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문제 정의
- 본 연구에서는 PF나 MMP 등 생체재료의 생체적합성이나 독성을 효과적으로 평가할 수 있는 세포배양시스템을 개발하고 이를 실제 적용함으로서 이들의 가능성을 연구하고자 하였다. 이러한 결과는 향후 지속적으로 증가할 것으로 예상되는 질병 치료용 생체재료의 효과적이고 신속한 평가를 위한 시스템으로서 매우 중요할 것으로 사료되며, 특히, 고분자나 금속 등 재질이나 두께에 상관없이 다양한 생체재료의 평가에 적용될 수 있어 의료공학적 소재개발에 크게 기여할 것으로 사료된다.
- 특히, 개발된 소재들은 임상실험에 적용하기 전에 세포를 이용하여 생체적합성이나 독성을 사전에 평가함으로서 소재의 성공 가능성과 시간을 단축시키는 연구들이 진행되고 있다. 본 연구는 의료소재의 평가과정에서 발생하는 문제점을 해결하고 신속하고 정확하게 소재의 특성을 평가하기 위한 연구의 일환으로 실시되었으며, 본 연구의 결과는 PF나 MP형태의 의료소재 평가를 위한 새로운 장치를 최초로 개발하고 이를 적용함으로서 그 가능성을 평가하였다.
- 실제 본 연구에서 여러가지 방법으로 필름을 부착시키고자 하였으나 대부분의 방법은 세포와 용기 사이의 중간층으로 세포들이 침투하여 정확히 표면에만 세포를 부착시키는 것은 거의 불가능하였다. 본 연구에서는 이러한 방법을 근원적으로 해결할 수 있도록 두 개의 판을 만들고 판사이에 평가하고자 하는 필름을 삽입하여 고정함으로서 크기에 상관없이 평가가 가능하고 세포의 모양도 관찰할 수 있는 배양시스템을 개발하고자 하였다.
- 본 연구에서 사용된 MMP는 콜라겐으로 코팅된 일반적인 세포배양용기와 유사한 세포 생존율을 나타내어 이전의 결과와 매우 유사하다. 비록, 세포의 종류에 차이가 있지만 본 연구에서는 섬유아세포에서 MMP의 세포생존율에 대한 새로운 정보를 제공하고 있다.
제안 방법
- 8 g의 NaHCO2를 첨가하여 용해하였다. 용해된 각각의 셀룰로오스용액은 각각 0.2 μm의 syringe 필터를 이용하여 필터한 후 자동필름코팅기(DAO-CO 02, Dao Technology, Korea)를 사용하여 일정한 두께로 유리판 위에 casting 한 뒤 메탄올에서 12시간 침지시킨 후 증류수로 수세하여 상온에서 24시간 동안 자연건조하였다.
- 0 wt%Zn 합금을 제조하였다. 합금 제조 시 산화 및 불순물 혼입을 방지하기 위하여 Ar가스로 충분히버블링한 후 용해하고 압연시켜 제조하였다.
- 개발된 세포배양시스템을 이용하여 바이오소재의 세포에 대한 효능 및 독성을 평가하기 위해, SCT-PF, SCTN-PF, MMP 등 3가지 종류를 선택하였다. 먼저, 3종류의 소재를 증류수와 1x PBS로 세척한 후 30분 동안 무균대(Clean bench, JS re- search Inc.
- 3가지 종류를 선택하였다. 먼저, 3종류의 소재를 증류수와 1x PBS로 세척한 후 30분 동안 무균대(Clean bench, JS re- search Inc., Korea)에서 UV조사를 실시하여 잔류미생물을 제거하였다. 세포배양장치는 세척 후 고압멸균기(Autocleave, 한신메디컬, Korea)를 이용하여 멸균하여 준비하고 SCT-PF와 SCTN-PFe 하판-필름-링-상판의 순서로 조립하였으며(Fig.
- , Korea)에서 UV조사를 실시하여 잔류미생물을 제거하였다. 세포배양장치는 세척 후 고압멸균기(Autocleave, 한신메디컬, Korea)를 이용하여 멸균하여 준비하고 SCT-PF와 SCTN-PFe 하판-필름-링-상판의 순서로 조립하였으며(Fig. 2A), MMP는 상판-링-막-하판의 순서로 조립하였다(Fig. 3A). 최종적으로 나사를 이용하여 상판과 하판을 고정시켰다.
- 3A). 최종적으로 나사를 이용하여 상판과 하판을 고정시켰다.
- )는 살아있는 세포 내 미토콘드리아 내막에 존재하는 oxido-reductase의 효소 작용에 의해 환원되어 보라색의 formazan을 형성하게 되는데, 용해액 내 보라색 formazan의 발색정도를 흡광도로 측정함으로써 세포 생존률을 예측하는 실험방법으로 이용되고 있다[8]. 먼저, 세포배양시스템에 SCT-PF, SCTN-PF, MMP를 삽입하여 장착한 후 1x PBS와 DMEM배지로 각 1회 세척한다. 여기에 SK- MEL-2 세포주를 2.
- 먼저, 세포배양시스템에 SCT-PF, SCTN-PF, MMP를 삽입하여 장착한 후 1x PBS와 DMEM배지로 각 1회 세척한다. 여기에 SK- MEL-2 세포주를 2.5×105 세포/well 농도로 분주하여 24시간 동안 37℃ 배양기에서 배양한 후 위상차 도립현미경(Leica Microsystems, Heerbrugg, Switzerland)을 이용하여 관찰하였다. 기존 배지를 제거한 후 새 배지와 MTT 용액을 첨가하여 4시간 동안 배양기에서 배양한다.
- 먼저, 개발된 세포배양장치가 PF의 세포생존율평가에 적용 가능한지를 평가하기 위하여, SCT-PF와 SCTN-PF를 장착한 후 MTT분석을 실시하였다. 셀룰로오스를 기반으로 제조된 2 가지 종류의 SCT-PF는 투명하고 유연성이 있어 하판-필름-실리콘링-상판으로 조립한 후 나사를 이용하여 고정하였다.
- MTT분석을 실시하였다. 셀룰로오스를 기반으로 제조된 2 가지 종류의 SCT-PF는 투명하고 유연성이 있어 하판-필름-실리콘링-상판으로 조립한 후 나사를 이용하여 고정하였다. 고정된 장치에 SK-MEL-2 세포를 분주하여 24시간 동안 관찰한 결과, 배지의 누출은 관찰되지 않았으며, 세포모양도 정상적 으로 관찰할 수 있었다.
- 개발된 세포배양장치가 금속막의 세포생존율평가에 적용 가능한지를 평가하기 위하여, 마그네슘 금속막인 MMP를 장착한 후 세포배양을 실시하였다. MMP는 불투명하고 단단하며 유연성이 없어서 상판-금속막-실리콘링-하판으로 조립한 후 나사를 이용하여 고정하였다.
- 후 세포배양을 실시하였다. MMP는 불투명하고 단단하며 유연성이 없어서 상판-금속막-실리콘링-하판으로 조립한 후 나사를 이용하여 고정하였다. 고정된 장치에 SK-MEL-2 세포를 분주하여 24시간 동안 관찰한 결과, 배지가 누출되는 부위는 관찰되지 않았으나, 불투명한 막으로 인해 세포 모양을 관찰할 수는 없었다.
- 방식으로 수행되고 있다. 셀룰로오스/콜라겐 하이드로겔 필름의 독성은 24 well plate의 각 well에 필름을 고정하고 NIH3T3 세포를 1, 3, 5일 동안 배양하여 MTT분석을 실시하여 평가하였다[2]. 미세막구조 실리콘 고무막(Micropo- rous silicone rubber membrane)의 독성은 0.
- 셀룰로오스/콜라겐 하이드로겔 필름의 독성은 24 well plate의 각 well에 필름을 고정하고 NIH3T3 세포를 1, 3, 5일 동안 배양하여 MTT분석을 실시하여 평가하였다[2]. 미세막구조 실리콘 고무막(Micropo- rous silicone rubber membrane)의 독성은 0.4 cm의 지름을 갖는 디스크로 절단한 막을 96 well plate에 고정하고 표면에 섬유아세포를 배양함으로서 평가하였다[21]. 그러나 실제 이러한 막을 세포배양 용기에 정확하게 부착시키는 세부적인 방법 등에 대한 기술은 없다.
대상 데이터
- 무기재료는 스테인레스강(Stainless steel), 코발트계 합금(Cobalt-Chrome alloys), 티타늄계합금(Titanium alloys) 등을 포함하는 금속재료와 Alumina, Titanium oxides, Carbones, Hydroxyapatite, Calcium phosphate 등을 포함하는 세라믹재료로 구분된다. 금속재료는 고강도와 내마모성이 우수하여 인공관절, 치근이식재, 골절 고정용핀, 나사 판, 와이어 등으로 사용되며, 세라믹재료는 생체적합성과 압축강도 등이 우수하여 인공관절 및 인공치아에 주로 적용된다[15].
- 되어있다. 상판은 9.6×9.6×2 cm의 규격으로 중앙에 2.5 cm의 지름을 갖는 9개의 세포배양용 well을 갖는 아크릴판 (Acryl plate)으로 제작하였고, 하판은 9.6×9.6×2.1 cm의 규격으로 상판의 well과 일치되는 부분에 실리콘의 링을 넣을 수 있는 깊이 1 mm의 홈을 9개 갖는 아크릴판으로 제작하였다. 실리콘링은 필름이나 막과 상판의 접착을 유지함으로서 배지의 유출을 방지하는 역할을 하며, 세포생존에 영향이 없는 실리콘 재질로서 지름은 2.
- 세포배양시스템을 테스트하기 위해, PFe 일반필름형태인 SCT-PF와 발포제로 NaHCO2를 첨가한 SCTN-PF를 제조하였고, MPe 마그네슘을 주성분으로하는 MMP를 준비하였다 [17]. 먼저, SCT-PF을 제조하기 위해, premixing한 [Amim] Cl (80 g)과 SCT분말(2.
- 또한, MMP는 마그네슘을 주 원료로 사용한 막으로 순도가 각각 99.8%, 99.5%, 99.99%의 마그네슘, 칼슘, 아연을 700℃에서 3시간 동안 충분한 교반(stirring)과 정치를 반복하며 94.6 wt%Mg-1.4 wt%Ca-4.0 wt%Zn 합금을 제조하였다. 합금 제조 시 산화 및 불순물 혼입을 방지하기 위하여 Ar가스로 충분히버블링한 후 용해하고 압연시켜 제조하였다.
- 세포 독성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 사용된 SK- MEL-2 세포주는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea) 에서분양 받아 사용하였다. SK-MEL-2 세포주는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), L-glutamine, pen- icillin 및 streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 함유한 Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium, Gibco)에 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
- 배양기에서 꺼낸 후 배지를 일부 제거하고 DMSO를 넣어 formazan을 충분히 녹인 후 96 well plate 로 배양액을 옮기고, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(control group)은 콜라겐-코팅된 24 well 일반 세포배양 용기(SPL life Science Co., Gyeonggido, Korea)에 세포를 동일하게 배양하여 사용하였다.
데이터처리
- 대조그룹과 실험그룹 사이에 통계적 유의성은 One-way ANOVA (SPSS for Windows, Release 10.10, Standard Ver- sion, Chicago, IL)를 이용하여 분석하였다. 모든 결과에서, p<0.
이론/모형
- Also, the viability of SK-MEL-2 cells on the polymer film was measured using MTT assays. Triplicate trials per group were evaluated by MTT assay. The data shown represent the means ± SD of three replicates.
성능/효과
- 10, Standard Ver- sion, Chicago, IL)를 이용하여 분석하였다. 모든 결과에서, p<0.05를 유의성이 있는 값으로 나타내었으며, 실험 결과는 means ± SD로 제시하였다.
- 고정된 장치에 SK-MEL-2 세포를 분주하여 24시간 동안 관찰한 결과, 배지의 누출은 관찰되지 않았으며, 세포모양도 정상적 으로 관찰할 수 있었다. 또한, MTT분석에서, 자연 건조과정으로 거쳐 제조된 SCT-PF에서 배양한 세포들이 대조군(콜라겐- 코팅 일반세포배양용기)과 유사한 성장율을 나타냄을 확인하였으며, 시간의 경과에 따라서도 이러한 생존율을 유지하였다. 그러나 발포제를 첨가하여 제조한 SCTN-PF에서 배양한 세포의 생존율은 24시간까지 대조군과 비교하여 유의적인 차이가 없었으나 48시간에는 생존율이 40.
- 또한, MTT분석에서, 자연 건조과정으로 거쳐 제조된 SCT-PF에서 배양한 세포들이 대조군(콜라겐- 코팅 일반세포배양용기)과 유사한 성장율을 나타냄을 확인하였으며, 시간의 경과에 따라서도 이러한 생존율을 유지하였다. 그러나 발포제를 첨가하여 제조한 SCTN-PF에서 배양한 세포의 생존율은 24시간까지 대조군과 비교하여 유의적인 차이가 없었으나 48시간에는 생존율이 40.9% 감소하였고 세포들도 원래형태를 유지하지 못하였다(Fig. 2B). 이러한 결과는 개발된 세포배양장치가 고분자막에 성공적으로 적용 가능함을 제시하고 있을 뿐만 아니라 발포제를 첨가한 SCTN-PF보다 SCT-PF가 보다 우수한 생체적합성을 나타냄을 제시하고 있다.
- 2B). 이러한 결과는 개발된 세포배양장치가 고분자막에 성공적으로 적용 가능함을 제시하고 있을 뿐만 아니라 발포제를 첨가한 SCTN-PF보다 SCT-PF가 보다 우수한 생체적합성을 나타냄을 제시하고 있다.
- 고정된 장치에 SK-MEL-2 세포를 분주하여 24시간 동안 관찰한 결과, 배지가 누출되는 부위는 관찰되지 않았으나, 불투명한 막으로 인해 세포 모양을 관찰할 수는 없었다. 그러나, MTT분석을 통해, MMP의 세포 생존율은 콜라겐-코팅 일반세포배양 용기에 비하여 10.3% 증가하였으나 통계적 유의성은 관찰되지 않았다(Fig. 3B). 이러한 결과는 개발된 세포배양장치가 금속막형태의 의료용 소재평가에 성공적으로 적용 가능함을 제시하고 있을 뿐만 아니라 MMP가 우수한 생체적합성을 나타냄을 제시하고 있다.
- 3B). 이러한 결과는 개발된 세포배양장치가 금속막형태의 의료용 소재평가에 성공적으로 적용 가능함을 제시하고 있을 뿐만 아니라 MMP가 우수한 생체적합성을 나타냄을 제시하고 있다.
- [5]. 하지만 본 연구에서 개발된 새로운 세포배양장치는 MP의 두께에 상관없이 적용이 가능하고, 금속을 일반적인 세포배양 용기의 well사이즈로 정확하게 절단할 필요가 없기 때문에 적용이 간편한 장점이 있다.
- 셀룰로오스를 기반으로 제조된 2 가지 종류의 SCT-PF는 투명하고 유연성이 있어 하판-필름-실리콘링-상판으로 조립한 후 나사를 이용하여 고정하였다. 고정된 장치에 SK-MEL-2 세포를 분주하여 24시간 동안 관찰한 결과, 배지의 누출은 관찰되지 않았으며, 세포모양도 정상적 으로 관찰할 수 있었다. 또한, MTT분석에서, 자연 건조과정으로 거쳐 제조된 SCT-PF에서 배양한 세포들이 대조군(콜라겐- 코팅 일반세포배양용기)과 유사한 성장율을 나타냄을 확인하였으며, 시간의 경과에 따라서도 이러한 생존율을 유지하였다.
후속연구
- 이러한 결과는 향후 지속적으로 증가할 것으로 예상되는 질병 치료용 생체재료의 효과적이고 신속한 평가를 위한 시스템으로서 매우 중요할 것으로 사료되며, 특히, 고분자나 금속 등 재질이나 두께에 상관없이 다양한 생체재료의 평가에 적용될 수 있어 의료공학적 소재개발에 크게 기여할 것으로 사료된다.
- 더불어 STC는 식품개발에도 적용되었으며, 이러한 식품에서 STC의 첨가는 제품의 강도와 경도를 증가시키고, 유연성과 탄력성도 증가시키는 효과를 나타내었다[4]. 본 연구에서는 개발된 세포배양장치를 이용하여 SCT-PF와 SCTN-PF의 생체적합성을 평가에 적용하였으며, SCT-PF가 높은 생체적합성을 나타냄을 제시하고 있어 이전의 연구결과와 매우 유사하며, 향후 동물실험을 통해 보다 구체적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 따라서, 이상의 결과를 종합해보면, 본 연구에서 개발한 새로운 세포배양 시스템은 다양한 재질의 필름이나 막형태의 의료용 소재를 편리하게 장착하여 생체적합성이나 독성을 평가할 수 있는 장치로서, PF나 MP 등 의료소재에도 성공적으로 사용될 수 있음을 제시하고 있다. 향후, 이러한 세포배양시스템은 인체질환이나 기능성 개선에 적용 가능한 다양한 의료용 소재의 연구와 실용화에 크게 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
- 수 있음을 제시하고 있다. 향후, 이러한 세포배양시스템은 인체질환이나 기능성 개선에 적용 가능한 다양한 의료용 소재의 연구와 실용화에 크게 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
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