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문제 정의
- 이전의 연구에 따르면 rDNA chromosome을 가지고 있는 YKY18R 균주에서 세포 성장속도의 저하와 함께 세포 life span도 감소했음을 알 수가 있는데[10], 이것은 rDNA cluster 내의 hyper-recombination에 의해 생성된 ERC의 축적이 그 원인이었다. 따라서 YKY18R 균주와 같은 수의 염색체를 가지는 YKY18 균주를 포함하여 YKY24 균주 및 성장속도의 저하를 보이는 YKY30 균주의 life span을 조사하여 성장속도와 life span과의 연관성을 조사해 보았다. 각 균주의 life span을 알아보기 위해 모세포에서 출아되는 딸세포의 수로 life span을 측정하는 replicative life span을 비교해 보았다.
- 하지만 염색체 수가 증가됨에 따라 균주의 성장 속도 저하가 관찰되었고, 이는 세포의 노화와도 깊은 관련이 있을 것이라 생각이 된다. 따라서 본 연구에서는 세포 내 염색체의 구조와 인공염색체를 포함한 총 염색체 수의 증가가 세포 노화에 미치는 영향을 조사하여 노화의 원인이 되는 새로운 senescence factor를 알아보고자 한다.
- 염색체 수가 각각 다른 균주들의 성장속도(specific growth rate, 비증식속도)를 비교하여 염색체 수가 균주의 성장속도에 미치는 영향에 대해서 조사해보았다. 일반적으로 자연계에 존재하는 정상적인 출아효모(haploid)는 16개의 염색체를 가지고 약 0.
제안 방법
- Southern hybridization을 위해 DNA를 Hybond-N+ membranes(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 transfer하였고 probe DNA는 41 nucleotide strand-specific sequence(TELO-G1: 5’-TGTGTGGTGTGTGGGTGTGTGTGGGTGTGTGGGTGTGTGGG-3’)를 포함하는 Y’ subtelomere DNA[11]를 사용하였다. Probe의 labelling과 signal detection은 Gene images 3’-oligolabelling과 CDP-Star detection system(Amersham Biosciences, UK)을 사용하여 수행하였다.
- 추출한 각각의 genomic DNA 2 μg을 XhoI 제한효소로 6시간 정도 처리하여 1% agarose gel 전기영동을 실시하고, telomere 영역 및 길이를 확인하기 위해 southern hybridization을 수행하였다. Southern hybridization을 위해 DNA를 Hybond-N+ membranes(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 transfer하였고 probe DNA는 41 nucleotide strand-specific sequence(TELO-G1: 5’-TGTGTGGTGTGTGGGTGTGTGTGGGTGTGTGGGTGTGTGGG-3’)를 포함하는 Y’ subtelomere DNA[11]를 사용하였다. Probe의 labelling과 signal detection은 Gene images 3’-oligolabelling과 CDP-Star detection system(Amersham Biosciences, UK)을 사용하여 수행하였다.
- 따라서 life span의 감소가 관찰된 균주에 대해서 telomere 길이의 변화를 측정해보았다. Telomere의 길이를 측정하기 위해 각 균주의 genomic DNA를 추출한 뒤, Y' subtelomere DNA 영역을 선택적으로 절단하는 XhoI 제한효소를 처리하고 전기영동 및 southern hybridization을 실시하였다. 그 결과, 염색체의 수가 증가될수록 telomere 길이의 다양성이 보임을 확인할 수 있었고(Fig.
- 따라서 YKY18R 균주와 같은 수의 염색체를 가지는 YKY18 균주를 포함하여 YKY24 균주 및 성장속도의 저하를 보이는 YKY30 균주의 life span을 조사하여 성장속도와 life span과의 연관성을 조사해 보았다. 각 균주의 life span을 알아보기 위해 모세포에서 출아되는 딸세포의 수로 life span을 측정하는 replicative life span을 비교해 보았다. FY833 균주와 YKY18 균주의 life span은 거의 차이가 나지 않았으나, YKY24 균주와 YKY30 균주는 점점 life span이 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig.
- 각 균주의 telomere 길이를 비교 측정해 보기 위해, 먼저 각각의 균주를 YPD 배지에서 18시간 정도 배양한 후, DNA miniprep method[3]를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 각각의 genomic DNA 2 μg을 XhoI 제한효소로 6시간 정도 처리하여 1% agarose gel 전기영동을 실시하고, telomere 영역 및 길이를 확인하기 위해 southern hybridization을 수행하였다.
- Telomere는 그 길이가 짧아지거나 telomere의 기능장애(dysfunction)가 일어났을 경우 염색체를 불안정하게 하고, 불안정해진 염색체는 서로 융합(fusion)되거나 세포자살(apoptosis)의 유도 및 세포주기(cell cycle)를 조절 및 정지하는 신호가 되어 세포사멸까지 가는 대표적인 노화의 원인으로도 잘 알려져 있다[1]. 따라서 life span의 감소가 관찰된 균주에 대해서 telomere 길이의 변화를 측정해보았다. Telomere의 길이를 측정하기 위해 각 균주의 genomic DNA를 추출한 뒤, Y' subtelomere DNA 영역을 선택적으로 절단하는 XhoI 제한효소를 처리하고 전기영동 및 southern hybridization을 실시하였다.
- 인공염색체를 가진 모든 효모 균주는 FY833(MATa ura3-52 his3Δ200 leu2Δ1 lys2Δ202 trp1Δ63) 균주[20]로부터 만들어졌으며, PCS 법을 사용하여 반복적으로 염색체의 splitting(하나의 염색체를 두 개의 인공염색체화 함)이 진행되었다. YKY18 균주는 FY833 균주의 16개 염색체를 두 번의 splitting을 수행하여 총 18개로 염색체화한 균주이며, YKY18R[10] 균주는 YKY18 균주와 같은 수의 염색체를 가지고 있지만 그 중 하나가 rDNA chromosome(rDNA cluster만으로 이루어진 인공염색체)의 형태로 가지고 있는 균주이다.
- 추출한 각각의 genomic DNA 2 μg을 XhoI 제한효소로 6시간 정도 처리하여 1% agarose gel 전기영동을 실시하고, telomere 영역 및 길이를 확인하기 위해 southern hybridization을 수행하였다. Southern hybridization을 위해 DNA를 Hybond-N+ membranes(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 transfer하였고 probe DNA는 41 nucleotide strand-specific sequence(TELO-G1: 5’-TGTGTGGTGTGTGGGTGTGTGTGGGTGTGTGGGTGTGTGGG-3’)를 포함하는 Y’ subtelomere DNA[11]를 사용하였다.
- 효모의 성장배지로는 YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 배지를 사용하였으며, 각 균주의 성장속도를 비교하기 위해서 모든 균주의 specific growth rate(비성장속도, μ) 값을 측정하였다. Specific growth rate 측정을 위해서, 모든 균주는 5 ml YPD 액체배지에서 16~24시간 동안 전 배양한 후, initial OD600가 0.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 균주는 Table 1에 나타내었다.
이론/모형
- Life span 측정을 위해서는 Kennedy et al.[9]에 보고된 방법을 사용하였다. Life span은 단일 모세포(single mother cell)에서 생성된 딸세포의 수를 counting하는 것으로 조사되었는데, micromanipulator(SINGER MSN system series 200, Singer instruments, UK)를 사용하여 모세포에서 출아되어 나온 각각의 딸세포를 하나씩 분리하고 제거하면서 그 수를 세었다.
성능/효과
- 각 균주의 life span을 알아보기 위해 모세포에서 출아되는 딸세포의 수로 life span을 측정하는 replicative life span을 비교해 보았다. FY833 균주와 YKY18 균주의 life span은 거의 차이가 나지 않았으나, YKY24 균주와 YKY30 균주는 점점 life span이 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 각 균주들의 평균 life span을 비교해 보면, YKY24 균주와 YKY30 균주에서 평균 life span이 wild type FY833 균주에 비해 약 14%와 45%가 감소된 29.
- 이전의 연구에서 염색체 분단 기술(chromosome splitting technique)을 이용하여 rDNA cluster의 양쪽 염색체 부분을 제거하고, rDNA를 12번 염색체로부터 분리하여 새로운 rDNA 반복서열만 가진 염색체(rDNA chromosome)를 구축하였다[10]. rDNA chromosome을 가진 균주의 경우, wild-type 균주에 비해 ERC의 양이 상대적으로 증가되었고, 핵소체의 형상 및 배치의 이상과 life span도 약 30% 정도 감소됨을 확인할 수 있었다. 이것은 rDNA cluster를 가진 염색체의 구조변화가 노화의 senescence factor가 될 수도 있다는 것을 보고한 최초의 예이다.
- 1). 각 균주들의 평균 life span을 비교해 보면, YKY24 균주와 YKY30 균주에서 평균 life span이 wild type FY833 균주에 비해 약 14%와 45%가 감소된 29.5와 18.9 generation을 보임을 알 수 있었다(Table 3). 이 결과는 성장속도의 감소와 노화의 진행 정도가 비례해서 나타남을 보여주는 결과이고, 특히 염색체 수가 2배 정도 증가된 YKY30 균주에서 급격한 life span의 감소를 보임을 알 수 있었다.
- Telomere의 길이를 측정하기 위해 각 균주의 genomic DNA를 추출한 뒤, Y' subtelomere DNA 영역을 선택적으로 절단하는 XhoI 제한효소를 처리하고 전기영동 및 southern hybridization을 실시하였다. 그 결과, 염색체의 수가 증가될수록 telomere 길이의 다양성이 보임을 확인할 수 있었고(Fig. 2), 특히 급격한 life span의 감소가 관찰되었던 YKY30 균주에서 telomere의 길이가 다소 줄어든 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2, lane 5). YKY18R 균주에서 보인 life span의 감소가 ERC의 축척에 의한 원인이었다면, YKY30 균주에서 보여진 life span의 감소는 염색체 수 증가에 의한 불완전한 세포분열 유도 및 증가된 인공염색체의 인공 telomere의 불안정에 의한 telomere 길이의 감소가 그 원인일 가능성을 생각할 수 있다.
- 45 h-1 정도의 specific growth rate를 나타낸다고 보고되어 있다[10, 15]. 본 연구에 사용된 FY833 균주(16개 염색체, host strain)의 경우, YPD 배지에서 3일간 배양하여 specific growth rate를 측정한 결과 0.44 h-1의 μ값을 나타내었고, 염색체 수가 늘어난 YKY18 균주(18개 염색체)와 YKY24 균주(24개 염색체)의 경우는 FY833 균주에 비해 약 10% 내외의 specific growth rate 감소가 관찰되었다(Table 2).
- 9 generation을 보임을 알 수 있었다(Table 3). 이 결과는 성장속도의 감소와 노화의 진행 정도가 비례해서 나타남을 보여주는 결과이고, 특히 염색체 수가 2배 정도 증가된 YKY30 균주에서 급격한 life span의 감소를 보임을 알 수 있었다. YKY30 균주에서는 인공적으로 만들어진 인공염색체를 포함하여 30개나 되는 염색체가 세포분열의 속도를 저하시켰을 가능성을 배제할 수 없으며, 또한 노화된 세포에서 보여지는 세포크기의 증가가 관찰되는 점도 life span 감소의 원인이라고 생각할 수 있다.
- 이 결과는 염색체 수가 인공 미니염색체를 포함하여 24개까지 증가되어도 성장속도에는 크게 영향을 미치지 않음을 시사하며, 염색체 수가 증가되어도 세포분열(mitotic division) 동안 염색체 segregation은 정상적으로 일어났음을 나타낸다. 하지만 염색체 수가 18개인 YKY18R 균주의 경우는 FY833 균주에 비해약 25% 정도 저하된 성장속도를 보였는데, 이는 증가된 염색체 수가 원인이 아니라 12번 염색체에서 분리된 rDNA chromosome의 rDNA cluster내 hyper-recombination 및 세포분열 동안 rDNA chromosome 자체의 부분결실에 의한 cell death가 원인일 것으로 생각되어진다[10].
- 한편, FY833 균주에 비해 염색체 수를 약 2배로 가지고 있는 YKY30 균주는 FY833 균주에 비해 거의 40% 이상 성장이 감소되었음을 확인할 수있었다. 이러한 결과는 염색체 31개를 가지는 SH6310 균주[16]의 specific growth rate가 0.25 h-1 정도인 수준과 비교하였을 때, 염색체를 30개 이상 가지는 균주는 세포분열시 염색체의 segregation 이상 및 일부 인공염색체의 결실 등으로 인해 세포 성장속도가 급속도로 저하될 수 있다는 것을 시사한다.
- 자연계에 존재하는 출아효모가 가지고 있는 염색체 외에 인위적인 인공염색체화를 통해 염색체 수를 최대 2배까지 증가시킨 균주는 wild-type 균주에 비해 저하된 성장속도를 보임을 확인하였는데, 이는 증가된 염색체들의 비정상적인 세포분열이 가장 큰 원인이라고 생각되어지지만, 부분적으로 일부 세포들의 노화와 관련된 phenotype일 가능성도 배제할 수 없다. 이전의 연구에 따르면 rDNA chromosome을 가지고 있는 YKY18R 균주에서 세포 성장속도의 저하와 함께 세포 life span도 감소했음을 알 수가 있는데[10], 이것은 rDNA cluster 내의 hyper-recombination에 의해 생성된 ERC의 축적이 그 원인이었다.
- 하지만 염색체 수가 18개인 YKY18R 균주의 경우는 FY833 균주에 비해약 25% 정도 저하된 성장속도를 보였는데, 이는 증가된 염색체 수가 원인이 아니라 12번 염색체에서 분리된 rDNA chromosome의 rDNA cluster내 hyper-recombination 및 세포분열 동안 rDNA chromosome 자체의 부분결실에 의한 cell death가 원인일 것으로 생각되어진다[10]. 한편, FY833 균주에 비해 염색체 수를 약 2배로 가지고 있는 YKY30 균주는 FY833 균주에 비해 거의 40% 이상 성장이 감소되었음을 확인할 수있었다. 이러한 결과는 염색체 31개를 가지는 SH6310 균주[16]의 specific growth rate가 0.
후속연구
- 또한 특정 물질 생산에 최적화된 생물시스템을 생산하기 위한 최적게놈공장(optimal genome factory) 또는 최소게놈공장(minimum genome factory)으로서 균주를 육종하기 위해서도 필요한 방법이라고 할 수 있다[16]. 따라서 다양한 목적으로 다수의 인공염색체를 제작할 경우, 증가된 인공염색체가 세포의 성장속도 및 life span의 감소에 영향을 미칠 수 있다는 것을 본 연구를 통해 확인할 수 있었고, 이는 자연계에 존재하지 않는 다양한 게놈 구성을 가진 균주의 안정적인 개량을 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것이라 기대한다.
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