2)을 사용한 경구포도당부하 실험결과는 포도당의 농도 및 AUC(area under the curve, 곡선하 면적) 측면에서도 제환분말 자체(AO-SHU-1)를 실험한 것보다는 상대적으로 포도당 분해에 더 효과적임을 알 수 있었다.
- 1. 가감생혈윤부음을 구성하는 생약들에 대한 문헌 조사로부터 당뇨치료 효과를 기대하는 지표성분들에 대한 LC-Ms/Ms 분석 결과, 가감생혈윤부음 그램당 밀리그램으로 Oleanolic acid, Berberine, Citruline, β-Sitosterol, Catalpol, Schizandrin, Mangiferin, Ginsenoside Rb1 및 Ginsenoside Rg1 등의 함량 순으로 9가지의 성분이 검출되었으며, 그 중에서 Oleanolic acid의 함량이 가장 높게 측정되었다.
- 가감생혈윤부음의 잔류농약시험결과 기준치 이상의 농약은 검출되지 않았으며, 당뇨 타깃인 GPR119 및 DGAT-1에 대한 in vitro assay 결과, GPR119 agonist로서의 활성도는 1uM 농도에서 모두 50% 이하로 조사되어 유효농도 (EC50)를 구하지는 못하였으나, 어느 정도의 활성을 보이는 것으로 나타났으며, DGAT-1 저해제로서의 활성도는 물질의 구조 특성상 타깃에 활성을 보이지 않았다.
후속연구
- 또한 한약 및 침구요법 이외에도 정신, 식이, 운동요법 등 환자가 직접 시행해야 하는 것도 관리 차원에서 매우 중요하며, 이러한 관리법은 사실상 한의학적 양생요법의 일부인 만큼 한의학을 활용한 당뇨병 치료는 충분한 경쟁력을 갖추고 있다5,8). 따라서 순수 한의학적 당뇨치료는 물론이고 한의학적 관을 응용한 현대 의료기기 활용방안이 포함된 한양방 협진을 통해서 새로운 치료기술의 창출이 국민건강 증진에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
- 아울러 본 연구는 산업화와 인구증가에 따라 전 세계적으로 급증하고 있는 당뇨질환 인구와 그로 인한 대사성 질환의 발병률은 심각한 보건문제를 근본적으로 해소하고, 노령사회로의 진입 및 늘어나는 비만인구 (전체 미국성인들의 34% 가량)로 인해 2형 당뇨병이나 대사성 만성질환증후군 등이 발생할 위험성을 우려하는 목소리가 고조되고 있는 상황에서 한의서의 처방들이 과학적이고 객관적으로 검증될 수 있는 기초 자료로 활용을 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
- 이와 같이 약리작용을 가지는 MeOH 추출물에서 분석되어진 9가지의 성분의 복합작용으로 충분한 혈당강하 효과를 기대할 수 있으며, 당뇨병의 경험방인 가감생혈윤부음에 대한 개별 약제의 화학적 분석을 통한 당뇨의 치료에 어떤 기전의 약리작용으로 효과를 발현하는지 밝히고 각 약물의 기여도에 대해 객관적 근거를 가지고 처방의 효능을 설명하는데 응용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 이는 반복적인 섭취로 인하여 처방에 포함된 약리물질의 함량이 증가하여 생기는 효과로 장기간의 투여로 인해 여러 가지의 약리성분의 혈당강하에 대한 단일 효과와 더불어 여러 성분의 상승효과(synergic effect)가 작용하여 가감생혈윤부음이 당뇨병의 예방 및 치료에 대한 효과를 충분히 기대할 수 있으리라 보인다. 향후 이러한 실험적인 효과를 바탕으로 임상시험이 필요하며 이를 통해 혈당강하를 포함한 당뇨치료의 효과가 입증될 수 있을 것으로 생각된다.
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