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문제 정의
- 본 연구에서는 삼잎국화의 성분분석 및 피부세포의 생리 활성에서 삼잎국화의 효과들을 조사하여 기능성 식품의 원재료 개발을 위한 기초 실험들을 진행하였다.
- 피부세포의 이동능은 진피에서 지속적으로 증식하여 표피로 이동하여 각피세포로 분화하기 위한 일반적인 생리활성이며, 상처로 인한 피부 재건을 위해서는 매우 중요한 세포활성 기능 중에 하나이다(Kim 등 2011). 이러한 피부세포의 이동능에 있어서 삼잎국화 추출물의 효과를 알아보기 위해서 피부 세포의 이동능을 조사하였다. Fig.
- UVB 조사에 따른 항산화시스템의 불균형으로 발생하는 ROS가 DNA 손상 및 단백질 변성을 초래한다(Emanuele 2014). 이와 관련하여 삼잎국화 추출물이 UVB 조사에 의한 ROS 생성에 어떠한 영향을 주는지 조사하였다. UVB 만을 조사하였을 경우, 대조군에 비하여 약 4.
제안 방법
- 4 h 후, 10 μM CM-H2DCFDA를 처리하여 37℃에서 30분 동안 빛이 없는 조건에서 배양하였다. 1% Trypsin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확하고, 다시 PBS로 세척하여 flow cytometer (FACSAria, BD Biosciences, USA)를 이용하여 형광을 측정하였다.
- HaCaT 세포를 2×105으로 6-well plate에 배양한 후, DMEM 배지를 PBS로 바꿔준 뒤, UVB를 다양한 선량(25, 50, 75, 100, 200 mJ/cm2)으로 조사하였다.
- HaCaT 세포에 삼잎국화 추출물을 농도별(0~100 μg/mL)로 24시간 동안 전처리한 후, UVB 50mJ/cm2를 조사하였다.
- )으로 조사하였다. UVB lamp는 UVB-18 lamp(ULTRA* LUM. Inc., Claremont, CA, USA)를 사용하였고, UV 선량은 UVA/UVB lightmeter 850009(Sper scientific, Scottsdale, AZ, USA)로 측정하였다. 삼잎국화의 효과를 확인하기 위해서, 삼잎국화 추출물을 농도별(0~100 μg/mL)로 24시간 동안 전처리하고, UVB 50 mJ/cm2을 조사하였다.
- 삼잎국화의 효과를 확인하기 위해서, 삼잎국화 추출물을 농도별(0~100 μg/mL)로 24시간 동안 전처리하고, UVB 50 mJ/cm2을 조사하였다. UVB 조사 4 h 후, CM-H2DCFDA(Invitrogen, Camarillo, CA, USA)를 이용하여 ROS의 생성을 측정하였다.
- UVB 조사 시 나타나는 세포독성에 있어서, 삼잎국화 추출물의 효과를 살펴보기 위하여, HaCaT 세포에 삼잎국화 추출물을 50 μg/mL로 24 h 동안 전처리한 후, UVB를 50 mJ/cm2로 조사한 다음, 세포 생존률을 살펴보았다.
- 8 mL를 첨가, 혼합한 다음, 실온에서 90 min 동안 반응시킨 후 750 nm에서 OD를 측정하였다. 검량선은 gallic acid(Sigma, St Louis, MO, USA)를 증류수에 용해시켜 위와 같은 방법으로 OD를 측정 하여 작성하였다. 총 플라보노이드 함량은 Moreno 등(2000) 의 방법에 따라 시료용액 0.
- 결국, 다음으로 진행되는 다양한 실험들에서 삼잎국화 추출물은 가장 높은 세포성장률을 나타낸 50 μg/mL의 농도로 진행하였다.
- 다음으로, UVB 선량에 따른 HaCaT 세포의 세포독성을 조사하였다. HaCaT 세포에 UVB를 0~200 mJ/cm2로 조사한 후, 세포 독성 실험을 실시한 결과, UVB 조사량이 증가할수록 HaCaT 세포의 생존률이 유의 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 여과액을 이동상(A, 5 mM Ammonium formate/DW : B, 5 mM Ammonium formate/MeOH = 9:1)을 이용하여 적당 비율로 희석한 후, 시험용액으로 사용하였다. 분석은 HPLC(Agilent 1200, Agilent, USA)와 Mass Spectrometry(API4000, AB Sciex, USA)를 사용하여 Table 2의 조건으로 시행하였다(Helio, 2008). 미네랄 성분(Ca, K, Fe) 함량은 식품공전의 미네랄 성분 분석법(KFDA 2005)에 따라 수행하였다.
- 비타민 A, C, D3 함량은 시료 1 g을 식품공전의 미량 영양성분 시험법(Food code, 2003)에 따라 처리하여, 이 중 20 μL를 취하였으며, 분석은 HPLC(Agilent 1200, Agilent, USA)를 사용하여 Table 1의 조건으로 시행하였다.
- 비타민 A, C, D3 함량은 시료 1 g을 식품공전의 미량 영양성분 시험법(Food code, 2003)에 따라 처리하여, 이 중 20 μL를 취하였으며, 분석은 HPLC(Agilent 1200, Agilent, USA)를 사용하여 Table 1의 조건으로 시행하였다. 비타민 B1, B2 함량 분석을 위해 시료 5 g을 75 mM Ammonium formate 40 mL에 넣고, 10 min 동안 sonication한 후 1 h 동안 shaking하여 추출하였다. 추출액을 3,000 rpm, 15 min으로 원심분리한 후, 상층액을 0.
- 삼잎국화 추출물을 농도별(0, 25, 50, 100, 200, 300, 500 μg/ mL)로 희석하여 80% 메탄올로 용해시킨 0.2 mM DPPH(Sigma, St Louis, MO, USA)는 용액과 혼합한 후, ELISA microplate reader(BioRad Laboratories Inc., California, USA)를 사용하여 515 nm에서 흡광도의 감소를 5분 간격으로 30분간 측정한 결과값을 통해 SC50(50% scavenging concentration)을 구하였다.
- 삼잎국화 추출물의 세포실험 적정 농도를 알아보기 위하여, 사람 각질형성 피부세포인 HaCaT 세포에 삼잎국화 추출물을 0~500 μg/mL의 농도로 24시간 동안 처리하였다.
- 삼잎국화의 효과를 확인하기 위해서, 삼잎국화 추출물을 농도별(0~100 μg/mL)로 24시간 동안 전처리하고, UVB 50 mJ/cm2을 조사하였다.
- 조심스럽게 culture inserts를 벗겨내어 모든 샘플이 동일한 넓이의 wound를 갖도록 한 후, 삼잎국화 추출물을 농도별(0~100 μg/mL)로 처리하였다. 세포 이동능을 정량하기 위해, 추출물 처리 후, 0 h 과 16 h의 세포 사진을 Olympus inverted microscope를 이용하여 획득하였고, 각 샘플의 세포이동능은 ImageJ software(http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 이용하여 이동된 거리의 양을 %로 정량하였다.
- 세포들을 DMEM 배지에서 5×104 cells/well의 밀도로 현탁하여 0~0.5 mg/mL의 농도로 삼잎국화 추출물을 처리하였다.
- 미네랄 성분(Ca, K, Fe) 함량은 식품공전의 미네랄 성분 분석법(KFDA 2005)에 따라 수행하였다. 유도결합플라즈마원자방출분광기(ICP-AES, PerkinElmer, Optima 8300, USA)를 사용하였으며, 분석조건은 Nebulizer gas flow : 0.55, Auxiliary gas flow : 0.2, Plasma gas flow 8.0, ICP RF power : 1,450, View dist : 15.0, Pump parameters : 1.50, Wavelength : 317.933 (Ca, Axial), 766.490(K, Axial), 238.204 (Fe, Radial)으로 분석 하였다. 총 폴리페놀 함량은 Slinkard 등(1977)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다.
- 조심스럽게 culture inserts를 벗겨내어 모든 샘플이 동일한 넓이의 wound를 갖도록 한 후, 삼잎국화 추출물을 농도별(0~100 μg/mL)로 처리하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 HaCaT 세포는 Addexobio(SanDiego, Califonia, USA)로 부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 각질형성 피부세포주인 HaCaT 세포주를 10% FBS(GibcoBRL, Braunscheig, Germany)와 1% penicillin/streptomycine(GibcoBRL)을 첨가한 DMEM(GibcoBRL) 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 세포 배양기에서 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 대조구인 비타민 C(ascorbic acid)는 4.28 μg/mL의 적은 농도에서 SC50이 결정되었고, 삼잎국화 추출물은 197 μg/mL로 나타났다.
- , California, USA)를 사용하여 515 nm에서 흡광도의 감소를 5분 간격으로 30분간 측정한 결과값을 통해 SC50(50% scavenging concentration)을 구하였다. 대조군으로는 ascorbic acid(Sigma, St Louis, MO, USA)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 HaCaT 세포는 Addexobio(SanDiego, Califonia, USA)로 부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 각질형성 피부세포주인 HaCaT 세포주를 10% FBS(GibcoBRL, Braunscheig, Germany)와 1% penicillin/streptomycine(GibcoBRL)을 첨가한 DMEM(GibcoBRL) 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 세포 배양기에서 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 세포 내 활성 산소의 생성을 측정하기 위하여 형광시약으로 CM-H2DCFDA를 이용하였다. HaCaT 세포에 삼잎국화 추출물을 농도별(0~100 μg/mL)로 24시간 동안 전처리한 후, UVB 50mJ/cm2를 조사하였다.
- 실험에 사용된 삼잎국화는 농업회사 법인 번영 유한회사(홍천, 강원도, 대한민국)로부터 공급받았고, 사용된 삼잎국화는 4~5월의 어린순이 달려있는 식용이 가능한 잎과 줄기만을 열수추출하여 사용하였다.
- 2 μm membrane filter로 여과하였다. 여과액을 이동상(A, 5 mM Ammonium formate/DW : B, 5 mM Ammonium formate/MeOH = 9:1)을 이용하여 적당 비율로 희석한 후, 시험용액으로 사용하였다. 분석은 HPLC(Agilent 1200, Agilent, USA)와 Mass Spectrometry(API4000, AB Sciex, USA)를 사용하여 Table 2의 조건으로 시행하였다(Helio, 2008).
데이터처리
- 모든 실험은 3회 이상 반복 실시하여 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 각 평균값에 대한 검증은 SAS® version 9.11(SAS institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 Duncan's multiple range test로 검증하였다.
이론/모형
- HaCaT 세포의 생존률은 MTT(Sigma, St Louis, MO, USA)분석법을 사용하였다. 세포들을 DMEM 배지에서 5×104 cells/well의 밀도로 현탁하여 0~0.
- 분석은 HPLC(Agilent 1200, Agilent, USA)와 Mass Spectrometry(API4000, AB Sciex, USA)를 사용하여 Table 2의 조건으로 시행하였다(Helio, 2008). 미네랄 성분(Ca, K, Fe) 함량은 식품공전의 미네랄 성분 분석법(KFDA 2005)에 따라 수행하였다. 유도결합플라즈마원자방출분광기(ICP-AES, PerkinElmer, Optima 8300, USA)를 사용하였으며, 분석조건은 Nebulizer gas flow : 0.
- 세포이동능 조사를 위해 IBIDI cell culture inserts(Integrated BioDiagnostics, GmbH, Munich, Germany)를 사용하여 scratch assay를 수행하였다(Kim 등 2011). 6-well plate에 IBIDI cell culture inserts를 넣고, 각각의 chamber에서 HaCaT 세포(4×104)를 24시간 동안 배양하였다.
- 검량선은 gallic acid(Sigma, St Louis, MO, USA)를 증류수에 용해시켜 위와 같은 방법으로 OD를 측정 하여 작성하였다. 총 플라보노이드 함량은 Moreno 등(2000) 의 방법에 따라 시료용액 0.5 mL를 시험관에 취하고, 여기에 diethylene glycol(Junsei Chemicals, Tokyo, Japan) 5 mL를 가하여 잘 혼합한 후 1 N NaOH 0.5 mL를 가하여 다시 잘 혼합하고, 37℃ 수조에서 1 h 동안 방치한 후 420 nm에서 OD를 측정하였다. 정량을 위한 검량선은 quercetin(Sigma, St Louis, MO, USA)을 사용하였다.
성능/효과
- Fig. 3에서와 같이, 대조군에 비해 50, 100 μg/mL의 삼잎국화 추출물을 처리하였을 경우, 약 2배 정도 피부세포의 이동능이 향상되는 것을 확인하였다.
- 다음으로, UVB 선량에 따른 HaCaT 세포의 세포독성을 조사하였다. HaCaT 세포에 UVB를 0~200 mJ/cm2로 조사한 후, 세포 독성 실험을 실시한 결과, UVB 조사량이 증가할수록 HaCaT 세포의 생존률이 유의 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B). UVB를 조사하지 않은 그룹의 생존률 100%에 비해 50 mJ/cm2 조사 시 44.
- 3). 결국, 이러한 결과들을 통하여 삼잎국화 추출물이 UVB에 의해 발생되는 세포내 ROS 생성을 억제하여 UVB에 의한 세포독성을 줄일 수 있을 것으로 판단된다.
- 로 조사한 다음, 세포 생존률을 살펴보았다. 그 결과, UVB에 의해 감소되는 생존률이 삼잎국화 추출물을 전처리한 경우에서는 대조군 수준의 생존률을 보였다(Fig. 1C).
후속연구
- 이와 함께 전 세계적으로 화장품 업계에서 비타민 A의 한 종류인 레티놀을 주원료로 한 anti-aging 화장품들을 출시하고 있다(Katsnelson 2015). 결국, 삼잎국화 추출물은 높은 함량의 비타민 A를 포함하고 있기 때문에 피부환경 개선을 위한 기능성 화장품 및 식품으로 개발할 수 있는 좋은 원료가 될 수 있을 것으로 판단된다.
- 이상의 결과들을 종합하여 볼 때, 삼잎국화 추출물은 UVB 와 이로 인해 발생하는 ROS로부터 피부세포를 보호할 수 있으며, 피부세포의 성장능과 이동능을 활성화시켜 피부세포의 생리활성 및 피부조직의 항상성을 유지하는데 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
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