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문제 정의
- 또한, STZ로 유도한 당뇨 쥐에서 황칠나무 분획물이 항당뇨 효과를 보이는 것으로 보고된 바 있다(13). 따라서 본 연구는 한국의 서남해안에서 자생하는 천연자원인 황칠나무 잎을 이용하여 STZ의 복강투여에 의해 당뇨가 유발된 기억력 감퇴 실험 동물모델에서의 당뇨병의 여러 인자들이 인지기능 개선효과에 미치는 영향을 탐색하고자 하였다.
- 본 연구는 스트렙토조토신에 의해 당뇨가 유발된 기억력 감퇴 모델에서 황칠나무 잎 열수추출물(DMW)의 학습 및 기억력 개선 효과를 평가하기 위해 수행되어졌다. 6주령의 SD-래트를 총 5개 군으로 분리 하였고, 11주간 24시간 간격으로 DMW를 100과 300 mg/kg b.
제안 방법
- 도피대를 찾으면 그로부터 20초간 그 위에 머무르게 하고, 45초 안에 도피대를 찾지 못하면 실험자가 손으로 동물을 도피대까지 유도 하여 20초간 머물도록 하였다. 20초간의 위치 학습이 끝나면 바로 임의의 분면에서 동물을 출발시켜 도피대 까지 찾아가는 시간과 이동거리를 측정하였다. 도피대를 찾아 올라가면, 20초의 시간을 주고 연속적으로 하루에 총 3번, 3일 동안을 시행하였다.
- , Barcelona, Spain) 으로 분석 하였다. 3일간의 실험이 끝나면 24시간 후인 4일 째에, probe trial을 시행하였다. 도피대 없이 90초 동안 자유 수영을 하게 하여 이전 도피대의 위치에 대한 기억을 보유하고 있는지에 대한 검사를 실시하였다.
- 본 연구는 스트렙토조토신에 의해 당뇨가 유발된 기억력 감퇴 모델에서 황칠나무 잎 열수추출물(DMW)의 학습 및 기억력 개선 효과를 평가하기 위해 수행되어졌다. 6주령의 SD-래트를 총 5개 군으로 분리 하였고, 11주간 24시간 간격으로 DMW를 100과 300 mg/kg b.w.농도로 경구 투여 하였으며, 양성대조군으로 donepezil (1 mg/kg b.w.)을 처리하였다. 7일 간격으로 체중과 혈당을 측정하였으며 STZ군에 비해 DMW군에서 유의한 체중 증가를 확인 할 수 있었다.
- 5 mA, 50 Hz)을 이용하여 혐오자극을 주어 공포학습을 시킨다(15). 8시간 후, 밝은 빛의 chamber에 실험동물을 두었을 때, 어두운 암소의 chamber에 들어갈 때까지의 시간을 측정하여 이를 수치화하였다.
- 96-well plate에 뇌 조직 균질물 50를 취하여 1% 하이드록실아민(Sigma-Aldrich) 50 μL를 첨가, 혼합한 후 염산을 이용하여 pH를 1.2±0.2로 조절하여 염화철(III)(10% in 0.1 N 염산)을 500 μL 첨가한 후 혼합하고 530 nm에서 흡광도를 측정하여 Ach (ng/mg protein)을 측정하였다.
- 황칠나무 잎은 대한민국 전라남도 장흥에서 채취 하였으며, 건물 대비 20배의 물을 첨가하여 100℃에서 4시간 환류 추출하였다. 그리고 수득한 추출물을 여과 후, 감압농축 하여 동결건조를 실시하여 최종 추출물을 수득하였다. 본 실험에 사용한 시약으로 STZ, 아세틸콜린, 하이드록실아민(hydroxylamine), 다이나이트로벤조산(dithionitrobenzoic acid)의 경우 Sigma-Aldrich (St.
- 3일간의 실험이 끝나면 24시간 후인 4일 째에, probe trial을 시행하였다. 도피대 없이 90초 동안 자유 수영을 하게 하여 이전 도피대의 위치에 대한 기억을 보유하고 있는지에 대한 검사를 실시하였다.
- 20초간의 위치 학습이 끝나면 바로 임의의 분면에서 동물을 출발시켜 도피대 까지 찾아가는 시간과 이동거리를 측정하였다. 도피대를 찾아 올라가면, 20초의 시간을 주고 연속적으로 하루에 총 3번, 3일 동안을 시행하였다. 모든 데이터는 pool위에 설치된 카메라로 촬영되어, video tracking system (Panlab S.
- 본 실험에 들어가 도피대가 놓인 사분면을 제외한 3곳 중 2곳에서 임의의 순서로 동물을 출발시켜 60초간 도피대를 찾도록 하였다. 도피대를 찾으면 그로부터 20초간 그 위에 머무르게 하고, 45초 안에 도피대를 찾지 못하면 실험자가 손으로 동물을 도피대까지 유도 하여 20초간 머물도록 하였다. 20초간의 위치 학습이 끝나면 바로 임의의 분면에서 동물을 출발시켜 도피대 까지 찾아가는 시간과 이동거리를 측정하였다.
- 도피대를 찾아 올라가면, 20초의 시간을 주고 연속적으로 하루에 총 3번, 3일 동안을 시행하였다. 모든 데이터는 pool위에 설치된 카메라로 촬영되어, video tracking system (Panlab S.L.U., Barcelona, Spain) 으로 분석 하였다. 3일간의 실험이 끝나면 24시간 후인 4일 째에, probe trial을 시행하였다.
- 본 시험의 환경은 온도 22±3℃, 상대습도 50±5%, 환기횟수 10-15회/시간, 조명주기 1시간(8:00-20:00), 조도 150-300 Lux의 사육 환경으로 설정된 동물 사육실에서 사료와 음용수를 급여하여 사육하였으며, 적응 및 시험기간 동안 격리 사육을 실시하였다.
- 실험 2일전과 하루 전에 모든 실험군을 도피대가 없는 swimming pool 에서 1분간 자유롭게 수영하게 해, 수영하는 상황에 적응시켰다. 본 실험에 들어가 도피대가 놓인 사분면을 제외한 3곳 중 2곳에서 임의의 순서로 동물을 출발시켜 60초간 도피대를 찾도록 하였다. 도피대를 찾으면 그로부터 20초간 그 위에 머무르게 하고, 45초 안에 도피대를 찾지 못하면 실험자가 손으로 동물을 도피대까지 유도 하여 20초간 머물도록 하였다.
- 본 시험의 환경은 온도 22±3℃, 상대습도 50±5%, 환기횟수 10-15회/시간, 조명주기 1시간(8:00-20:00), 조도 150-300 Lux의 사육 환경으로 설정된 동물 사육실에서 사료와 음용수를 급여하여 사육하였으며, 적응 및 시험기간 동안 격리 사육을 실시하였다. 순화기간 중 이상이 발생한 개체와 정상적으로 체중이 증가하지 않은 개체를 제외한 후, 각 군간 평균 체중 및 표준편차가 균일하도록 군 분리를 실시하였다. 본 동물실험은 연구원 실험동물윤리위원회(전남천연자원연구원)의 승인(승인번호: 32-35)을 받아 수행하였다.
- 스트렙토조토신으로 유도된 당뇨모델에서 기억력 및 인지기능 감퇴에 대한 황칠나무 잎 추출물의 기억력 개선 효과를 측정하기 위해 Morris water maze task를 수행하였다(Fig. 1). Figure 1A는 water maze test의 반복일정으로서 총 3일 동안의 실험 중 학습이 진행되어 군간 가장 큰 차이를 나타내는 마지막 3일째의 trial을 표시하였다.
- DMW administration group). 스트렙토조토신을 0.1 M 시트르산소듐 완충 용액(sodium-citrate buffer) (pH 4.5)에 용해시킨 후, 체중 kg당 55 mg을 복강주사 하였고, 정상군에게도 동량의 0.1 M 시트르산소듐 완충용액을 투여하였다. 당뇨유발의 확인은 48시 간 후 공복혈당 수치가 300 mg/dL 이상인 동물을 실험에 사용하였다.
- 위치를 확인할 수 있게 벽의 4 면에 공간단서를 설치하고, 탈지분유를 물에 풀어 도피대를 육안으로 확인 할 수 없게 하였다. 실험 2일전과 하루 전에 모든 실험군을 도피대가 없는 swimming pool 에서 1분간 자유롭게 수영하게 해, 수영하는 상황에 적응시켰다. 본 실험에 들어가 도피대가 놓인 사분면을 제외한 3곳 중 2곳에서 임의의 순서로 동물을 출발시켜 60초간 도피대를 찾도록 하였다.
- 농도로 각각 전처리 경구투여 하였다. 실험 마지막 주에 water maze test와 행동평가를 실시하였고, 같은 방식으로 총 4일간 행동평가를 수행하였다. 모든 동물을 희생시킨 후 혈액을 채취하고 실온에서 20분간 방치하고 원심분리기에서 3,000 rpm, 15분 동안 회전시켜 상층부인 혈청을 분리하였다.
- 실험기간 동안 매주 1회 체중을 측정하였고 투여 0일째 체중을 초기(initial) 체중으로, 행동 평가 전날 체중을 마지막(final) 체중으로 하였다. 혈액의 수집은 매주 1회에 최소 12시간 이상 절식시킨 후 꼬리정맥으로부터 수집하였으며, 당 측정검사지(Accu-Check, Roche Diagnostics GmbH, Berlin, Germany)를 이용하여 혈당(blood glucose)을 측정하였다.
- 당뇨유발의 확인은 48시 간 후 공복혈당 수치가 300 mg/dL 이상인 동물을 실험에 사용하였다. 양성대조군으로는(donepezil 1 mg/kg b.w.)을 처리하였으며, 11주 동안 24시간 간격으로 DMW를 100와 300 mg/kg b.w. 농도로 각각 전처리 경구투여 하였다. 실험 마지막 주에 water maze test와 행동평가를 실시하였고, 같은 방식으로 총 4일간 행동평가를 수행하였다.
- 모든 동물을 희생시킨 후 혈액을 채취하고 실온에서 20분간 방치하고 원심분리기에서 3,000 rpm, 15분 동안 회전시켜 상층부인 혈청을 분리하였다. 해부를 통해 뇌 조직 내의 아세틸콜린(acethylcholine, Ach) 함량과 아세틸콜린에스터레이스(acethylcholine esterase, AchE)를 측정하였다.
- 실험기간 동안 매주 1회 체중을 측정하였고 투여 0일째 체중을 초기(initial) 체중으로, 행동 평가 전날 체중을 마지막(final) 체중으로 하였다. 혈액의 수집은 매주 1회에 최소 12시간 이상 절식시킨 후 꼬리정맥으로부터 수집하였으며, 당 측정검사지(Accu-Check, Roche Diagnostics GmbH, Berlin, Germany)를 이용하여 혈당(blood glucose)을 측정하였다.
- 혈청의 중성지방(Triglyceride, TG), 총콜레스테롤(Total-cholesterol, TC), blood urea nitrogen (BUN), creatine (CRE), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT), glutamic pyruvic transaminase (GPT)는 자동 혈액 분석기(FUGIFILM DRI-CHEM 4000i, Minatoku, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 인슐린 농도는 rat insulin kit (Linco Research, St Charles, MO, USA)로 enzyme-linked immunosorbent (ELISA, Boerhringer Mannheim, Mannheim, Germany)를 이용하여 측정하였다.
- 황칠나무 잎 열수추출물 투여에 의한 혈액 내 성분 변화를 조사하기 위해 혈청 내 포도당(glucose), 인슐린(insulin), 간독성 수치(GOT and GPT), 중성지방(triglyceride, TG), 총 콜레스테롤(total cholesterols, TC), 혈액요소질소(BUN) 과 크레아틴(creatine) 등의 혈중 bio-marker의 level을 측정하였다(Table 2). 혈액 내 포도당(glucose) 농도 변화를 관찰한 결과, 정상군(186.
대상 데이터
- 6주령의 Spraque Dawley (SD) 수컷 래트를 샘타코(Osan, Korea)에서 구입한 후 6일 동안 동물사육실의 환경 하에서 검역 및 순화시키면서 일반 건강 상태를 관찰한 후, 이상이 없는 개체를 선별하여 시험에 사용하였다. 본 시험의 환경은 온도 22±3℃, 상대습도 50±5%, 환기횟수 10-15회/시간, 조명주기 1시간(8:00-20:00), 조도 150-300 Lux의 사육 환경으로 설정된 동물 사육실에서 사료와 음용수를 급여하여 사육하였으며, 적응 및 시험기간 동안 격리 사육을 실시하였다.
- 1 M 시트르산소듐 완충용액을 투여하였다. 당뇨유발의 확인은 48시 간 후 공복혈당 수치가 300 mg/dL 이상인 동물을 실험에 사용하였다. 양성대조군으로는(donepezil 1 mg/kg b.
- 그리고 수득한 추출물을 여과 후, 감압농축 하여 동결건조를 실시하여 최종 추출물을 수득하였다. 본 실험에 사용한 시약으로 STZ, 아세틸콜린, 하이드록실아민(hydroxylamine), 다이나이트로벤조산(dithionitrobenzoic acid)의 경우 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 그 외 사용된 시약은 대한민국 약전의 1등급 이상 등급을 사용하였다.
- 시험군은 총 5개의 군으로 10마리씩 분리 하였다: i) 정상군(control) (vehicle-injection + saline administration group), ii) 스트렙토조토신 처리군(streptozotocin-intraperitoneal (i.p.
- 5%가 약물치료와 함께 한 가지 이상의 민간요법을 실시하고 있다고 보고하였다(9). 이에 본 연구에서는 한국의 서남해안에서 자생하는 천연 자원인 황칠나무의 잎을 활용하였다. 황칠나무에는 세스퀴터펜(sesquiterpene)에 속하는 베타셀리넨(β-selinene)이 가장 많이 함유되어 있고, capnellane-8-one가 다음으로 많이 함유되어 있다고 알려져 있으며(10), 뿌리와 잎의 줄기는 거풍습, 황멸맥, 풍습비통, 편두통, 월경불순에 효능이 있다고 알려져 왔다(11).
- 황칠나무 잎은 대한민국 전라남도 장흥에서 채취 하였으며, 건물 대비 20배의 물을 첨가하여 100℃에서 4시간 환류 추출하였다. 그리고 수득한 추출물을 여과 후, 감압농축 하여 동결건조를 실시하여 최종 추출물을 수득하였다.
데이터처리
- Statistical significance was tested with the unpaired Student’s t-test.
- 실험의 결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 각 그룹간 차이는 Student’s t-test 분석법을 사용하여 통계학적인 유의성을 판정하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
이론/모형
- 각 처리군의 뇌 조직에서 Ach의 측정은 Vincent 등(16)의 알칼리 하이드록실아민(alkaline hydroxylamine)을 가진 o-acyl 유도물의 반응을 기초로 측정하였다. 96-well plate에 뇌 조직 균질물 50를 취하여 1% 하이드록실아민(Sigma-Aldrich) 50 μL를 첨가, 혼합한 후 염산을 이용하여 pH를 1.
- 현재 당뇨병에 의한 혈관 합병증과 말초 신경병증은 많이 연구되어 있으나(7), 또 다른 합병증 중의 하나인 당뇨성 인지기능 장애에 관해서는 그 연구가 매우 미비한 실정이다. 그러므로 본 연구는 당뇨성 인지기능 장애에 효과가 있는 생리활성 소재를 탐색을 위해 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)로 유도한 당뇨성 인지능력 손상 동물모델을 사용하였다.
- 아세틸콜린에스터레이스(AchE)의 측정은 Ellman 등(17)의 방법으로, 96-well plat에 0.1 M Tris buffer, pH 8.0 (Trizma HCl + Trizma base)을 300 μL, 0.01 M 다이싸이오나이트로벤조산(dithionitrobenzoic acid) (DTNB; Sigma-Aldrich) 20 μL, 뇌 조직 균질물 10 μL를 연속적으로 첨가하고 흡광도 측정직전에 기질인 0.1 M 염화 아세틸콜린(acetylthiocholine chloride) (Sigma-Aldrich) 10 μL 를 첨가하여 405 nm에서 흡광도 변화를 5분 동안 관찰하였다.
성능/효과
- 실험 1주후, 체중 측정 결과, 정상군(control group)에 비해 당뇨 대조군(STZ group)과 시료군들(DMW groups)에서 유의적으로 체중이 감소하는 것을 확인하였다. 11주간 체중 증가량을 측정한 결과, 정상군에서의 체중 증가량은 지속적인 증가 성향을 보인 반면, STZ군에서는 당뇨유발이 된 1주를 시작으로 지속적인 체중 감소를 나타내었고 STZ로 유도한 당뇨성 인지기능 장애 모델에서도 유사한 경향을 확인 할 수 있었다(18). 또한 양성대조군 donepezil, DMW 100과 300 시료군에서 당뇨대조군(213.
- )을 처리하였다. 7일 간격으로 체중과 혈당을 측정하였으며 STZ군에 비해 DMW군에서 유의한 체중 증가를 확인 할 수 있었다. 혈당 측정 결과 DMW군에서 6주째부터 혈당이 감소하기 시작하였으며, STZ군에 비해 유의적인 혈당 감소를 나타내었다.
- Donepezil군(0.81±0.10 μmol/mg protein)과 DMW 300군(0.79±0.09 μmol/mg 단백질)은 STZ군과 비교하여 AchE의 활성은 유의적으로 감소하였으며, donepezil군, DMW 300군에서 각각 22.91±2.41, 22.96±2.62 μmol/mg 단백질로 Ach 함량은 유의 있게 증가하였다(p<0.05).
- Fig. 1B에서 보는 바와 같이, 첫 번째 trial (1st trials)의 3일째의 경우 STZ군(72.09±14.67 s)과 비교하였을 때 donepezil군(31.08±4.85 s)과 DMW 300 mg/kg군은 35.87± 5.63 s로 유의적으로 감소하였으며(p<0.01), 마지막 trial (3rd trials)의 3일째 경우에서도 시료군(DMW groups)들의 탈출시간이 STZ군과 비교하여 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(p<0.05).
- Fig. 4에서 보는 바와 같이 뇌 조직에서 Ach의 분해를 촉진시키는 AchE 효소의 활성이 정상군(0.52±0.02 μmol/mg 단백질)에 비해 STZ군(1.08±0.14 μmol/mg 단백질)에서 유의적으로 증가하였으며(p<0.01)(Fig. 4A), 그에 따라 뇌 조직에서 Ach의 함량은 정상군(24.96±2.35 μmol/mg 단백질) 대비 STZ군(19.47±1.72 μmol/mg 단백질)에서 감소한 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 4B).
- 그리고 이러한 효과는 당뇨성 인지기능 저하에 있어서도 긍정적 영향을 미칠 것으로 사료되어진다. GOT, GPT 측정 결과 두 가지 지표 모두 STZ군에서 정상군에 비해 유의적으로 높은 활성도를 나타내었고, 이는 STZ투여에 의해 유도된 당뇨모델을 이용한 다른 연구 결과(19,20)와 유사한 경향을 보였으며, 이는 STZ에 의한 당뇨 유발과 고혈당으로 인한 간 기능 대사의 저하에 의한 것으로 판단된다. 혈청 내 TG 양은 정상군이167.
- 간 기능 수치와 TG, TC, 그리고 크레아틴 농도에서는 각 군 간의 유의적 차이는 확인할 수 없었다. Morris water maze test와 passive avoidance test를 통해 STZ로 유도한 당뇨 모델에서 학습 및 기억력 장애를 확인 하였으며, DMW를 투여함으로서 학습 및 기억력이 유의적으로 회복, 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 뇌 해마에서 Ach 함량과 AchE 활성 측정 결과, 당뇨 대조군에 비해 Ach 함량은 증가하였으며, AchE의 활성은 유의적으로 감소 한 것을 확인 하였다.
- 2B). Probe test는 water maze test 동안에 누적된 학습 능력을 측정하는 것으로, 이상의 결과에 의해 STZ 유도성 당뇨 유발 동물의 학습 및 기억력 장애에 대한 황칠 열수추출물(DMW)의 개선 효과를 확인하였다.
- TC 검출량은 정상군이 64.50±9.31 mg/dL, STZ군이 108.00±2.83 mg/dL로 TG와 마찬가지로 당뇨 유발 후 혈청 내 TC의 양이 증가하였으며, DMW 100과 300 시료군에서는 감소하는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
- Morris water maze test와 passive avoidance test를 통해 STZ로 유도한 당뇨 모델에서 학습 및 기억력 장애를 확인 하였으며, DMW를 투여함으로서 학습 및 기억력이 유의적으로 회복, 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 뇌 해마에서 Ach 함량과 AchE 활성 측정 결과, 당뇨 대조군에 비해 Ach 함량은 증가하였으며, AchE의 활성은 유의적으로 감소 한 것을 확인 하였다. 본 연구 결과로 STZ로 유도된 고 혈당 동물모델에서 황칠나무 잎 열수추출물(DMW)의 당뇨 개선 및 학습, 기억력 개선 효과를 확인 할 수 있었다.
- 05). 또한 도피대가 존재하던 사분면에서의 유영 궤적을 카메라로 촬영하여 살핀 결과, 정상군 대비 STZ군의 유영 궤적은 집중되지 못함을 보였고 반면 DMW 군은 도피대가 존재했던 사분면에서 상대적으로 우수한 유영 집중도(궤적 분포)를 나타냈다(Fig. 2B). Probe test는 water maze test 동안에 누적된 학습 능력을 측정하는 것으로, 이상의 결과에 의해 STZ 유도성 당뇨 유발 동물의 학습 및 기억력 장애에 대한 황칠 열수추출물(DMW)의 개선 효과를 확인하였다.
- 또한 양성대조군 donepezil, DMW 100과 300 시료군에서 당뇨대조군(213.86±36.88 g)에 비해 각각 323.26±52.91, 275.54±41.93, 273.82±58.91 g으로 유의성 있는 체중 증가를 확인 할 수 있었으며(p<0.01), 이는 황칠나무 잎열수 추출물 투여가 당뇨 시의 급격한 체중 감소에 대하여 억제 작용이 있는 것으로 사료되었다.
- 반면, 2주째 측정 결과 STZ군에서는 515.60±53.38 mg/ dL으로 증가하기 시작하여 11주에는 595.00±13.06 mg/dL로 지속적인 고혈당 상태를 나타내었다(Table 1).
- Water maze test는 주로 해마 의존성 학습능력을 측정하며(27,28), passive avoidance test의 경우 주로 장기 기억력을 측정하기 위해 수행되어진다(29). 본 실험은 STZ로 이한 당뇨 유발 그리고 이로 인한 기억력 감퇴와 학습능력에 장애를 확인하였으며, water maze test와 passive avoidance test를 병행 실시함으로서 황칠나무 잎 열수추출물(DMW)의 학습 및 기억력 개선 효과를 실험 결과를 통해 확인 할 수 있었다.
- 또한 뇌 해마에서 Ach 함량과 AchE 활성 측정 결과, 당뇨 대조군에 비해 Ach 함량은 증가하였으며, AchE의 활성은 유의적으로 감소 한 것을 확인 하였다. 본 연구 결과로 STZ로 유도된 고 혈당 동물모델에서 황칠나무 잎 열수추출물(DMW)의 당뇨 개선 및 학습, 기억력 개선 효과를 확인 할 수 있었다. 이는 당뇨의 개선 효과와 더불어 고 혈당으로 인한 퇴행성 치매의 예방과 치료에도 일부 효과적일 것으로 사료된다.
- 당뇨는 인슐린의 생리작용이 저조하거나 인슐린 수용체의 수가 적어 인슐린의 생리적 기능의 불충분으로 인해 혈액 내 중성지방이 증가한다고 보고되고 있으며(22,23), 증가된 중성지방은 콜레스테롤 전달을 증가시켜서 결국에는 위험한 당뇨 합병증을 유발한다고 알려져 있다(24). 본 연구는 STZ로 유도된 당뇨성 인지기능 저하 모델에서 황칠나무 잎 열수추출물(DMW)이 혈액 내 포도당, 인슐린 및 중성지방 수치 등을 유의적으로 감소시킴으로써 일정 부분 고 혈당 개선 효과에 대한 활용 가능성을 확인 할 수 있었다.
- 총 11주 동안 7일에 한번 체중과 혈당을 측정하였으며, 실험 시작일의 체중과, 혈당은 모든 실험군에서 차이를 보이지 않아 정상 상태임을 확인하였다. 실험 1주후, 체중 측정 결과, 정상군(control group)에 비해 당뇨 대조군(STZ group)과 시료군들(DMW groups)에서 유의적으로 체중이 감소하는 것을 확인하였다. 11주간 체중 증가량을 측정한 결과, 정상군에서의 체중 증가량은 지속적인 증가 성향을 보인 반면, STZ군에서는 당뇨유발이 된 1주를 시작으로 지속적인 체중 감소를 나타내었고 STZ로 유도한 당뇨성 인지기능 장애 모델에서도 유사한 경향을 확인 할 수 있었다(18).
- 또한, Biessels 등(25)은 STZ유도 당뇨 쥐의 대뇌피질에서 AchE활성 증가를 확인하였고, 이는 당뇨 동물모델에서시냅스의 소실과 Ach농도의 감소 때문에 줄어든 콜린성 신경전달 물질의 효율 감소 때문이라고 보고하였다. 이와 같은 기존 연구 결과를 고려할 때, 본 실험에서의 STZ 유도성 당뇨 모델에서 황칠 열수추출물(DMW)의 학습 및 기억능력 개선효과는 극단적인 당대사의 저하로 인한 콜린세포(cholinergic cell) 또는 학습과 기억의 중추가 되는 신경세포들의 소실에 있어 인슐린 합성 또는 기능의 증가로 혈중 인슐린 효용성을 높여 혈당 조절 및 당 대사율을 증가시키고, 콜린세포의 사멸을 억제함으로써 Ach을 포함한 신경전달물질의 수준을 유지시켜 인지능력 및 기억력을 개선시키는 것으로 사료되어 진다. 그리고 추가적으로, 황칠 열수추출물(DMW)의 투여가 증가된 AchE 활성을 감소시키는 것으로 보아, 고 혈당의 완화로 인한 AchE 활성의 감소뿐만 아니라, donepezil과 같은 AchE의 억제제로서의 잠재적 가능성도 추가적으로 연구할 필요가 있을 것이다.
- Figure 1A는 water maze test의 반복일정으로서 총 3일 동안의 실험 중 학습이 진행되어 군간 가장 큰 차이를 나타내는 마지막 3일째의 trial을 표시하였다. 정상군과 비교하였을 때, STZ군은 도피대를 찾아 올라가는 탈출시간이 감소하지 않았으며, 총 3일 동안의 반복 학습에도 불구하고 STZ로 유도된 고 혈당에 의한 기억력 장애로 정상적인 학습이 진행되지 않았음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 고혈당 상태에서 기억 및 학습능력 등의 장애를 확인한 다른 연구들과도 일치한다(25,26).
- 스트렙토조토신의 복강 투여로 유도된 당뇨 모델 쥐에서 황칠나무 잎 열수추출물(DMW)이 체중 및 혈당 강하에 미치는 결과는 다음과 같다(Table 1). 총 11주 동안 7일에 한번 체중과 혈당을 측정하였으며, 실험 시작일의 체중과, 혈당은 모든 실험군에서 차이를 보이지 않아 정상 상태임을 확인하였다. 실험 1주후, 체중 측정 결과, 정상군(control group)에 비해 당뇨 대조군(STZ group)과 시료군들(DMW groups)에서 유의적으로 체중이 감소하는 것을 확인하였다.
- 특히 11주째 대조군에 비해 DMW 100과 300 시료군이 523.80±27.73, 504.28±35.57 mg/dL로 혈당 변화에서 유의적인 감소를 나타내었다(p<0.01).
- 하지만, DMW 100군 (33.74±5.98 s)과 DMW 300군 (33.43±4.67 s)의 경우, STZ군과 비교하여 유의적으로 target 분면에서의 유영 시간이 증가한 것을 확인 하였다(p<0.05).
- 05). 학습시간(day)과 학습횟수(trial)가 늘어날수록 정상군, DMW 100, 300 시료군과 donepezil군에서는 전체적인 탈출시간이 감소한 반면 당뇨를 유발한 군에서는 탈출시간의 감소를 유의적으로 확인할 수 없었으나 다른 군들에게서는 학습시간과 횟수에 따른 탈출시간의 감소를 유의적으로 확인 할 수 있었다. 앞서 water maze 학습과 연결하여 4일째에는 도피대를 제거하고 도피대가 존재했던 분면에서의 수영시간을 측정한 probe test를 수행하였을 때, 정상군(46.
- 한편 신장의 기능적 마커인 혈액요소질소(BUN)과 크레아티닌(creatinine)의 변화를 측정한 결과, BUN은 정상군에 비해 STZ군에서 증가하였으며, DMW 100과 300 투여에 의해 유의한 감소를 나타내었다(p<0.05).
- 7일 간격으로 체중과 혈당을 측정하였으며 STZ군에 비해 DMW군에서 유의한 체중 증가를 확인 할 수 있었다. 혈당 측정 결과 DMW군에서 6주째부터 혈당이 감소하기 시작하였으며, STZ군에 비해 유의적인 혈당 감소를 나타내었다. 혈청 내 바이오마커 측정 결과 혈중 포도당은 DMW 시료군에서 유의하게 감소하였고, 인슐린 호르몬 농도와 혈액 요소질소 또한 유의한 감소를 나타내었다.
- 혈액 내 포도당(glucose) 농도 변화를 관찰한 결과, 정상군(186.66±9.37 mg/dL)에 비해 STZ군(599.50±5.25 mg/dL)의 혈중 포도당 농도가 유의적으로 높게 나타났으며(p<0.05), donepezil군과 DMW 300 시료군에서 유의하게 포도당 농도의 감소를 확인하였다(p<0.05).
- 혈청 내 TG 양은 정상군이167.16±14.74 mg/dL, STZ군이 494.50±7.78 mg/dL로 당뇨 유발 후 크게 증가하였으며, donepezil군, DMW 100군과 300 군에서는 각각 244.25±10.73, 200.66±12.79, 277.00±17.51 mg/dL로 STZ군에 비해 감소하는 것으로 나타났다.
- 크레아티닌 농도는 당뇨 유발 대조군에서 증가하는 경향이 보이긴 했으나 시험 대조군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 혈청 내 바이오마커 분석 결과 GOT, GPT, TG, TC, BUN 분석에서 정상군과 STZ군에서의 유의적 차이가 나타났고 STZ군에 비하여 시료군의 처리의 효과가 나타났으나, DMW 100과 300시료군에서 추출물의 용량에 대한 의존성은 나타나지 않았다. 당뇨 유발 대조군에서 BUN의 증가는 단백질 및 아미노산의 분해 증가, 탈수 상태, 신장 기능 부전에 따른 신장의 요소배설 감소 등에 기인 할 수 있는데(21), 크레아틴 농도에서 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 혈당 측정 결과 DMW군에서 6주째부터 혈당이 감소하기 시작하였으며, STZ군에 비해 유의적인 혈당 감소를 나타내었다. 혈청 내 바이오마커 측정 결과 혈중 포도당은 DMW 시료군에서 유의하게 감소하였고, 인슐린 호르몬 농도와 혈액 요소질소 또한 유의한 감소를 나타내었다. 간 기능 수치와 TG, TC, 그리고 크레아틴 농도에서는 각 군 간의 유의적 차이는 확인할 수 없었다.
- 혈청 내 인슐린 농도는 정상군 (0.88±0.13 ng/mL)에 비해 STZ군은 0.08±0.00 ng/mL으로 당뇨유도 후 인슐린 농도가 유의하게 감소하였으며(p<0.001), donepezil 군과 DMW 시료군에서 유의하게 증가한 것을 확인하였다(p<0.01).
후속연구
- 이와 같은 기존 연구 결과를 고려할 때, 본 실험에서의 STZ 유도성 당뇨 모델에서 황칠 열수추출물(DMW)의 학습 및 기억능력 개선효과는 극단적인 당대사의 저하로 인한 콜린세포(cholinergic cell) 또는 학습과 기억의 중추가 되는 신경세포들의 소실에 있어 인슐린 합성 또는 기능의 증가로 혈중 인슐린 효용성을 높여 혈당 조절 및 당 대사율을 증가시키고, 콜린세포의 사멸을 억제함으로써 Ach을 포함한 신경전달물질의 수준을 유지시켜 인지능력 및 기억력을 개선시키는 것으로 사료되어 진다. 그리고 추가적으로, 황칠 열수추출물(DMW)의 투여가 증가된 AchE 활성을 감소시키는 것으로 보아, 고 혈당의 완화로 인한 AchE 활성의 감소뿐만 아니라, donepezil과 같은 AchE의 억제제로서의 잠재적 가능성도 추가적으로 연구할 필요가 있을 것이다.
- 이는 당뇨의 개선 효과와 더불어 고 혈당으로 인한 퇴행성 치매의 예방과 치료에도 일부 효과적일 것으로 사료된다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 황칠 열수추출물(DMW)이 당뇨에 의한 학습 및 기억력의 저하에 있어 효과적인 대안으로서 보다 더 넓은 분야에서 연구되기를 바라는 바이다.
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