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문제 정의
- 본 연구에서는 백삼복합물(WGCE)의 항천식 효능을 확인하고자 난알부민으로 유도한 천식 동물에 대한 연구를 실시한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 7 세포에서 활성산소(Reactive oxygen species, ROS)와 산화질소(Nitric oxide), Th1 염증성 사이토카인(Inflammatory cytokine) TNF-α, IL-1β 등에서 효능을 확인하였다[7]. 이에 따라 백삼복합물이 알레르기 염증성 질환에도 효능이 있을 것이라 판단되어 알레르기 염증반응의 대표적인 질병인 천식을 난알부민으로 유도한 동물 모델을 통해 혈청 내 cytokine, 난알부민-특이 IgE, 혈액 내 호산구 및 기관지 세포(BALF) 내 총세포수 등을 확인함과 동시에 한의학계에서도 노력하고 있는[8,9] 근거 중심대체의학(ECAM; Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine)에 대한 융복합 연구를 통해 임상 또는 문헌으로만 전해 내려오는 본 복합물에 대한 과학적 데이터를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 실험을 종료한 후 ethyl ether로 마취한 상태에서 심장천자법으로 채혈한 다음 15분간 3,000 rpm에서 원심 분리해서 혈청을 분리하였다. IL-4, IL-5, IL-13 농도를 custom-made 6-plex cytokine Milliplex panel을 이용해서 다음과 같이 측정하였다. 50배 희석한 혈청 25 ㎕씩 각 well에 분주하고 matrix buffer, assay buffer 및 antibody-immobilized beads를 각 25 ㎕ 가해 혼합한 뒤 2시간 동안 실온에서 반응시키고 2회에 걸쳐 washing 완충 용액을 이용해 세척하였다.
- 3 ㎖씩 실험 시작일로부터 7일 간격으로 하루에 1번 0일, 7일, 14일에 마우스에게 복강으로 주사 하였다. 또한 마지막 복강 주사 7일 후인 21일부터 마우스를 50x15x50 ㎝ 크기의 아크릴상자 안에 넣고 2 ㎎/㎖ OVA용액을 네블라이저(nebulizer)기기를 이용하여 격일간격으로 1일 3회(각 15분씩 3회) 21, 23, 25, 27, 29일에 분사함으로써 호흡을 통한 천식을 유발하였다. 실험군은 아무것도 처리하지 않는 정상군과 천식 유발 후 증류수만을 경구 투여하는 대조군, WGCE 100, 300 ㎎/㎏(이하, WGCE 100, WGCE 300)의 농도로 경구 투여하는 실험군으로 그룹을 나누어 2주간 진행하였다.
- 다시 plate를 5회 세척한 다음 각 well에 기질용액인 TMB를 넣어 10분 동안 암실상태에서 반응시킴으로써 발색을 유도하였다. 반응이 끝난 후 각 well에 정지액을 50 ㎕씩 넣어 효소반응을 정지시킨 후 micro plate reader의 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 혈청 내 IgE의 농도는 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
- 실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 채혈한 전혈을 통해 자동혈구계산기로 호산구의 함량을 분석하였다.
- 또한 마지막 복강 주사 7일 후인 21일부터 마우스를 50x15x50 ㎝ 크기의 아크릴상자 안에 넣고 2 ㎎/㎖ OVA용액을 네블라이저(nebulizer)기기를 이용하여 격일간격으로 1일 3회(각 15분씩 3회) 21, 23, 25, 27, 29일에 분사함으로써 호흡을 통한 천식을 유발하였다. 실험군은 아무것도 처리하지 않는 정상군과 천식 유발 후 증류수만을 경구 투여하는 대조군, WGCE 100, 300 ㎎/㎏(이하, WGCE 100, WGCE 300)의 농도로 경구 투여하는 실험군으로 그룹을 나누어 2주간 진행하였다.
- 알레르기성 천식 동물모델을 제작하기 위해 먼저, 난알부민(ovalbumin, chicken egg albumin; OVA) 1 ㎎을 PBS와 수산화알루미늄 겔[Al(OH)3 gel]을 1:1 비율로 혼합한 용액을 0.3 ㎖씩 실험 시작일로부터 7일 간격으로 하루에 1번 0일, 7일, 14일에 마우스에게 복강으로 주사 하였다. 또한 마지막 복강 주사 7일 후인 21일부터 마우스를 50x15x50 ㎝ 크기의 아크릴상자 안에 넣고 2 ㎎/㎖ OVA용액을 네블라이저(nebulizer)기기를 이용하여 격일간격으로 1일 3회(각 15분씩 3회) 21, 23, 25, 27, 29일에 분사함으로써 호흡을 통한 천식을 유발하였다.
- 폐포 세척액으로부터 세포를 분리하기 위해 10% FBS/DMEM 배양액 1㎍/㎖을 넣은 주사기를 기관지 (trachea)에 주입시키고 끈으로 묶어 고정한 후 3회 순환 시켜 분리하고 ACK 용액을 37℃에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시켰다. 이를 다시 배지로 세척한 후 0.04% trypan blue로 염색한 후 총세포수를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 백삼복합물(White Ginseng Complex Extract 이하, WGCE로 표기)의 구성 약재들은 금산약재 시장에서 구입하였고, 백삼, 오미자, 맥문동, 길경, 감초각 50g을 혼합한 WGCE(250 g)에 증류수 4.5 L를 넣어 97℃에서 10시간 동안 환류추출을 한 후 여과액을 rotary vacuum evaporator로 감압 농축하였다. 농축된 용액을 freeze dryer로 동결 건조하여 분말18.
- 시약은 Dulbecco's phosphate buffered saline(D-PBS : Welgene, Korea), ether (Sigma Co., U.S.A.), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM : Gibco BRL Co., U.S.A.), 우태아혈청 (fetal bovine serum: FBS, Invitrogen Co., U.S.A.), trypan blue (Sigma Co., U.S.A.), Mouse cytokine milliplex map immunoassay kit (Millipore Co., U.S.A.), Mouse OVA specific IgE ELISA kit (Biolegend Co., U.S.A.), Diff-Quick stain set(Sysmex Co., U.S.A), Albumin from chicken egg white(Sigma Co., U.S.A), Aluminium hydroxigen gel (Sigma Co., U.S.A) 등을 사용하였으며, 기기는 자동혈구계산기(Advia 120, Bayer, Germany), Luminex (Millipore Co., U.S.A.) 등을 사용하였다.
- 실험동물인 수컷 6주령의 BALB/c 수컷 생쥐(20∼22g)를 ㈜라온바이오에서 공급 받았으며 실험 당일까지 충분한 고형사료 (㈜퓨리나)와 물을 공급하고 온도 22 ± 2℃, 습도 55 ± 15%, 12시간-12시간(light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test와 ANOVA를 사용하여 통계처리 하였고 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 그 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 실험을 종료한 후 ethyl ether로 마취한 상태에서 심장천자법으로 채혈한 다음 15분간 3,000 rpm에서 원심 분리해서 혈청을 분리하였다. 혈청으로부터 난알부민-특이 IgE 항체의 농도를 측정하기 위해 ELISA 방법을 수행하였다. 먼저 96-well flatbottom ELISA plate에 0.
성능/효과
- 넷째, 백삼복합물은 BALF 내 총 세포수를 대조군에 비해 유의성 있게 감소시켰다.
- 둘째, 백삼복합물은 혈청 내 난알부민 특이-IgE 생성을 대조군에 비해 유의성 있게 감소시켰다.
- 본 연구에서 난알부민으로 유도한 천식 동물 모델에게 WGCE를 100, 300 ㎎/㎏의 농도로 2주간 경구 투여한결과, 혈청 내 IL-4, 난알부민 특이-IgE, 혈액 내 호산구 및 BALF 내 총 세포수에서 유의성 있게 감소하였으며, 혈청 내 IL-5, IL-13 역시 감소하였으나 유의성을 나타내지는 않았다.
- 셋째, 백삼복합물은 혈액 내 호산구를 대조군에 비해 유의성 있게 감소시켰다
- 실험 종료 후 BALF 내 총 세포수를 측정한 결과, 정상군은 0.8±0.2 ×105 cells, 대조군은 6.2±0.2 ×105 cells로나타낸 반면, WGCE 100은 4.5±0.7 ×105 cells, WGCE 300은 2.7±0.5 ×105 cells로 나타나, WGCE 100과 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (** : p<0.01, * : p<0.05) 감소하였다[Fig. 4].
- 실험 종료 후 혈액 내 호산구를 측정한 결과, 정상군은 2.8±1.5%, 대조군은 12.1±4.0%로 나타낸 반면, WGCE 100은 6.2±2.1%, WGCE 300은 5.1±2.0%로 나타나, WGCE 100과 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (* : p<0.05) 감소하였다[Fig. 3].
- 실험 종료 후 혈청 내 IL-4 cytokine을 측정한 결과, 정상군은 4.6±4.6 pg/㎖, 대조군은 34.9±6.1 pg/㎖로 나타낸 반면, WGCE 100은 29.6±4.7 pg/㎖, WGCE 300은 13.4±1.2 pg/㎖로 나타나, WGCE 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (** : p<0.01) 감소하였다[Fig. 1A].
- 실험 종료 후 혈청 내 난알부민 특이-IgE를 측정한 결과, 정상군은 1.7±0.6 ng/㎖, 대조군은 11.8±0.8 ng/㎖로 나타낸 반면, WGCE 100은 9.4±0.4 ng/㎖, WGCE 300은 7.8±0.5 ng/㎖로 나타나, WGCE 100과 300은 대조군에 비해 유의성 있게 (** : p<0.01, * : p<0.05) 감소하였다[Fig. 2].
- 이와 같은 결과는 WGCE가 T세포를 Th2세포로 분화를 촉진하며 알레르기성 염증 초기반응의 주요한 매개체인 B 세포를 활성화시키고 형질 세포로 분화시켜 IgE를 생성 및 수용체 발현 증가에 중요한 IL-4를 감소시킴에 따라 Th2 세포와 특이 IgE의 결합을 저해시켜 천식의 대표적인 증상인 호산구와 BALF의 수를 저해하는 것으로 사료된다. 다만, 본 연구에서 호산구와 BALF의 수가 유의성 있게 감소하였음에도 불구하고 호산구 증가와 IL-4와 비슷한 역할을 하며 천식의 대표적 cytokine인 IL-5 및 IL-13은 결과적으로 감소가 나타났으나 유의성이 나타나지 않았던 부분은 추후 심도 있는 연구를 통해 밝혀내고자 한다.
- 이와 같은 연구 결과는 백삼복합물이 알레르기 염증성 cytokine과 특이-IgE 생성을 감소시킴으로써 천식의 특징인 호산구와 BALF 내 총 세포 수 감소에 효능이 있다는 것이 실험적으로 증명되었다. 따라서 백삼복합물은 천식뿐만 아니라 기관지와 관련된 질환에 있어 효과적인 복합물임을 시사하고 있다.
- 첫째, 백삼복합물은 혈청 내 IL-4 cytokine을 대조군에 비해 유의성 있게 감소시켰다.
후속연구
- 이와 같은 결과는 WGCE가 T세포를 Th2세포로 분화를 촉진하며 알레르기성 염증 초기반응의 주요한 매개체인 B 세포를 활성화시키고 형질 세포로 분화시켜 IgE를 생성 및 수용체 발현 증가에 중요한 IL-4를 감소시킴에 따라 Th2 세포와 특이 IgE의 결합을 저해시켜 천식의 대표적인 증상인 호산구와 BALF의 수를 저해하는 것으로 사료된다. 다만, 본 연구에서 호산구와 BALF의 수가 유의성 있게 감소하였음에도 불구하고 호산구 증가와 IL-4와 비슷한 역할을 하며 천식의 대표적 cytokine인 IL-5 및 IL-13은 결과적으로 감소가 나타났으나 유의성이 나타나지 않았던 부분은 추후 심도 있는 연구를 통해 밝혀내고자 한다.
- 이는 이전 폐 질환과 면역에 대한 연구들에서 호흡기능 및 체간자세 개선, 필라테스 등 운동 분야와의 치료적 융복합을 통해 다양한 연구가 가능할 것으로 판단된다[20,21,22,23]. 또한, 향 후 항천식 효능에 대한 심도 있는 기전 확인과 임상에 대한 심화연구가 진행된다면 천식치료제로써의 가능성이 있을 것이라 판단된다.
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