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문제 정의
- 따라서 이번 연구는 전북에서 사육 중인 육용종계에서의 MG와 MS의 감염 상황을 파악하기 위해, 육용종계 농장에서 수집한 시료를 대상으로 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)와 polymerase chain reaction (PCR) 검사를 실시하여 MG와 MS에 대한 항체 및 유전자 양성률을 조사하고자 실시하였다.
제안 방법
- ELISA 역가는 kit에서 제공하는 술식[log10 Titer=1.09(log10 S/P)+3.36]으로 계산하여 시료의 1,077∼4,999, 5,000∼9,999, 10,000∼19,999, 20,000이상으로 각각 항체역가의 수준을 등급화하고 평균 항체가(geometricmean titer, GMT)를 비교하였다.
- 증균 배양액 1 mL을 14,000 x g에 10분간 원심하고 상층액을 버리고, 침전물에 멸균 PBS 1 mL을 가하여 세척하고 다시 원심한 후 상층액을 버리고 25 μL의 멸균 증류수를 넣어서 부유시킨 후 100℃에서 10분간 가열 후 다시 14,000 x g에서 5분간 원심하고 상층액만 채취하여 DNA를 추출하였다. PCR은 HS Prime Taq Premix (GENETBIO, Daejeon)를 이용하여 실시하였다. Upstream primer (10 pmoles/μL) 1 μL, downstream primer (10 pmoles/μL) 1 μL, 추출한 DNA용액 5 μL, 멸균 증류수를 3 μL넣어 반응 볼륨을 20 μL되도록 하고, Table 1과 같은 조건 하에 BIO-RAD C1000 Thermal Cycler를 이용하여 PCR을 실시하였다.
- Upstream primer (10 pmoles/μL) 1 μL, downstream primer (10 pmoles/μL) 1 μL, 추출한 DNA용액 5 μL, 멸균 증류수를 3 μL넣어 반응 볼륨을 20 μL되도록 하고, Table 1과 같은 조건 하에 BIO-RAD C1000 Thermal Cycler를 이용하여 PCR을 실시하였다.
- 닭 Mycoplasma 배양을 위해 멸균 면봉으로 뒷 콧구멍 틈새 내 삼출물을 채취하여 10% 돼지혈청(ThermoFisher Scientific, Seoul, Korea)이 첨가된 pleuropneumonia-like organism broth (Difco, Franklin Lakes, USA) 증균배지에 현탁시켜 37℃에서 10일간 배양하였다.
- 증균 배양액 1 mL을 14,000 x g에 10분간 원심하고 상층액을 버리고, 침전물에 멸균 PBS 1 mL을 가하여 세척하고 다시 원심한 후 상층액을 버리고 25 μL의 멸균 증류수를 넣어서 부유시킨 후 100℃에서 10분간 가열 후 다시 14,000 x g에서 5분간 원심하고 상층액만 채취하여 DNA를 추출하였다.
대상 데이터
- 2015년 전라북도에 위치하는 백신접종(MS) 경력이 없는 육용종계 및 원종계 농장을 대상으로, 채혈 및 닭의 뒷 콧구멍 틈새(choanal cleft)에서 면봉을 이용하여 시료를 채취하였다. 분리된 혈청은 56℃에서 30분간 비동화 후 ELISA 검사 전까지 −20℃에서 냉동보관하였고 유전자검사용 면봉은 배양 전까지 −70℃에서 보관하였다.
- 닭 Mycoplasma병에 대한 항체 검사는 ELISA를 이용하여 실시하였다. IDEXX사(Maine, USA)의 MG ELISA kit와 MS ELISA kit를 사용하였으며, 실험방법은 제품의 사용설명서에 기술한 대로 실시하였다. 혈청을 희석액으로 500배 희석하여 항원이 코팅된 plate에 100 μL씩 분주하고 실온에서 30분간 반응시킨 후 세척액 350 μL로 5회 세척을 실시한 후 anti-IBD: horseradish peroxidase conjugate를 100 μL씩 분주하고 실온에서 30분간 반응시켰다.
이론/모형
- 닭 Mycoplasma병에 대한 항체 검사는 ELISA를 이용하여 실시하였다. IDEXX사(Maine, USA)의 MG ELISA kit와 MS ELISA kit를 사용하였으며, 실험방법은 제품의 사용설명서에 기술한 대로 실시하였다.
성능/효과
- 그러나 항체검사 결과는 조사농장의 16농가 중 75% 항체가 양성농장으로 확인되었다. 49계군 중 65.3% 계군에서 항체를 보유하고 있었으며 개체별로는 약 15.7%가 항체 양성이었으며 평균 항체가는 802.2로 조사되었다(Table 2). 모든 시료에서 MG 유전자 검사가 음성으로 나온 것은 낮은 개체별 MG 항체 양성률, 시료 채취 및 증균 방법, 검출방법의 민감도와 관련이 있을 것으로 사료된다.
- 7±2426로 확인되었다. MG 유전자는 검출되지 않았으나 MS의 경우 검사농가 94% (17/18)에서 유전자를 검출할 수 있었고, 개체별로는 62.6% (733/1,170)의 유전자 양성률을 보였다. 따라서 전북도내에 MS에 대한 백신접종이 시급하며, 양계농가의 철저한 방역과 예방이 필요하다는 결론을 얻었다.
- MG 혈청검사 결과 양성반응을 보인 12농가 32동 930수에 대한 유전자검사 결과 항체가 형성됨에도 불구하고 모든 시료에서 MG 유전자를 검출할 수 없었다. 그러나 MS의 경우 검사농가 94% (17/18)에서 유전자를 검출할 수 있었으며(Fig.
- MG와 MS 항체검사 결과 농장별로는 75% (12/16), 94% (31/33)로, 계군별로는 65.3% (32/49), 84.2% (80/95)의 항체양성률을 보였고, 개체별은 15.7% (232/1,469), 50.4% (1,436/2,852)의 항체양성률을 보였다(Table 2). 개체별 MG에 대한 평균 항체역가는 802.
- MG의 경우 Kang 등(2014)의 보고와 금번 검사 결과를 비교 할 때 계군별 양성률은 약간 낮았으나, 개체별 항체 형성률은 약 59.2%로 큰 차이를 보이는 것으로 조사되었고, MG 평균항체가는 이번 조사에서는 802.2±626, Kang 등(2014)의 보고에서 2,474±2,045로 각각 조사되어 2014년 조사에 비하여 감염률이 감소하고 계군 간 면역 격차가 줄어들었다는 것을 확인 할 수 있었다.
- 향후 연구를 통해 MG 유전자 검사법을 체계화하고 개선할 계획이다. MS의 경우 33농가 중 2개의 농장을 제외한 94%의 농가에서 양성으로 조사 되었고, 95계군 중 84.2%의 계군에서 항체가를 검출할 수 있었으며 개체별로 50.4%가 항체를 가지고 있었으며 평균항체가는 27,726으로 확인되었다(Table 3). 유전자 검사결과 2개의 농장을 제외하고 94%의 농장에서 유전자가 검출되었다.
- 개체별 MG에 대한 평균 항체역가는 802.2±626로 항체양성률을 보인 232수 중 5수는 10,000이상의 높은 항체역가를 나타내었다.
- 개체별 MG와 MS에 대한 평균 항체역가는 802.2±626와 27,726.7±2426로 확인되었다.
- 6% (733/1,170)의 유전자 양성률을 보였다. 따라서 전북도내에 MS에 대한 백신접종이 시급하며, 양계농가의 철저한 방역과 예방이 필요하다는 결론을 얻었다.
- 유전자 검사결과 2개의 농장을 제외하고 94%의 농장에서 유전자가 검출되었다. 또한 39계군중 82%의 계군에 유전자가 검출되었으며 개체별로는 62.6%에서 유전자가 검출 되었다(Table 4). Kang 등(2014)은 전북지역 종계에서의 MG와 MS에 대한 계군별로 각각 71.
- 이번 조사에서 전북지역의 육용종계에 대한 MG유전자 검사결과 12농가 32계군 모두 음성으로 판명되었다. 그러나 항체검사 결과는 조사농장의 16농가 중 75% 항체가 양성농장으로 확인되었다.
후속연구
- 2로 조사되었다(Table 2). 모든 시료에서 MG 유전자 검사가 음성으로 나온 것은 낮은 개체별 MG 항체 양성률, 시료 채취 및 증균 방법, 검출방법의 민감도와 관련이 있을 것으로 사료된다. 향후 연구를 통해 MG 유전자 검사법을 체계화하고 개선할 계획이다.
- 모든 시료에서 MG 유전자 검사가 음성으로 나온 것은 낮은 개체별 MG 항체 양성률, 시료 채취 및 증균 방법, 검출방법의 민감도와 관련이 있을 것으로 사료된다. 향후 연구를 통해 MG 유전자 검사법을 체계화하고 개선할 계획이다. MS의 경우 33농가 중 2개의 농장을 제외한 94%의 농가에서 양성으로 조사 되었고, 95계군 중 84.
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