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문제 정의
- 본 연구에서는 적복령 추출물의 대표적인 엔테로바이러스로 심근염을 일으키는 CVB3에 대한 증식억제 효과와 증식과 관련된 세포신호 조절을 확인하였다. 특히 바이러스 감염 초기 일어나는 바이러스 증식과 관련된 유전자 증폭의 억제는 효과적인 바이러스 증식 억제 작용이 가능하게 함을 알 수 있었다.
- 이 연구를 통해 식물 추출물로부터 만든 새로운 천연 항바이러스 물질을 도출하고자 하였다. 우리나라는 예전부터 다양한 식물을 병의 치료제로 사용하여 왔으며 이러한 식물 약제에 대한 정보와 지식이 잘 정립되어 있다.
- 15,16) 본 연구에서는 이러한 적복령 추출물의 대표적인 엔테로바이러스로 심근염을 일으키는 콕사키바이러스 B3에 대한 증식 억제 효과와 엔테로바이러스 증식과 관련된 세포 신호조절을 확인하였다. 이를 통하여 엔테로바이러스 천연물 치료제 개발의 가능성을 규명하고 그 기반을 마련하고자 하였다.
가설 설정
- 4. P. cocos extract inhibits cell signaling molecule activity. (A, B) P.
제안 방법
- 12) 먼저 바이러스 감염 세포 상등액의 희석액을 준비하고 6-well plate에 배양된 HeLa 세포에 30분간 감염시킨 후 3% Difco agar/DMEM을 3 mm로 덮고 37℃ CO2 배양기에서 이틀간 배양하여 바이러스 감염에 의한 세포사멸을 확인하고 plaque 숫자를 세어 PFU assay로 바이러스 역가를 측정하였다. HeLa cell은 10% fetal bovine serum이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle medium(DMEM)에서 배양하였다.
- 주로 심경을 다스리고 부인병증에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 다양한 장기의 염증 억제 효과가 검증 된 약제이다.15,16) 본 연구에서는 이러한 적복령 추출물의 대표적인 엔테로바이러스로 심근염을 일으키는 콕사키바이러스 B3에 대한 증식 억제 효과와 엔테로바이러스 증식과 관련된 세포 신호조절을 확인하였다. 이를 통하여 엔테로바이러스 천연물 치료제 개발의 가능성을 규명하고 그 기반을 마련하고자 하였다.
- 1 mg/ml의 적복령 추출물을 처리하였다. 18시간이 지난 후, 전체 단백질을 추출하여 western blot analysis을 수행하였다. Fig.
- CVB3 바이러스 단백질 생산 억제 − HeLa cell을 12 well-plate에 단층으로 배양하고 104 PFU/ml CVB3를 30분간 감염 시킨 후 바이러스를 씻어내고 1 mg/ml, 0.1 mg/ml의 적복령 추출물을 처리하였다.
- 식물 추출물들은 다양한 약용식물들에서 에탄올 추출법을 사용하여 동결 건조를 통해 획득하여 실험에 사용하였다. CVB3를 세포에 감염시키고 식물 추출물들을 1 mg/ml부터 희석하여 10 ng/ml까지 첨가하여 효능을 확인하였다. HeLa cell의 생존율은 이전의 연구에서 엔테로바이러스 증식 억제 효능을 검증하여 본지에 발표했던 오리방풀(Isodon excisus) 추출물에서 얻은 ORI213)를 positive control로 사용하여 적복령(Poria cocos)추출물의 처리에 의해 1 mg/ml 농도에서 90% 이상 증가하였으며 처리 농도에 의존적으로 항바이러스 효과를 나타냈다(Fig.
- Virus and Cell lines −콕사키바이러스 역가는 이전의 논문에서 묘사했었던 것과 같이 HeLa cell에서 plague forming unit(PFU) assay를 통해 결정하여 실험에 사용하였다.
- 먼저 HeLa cell을 96well-plate에 5×104 숫자로 배양하고 104 PFU/ml의 콕사키바이러스를 30분간 감염시키고 5% FBS DMEM에 1mg/ml부터 1ng/ml까지 1/10으로 순차적으로 희석한 천연 화합물을 처리하였다.
- 바이러스 유전자 검출 − RNA 바이러스인 CVB4의 유전자 증폭을 검증하기 위해 TRIzol reagent(Invitrogen, USA)로 세포를 분리하여 RNA를 추출하고 전체 추출물의 aliquot 중 2 μl를 주형으로 Maxime Reverse-transcription(RT) kit(Intron Biotech, Inc. KOR)을 사용하여 RT를 수행한다.
- 바이러스 증식억제 식물 추출물 선정−엔테로바이러스 대표바이러스인 CVB3에 대한 항바이러스 효과를 HeLa cell의 생존율 분석을 통해 검증하였다.
- 본 연구팀은 몇몇 후보 화합물을 확보하였고, 그들의 항바이러스 활성을 평가하였다. 또한, 본 연구에서 엔테로바이러스와 같은 장내바이러스인 CVB3에 대한 강력한 바이러스 증식 억제 효과를 보여주었다.
- 18시간 감염 후, 세포 증식 검출 시약인 Cell Counting Kit 8(CCK-8) 8 μl를 넣고 2시간동안 더 배양한다. 세포의 생존에 따라 변화되는 세포배양액의 변화를 microplate reader(Molecular device, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존을 확인 천연물의 항바이러스 효능을 검증 하였다.
- 우리 실험에서는 다양한 식물추출물들의 CVB3의 증식 억제 효과와 바이러스 세포독성 저하 효능에 대해 실험하였으며 적복령(Poria cocos) 추출물의 뛰어난 CVB3 증식 억제 효능을 확인하였다. 적복령 추출물은 CVB3 감염 HeLa cell의 생존율 유지를 실험하기 위해 사용되었으며 추출물의 농도에 의존적으로 CVB3의 증식을 강하게 억제 하였다.
- 이때 바이러스의 positive 가닥 증폭을 위해 VP1-antisense primer(5'-CACCGGATGGCCAATCCA-3')로 먼저 RT 반응을 수행하여 cDNA를 생산하고 생산된 cDNA를 주형으로 VP1-AS와 VP1-sense primer(5'-GCGAAGAGTCTATTGAGCTA-3')를 사용하여 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 수행하고 1.5% agarose gel에 전기영동하여 확인한다.
- 적복령 추출물의 CVB3 유전자 증폭 억제−적복령 추출물의 CVB3 증식억제가 바이러스 유전자의 증폭까지 억제할 수 있는지를 확인하기 위하여 배양세포에 CVB3를 16시간 동안 적복령 추출물과 함께 감염 후 세포의 Total RNA를 추출하고 바이러스의 유전자를 primer로 reverse transcription(RT)을 수행하여 바이러스의 positive와 negative strand RNA의 증폭을 확인하여 실제 바이러스 유전자의 복제 억제 효능을 검증하였다.
- 적복령 추출물 처리를 통한 세포 활성 신호 억제 −이전의 연구에서 엔테로바이러스는 세포 감염 후 증식을 위해 세포 신호 물질인 ERK와 AKT의 활성을 조절한다고 보고되었다. 적복령 추출물의 바이러스 증식 억제 효능이 세포신호 물질의 활성 조절을 통한 세포 생존의 유무를 ERK(pERK)와 AKT(pAKT)의 활성을 통해 검증하였다. 세포 활성 조절 신호 물질 pERK와 pAKT는 바이러스의 증식에도 1mg/ml 농도의 적복령 추출물 처리 세포에서는 바이러스 감염 중에도 활성화 되지 않고 바이러스가 감염되지 않은 control 세포와 동일하게 정상상태로 유지되고 있었으며 0.
- 추출물의 바이러스 증식억제 실험 − Cell survival assay를 통해 다양한 천연 화합물의 항바이러스 활성을 실험하여 콕사키바이러스 증식 억제 물질을 선별하였다.
대상 데이터
- 바이러스 증식억제 식물 추출물 선정−엔테로바이러스 대표바이러스인 CVB3에 대한 항바이러스 효과를 HeLa cell의 생존율 분석을 통해 검증하였다. 식물 추출물들은 다양한 약용식물들에서 에탄올 추출법을 사용하여 동결 건조를 통해 획득하여 실험에 사용하였다. CVB3를 세포에 감염시키고 식물 추출물들을 1 mg/ml부터 희석하여 10 ng/ml까지 첨가하여 효능을 확인하였다.
- 적복령(Poria cocos) 추출 −적복령 추출물은 건조된 200 g 적복령을 분쇄한 후 95% 에탄올로 2주간 추출한 다음 감압 농축하여 에탄올 추출물 2.47 g을 획득하여 수율 1.2%로 확보하였으며 사용 용도에 따라 DMSO에 녹여 100 mg/ml의 고농도 시약을 제조하고 세포배양 액체 배지에 희석하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 통계처리−모든 결과는 mean±SEM으로 나타냈다. Control과 바이러스 감염 그룹 간의 결과는 Mann-Whitney nonparametric t-test(GraphPad Prism 4.0 for Windows; GraphPad Software, La Jolla, USA)를 사용하여 측정한다. P<0.
성능/효과
- 2%로 확보하였으며 사용 용도에 따라 DMSO에 녹여 100 mg/ml의 고농도 시약을 제조하고 세포배양 액체 배지에 희석하여 실험에 사용하였다.16) 적복령 추출물은 Ergosterol, histidine, caprylic aicd, dodecenoic acid, lauric acid, palmitic acid, undecanoic acid 등의 화학물질이 주성분을 이루고 있으며 주로 항염증과 관련된 작용을 하는 물질을 다량함유하고 있다. 대구한의대학교 김진희 교수가 추출에 사용할 적복령을 감별하였다.
- 18시간이 지난 후, 전체 단백질을 추출하여 western blot analysis을 수행하였다. Fig. 2A)에서와 같이 CVB3의 막단백질 VP1의 농도가 적복령 추출물의 투여 농도에 따라 1 mg/ml 농도에서 100% 억제되는 것을 관찰하였으며 바이러스가 증식하는 동안 발현하는 단백질 분해효소 protease2A가 절단하는 전사개시 인자 단백질 eIF4GI도 적복령의 처리에 의해 단백질의 절단이 유의하게 감소하여 바이러스 증식의 억제를 확인 하였다. 또한 추가적으로 실제 바이러스 증식을 확인하기 위해 형광 단백질 GFP(Green fluorescent protein)가 삽입된 CVB3-GFP를 감염하여 세포내의 바이러스 증식을 형광으로 확인했을 때 적복령 추출물1 mg/ml이 CVB3 증식을 90%이상 억제하는 효과를 확인하였다(Fig.
- CVB3를 세포에 감염시키고 식물 추출물들을 1 mg/ml부터 희석하여 10 ng/ml까지 첨가하여 효능을 확인하였다. HeLa cell의 생존율은 이전의 연구에서 엔테로바이러스 증식 억제 효능을 검증하여 본지에 발표했던 오리방풀(Isodon excisus) 추출물에서 얻은 ORI213)를 positive control로 사용하여 적복령(Poria cocos)추출물의 처리에 의해 1 mg/ml 농도에서 90% 이상 증가하였으며 처리 농도에 의존적으로 항바이러스 효과를 나타냈다(Fig. 1). 그러나 0.
- 엔테로바이러스는 positive strand RNA 바이러스로 바이러스 유전자 복제를 위해서는 negative strand의 생산이 필수적이다. 결과에서 보여주는 것과 같이 적복령 추출물의 처리는 1 mg/ml 농도에서 positive strand 80%, negative strand 100%로 강력하게 CVB3의 유전자 증폭을 억제하였다(Fig. 3). 이 결과를 통해 감염세포에서 바이러스의 유전자 복제와 단백질 생산 저해로 새로운 바이러스의 생성 억제에 매우 효과적으로 작용하고 있음을 알 수 있었다.
- 특히 HeLa cell에서 바이러스 막 단백질의 생산이 유의하게 감소되었고 새로운 바이러스의 증식이 현저히 억제됨이 확인되었다. 또한 식물 추출물 처리에 의해 바이러스의 유전자 증폭이 현저히 감소되어 바이러스 증식 억제 효과가 유전자 복제 저해에 의해 유도됨도 간접적으로 확인할 수 있었다. 그러나 식물 추출물이 가지고 있는 세포에 대한 독성과 물성의 한계는 높은 농도의 적용을 어렵게하여 향후 추출물의 성분분석을 통한 지표 물질의 분리와 정제가 필요할 것으로 생각된다.
- 2A)에서와 같이 CVB3의 막단백질 VP1의 농도가 적복령 추출물의 투여 농도에 따라 1 mg/ml 농도에서 100% 억제되는 것을 관찰하였으며 바이러스가 증식하는 동안 발현하는 단백질 분해효소 protease2A가 절단하는 전사개시 인자 단백질 eIF4GI도 적복령의 처리에 의해 단백질의 절단이 유의하게 감소하여 바이러스 증식의 억제를 확인 하였다. 또한 추가적으로 실제 바이러스 증식을 확인하기 위해 형광 단백질 GFP(Green fluorescent protein)가 삽입된 CVB3-GFP를 감염하여 세포내의 바이러스 증식을 형광으로 확인했을 때 적복령 추출물1 mg/ml이 CVB3 증식을 90%이상 억제하는 효과를 확인하였다(Fig. 2B).
- 본 연구팀은 몇몇 후보 화합물을 확보하였고, 그들의 항바이러스 활성을 평가하였다. 또한, 본 연구에서 엔테로바이러스와 같은 장내바이러스인 CVB3에 대한 강력한 바이러스 증식 억제 효과를 보여주었다.
- 3). 이 결과를 통해 감염세포에서 바이러스의 유전자 복제와 단백질 생산 저해로 새로운 바이러스의 생성 억제에 매우 효과적으로 작용하고 있음을 알 수 있었다.
- 1 mg/ml 농도에서는 3배이상 활성을 나타내 이전의 바이러스 증식과 동일한 양상을 나타냈다. 적복령 추출물의 처리는 세포 활성 조절 신호 물질의 억제를 통해 바이러스의 증식을 최소화하여 세포의 생존을 유지함을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 적복령 추출물은 CVB3 감염 HeLa cell의 생존율 유지를 실험하기 위해 사용되었으며 추출물의 농도에 의존적으로 CVB3의 증식을 강하게 억제 하였다. 특히 HeLa cell에서 바이러스 막 단백질의 생산이 유의하게 감소되었고 새로운 바이러스의 증식이 현저히 억제됨이 확인되었다. 또한 식물 추출물 처리에 의해 바이러스의 유전자 증폭이 현저히 감소되어 바이러스 증식 억제 효과가 유전자 복제 저해에 의해 유도됨도 간접적으로 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 적복령 추출물의 대표적인 엔테로바이러스로 심근염을 일으키는 CVB3에 대한 증식억제 효과와 증식과 관련된 세포신호 조절을 확인하였다. 특히 바이러스 감염 초기 일어나는 바이러스 증식과 관련된 유전자 증폭의 억제는 효과적인 바이러스 증식 억제 작용이 가능하게 함을 알 수 있었다. 이를 통하여 향후 지표 물질의 분석을 통한 천연물 유래 엔테로바이러스 치료 물질 개발이 가능할 것으로 기대한다.
후속연구
- 또한 식물 추출물 처리에 의해 바이러스의 유전자 증폭이 현저히 감소되어 바이러스 증식 억제 효과가 유전자 복제 저해에 의해 유도됨도 간접적으로 확인할 수 있었다. 그러나 식물 추출물이 가지고 있는 세포에 대한 독성과 물성의 한계는 높은 농도의 적용을 어렵게하여 향후 추출물의 성분분석을 통한 지표 물질의 분리와 정제가 필요할 것으로 생각된다.
- 특히 바이러스 감염 초기 일어나는 바이러스 증식과 관련된 유전자 증폭의 억제는 효과적인 바이러스 증식 억제 작용이 가능하게 함을 알 수 있었다. 이를 통하여 향후 지표 물질의 분석을 통한 천연물 유래 엔테로바이러스 치료 물질 개발이 가능할 것으로 기대한다.
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