[논문]단층 및 입체 세포배양환경에서 세슘, 스트론튬 및 코발트가 세포 독성에 미치는 영향 분석

김지용; 강성민; 장성찬; 허윤석; 노창현

doi:10.11626/kjeb.2016.34.2.107

단층 및 입체 세포배양환경에서 세슘, 스트론튬 및 코발트가 세포 독성에 미치는 영향 분석
The Effects of Cesium, Strontium and Cobalt on Cell Toxicity in the 2D and 3D Cell Culture Platforms 원문보기

환경생물 = Korean journal of environmental biology, v.34 no.2, 2016년, pp.107 - 115

김지용 (한국원자력연구원 첨단방사선연구소 생명공학연구부) , 강성민 (한국원자력연구원 첨단방사선연구소 생명공학연구부) , 장성찬 (한국원자력연구원 첨단방사선연구소 생명공학연구부) , 허윤석 (인하대학교 생명공학과) , 노창현 (한국원자력연구원 첨단방사선연구소 생명공학연구부)

초록
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전 세계적으로 원자력 발전소는 442기가 가동 중이며, 62기가 충원될 예정이다. 원자력 발전소의 증가에 따라 방사성 폐기물 유출에 대한 위험성도 증가하였다. 이러한 이유 때문에, 방사성 폐기물의 처리는 인간, 동물, 식물을 포함하는 자연 생태계를 보전하는 관점에서 중요하다. 또한, 방사성 폐기물 유출은 그 지역뿐만 아니라 전 세계적으로 심각한 문제를 야기한다. 본 연구는 입체 배양세포에 방사성 핵종원소(세슘, 스트론튬, 코발트)를 처리하였고 이에 대한 영향력을 확인하였다. 입체 배양 구조체는 아가로오스 하이드로겔을 이용하여 제작했으며 암세포 및 정상세포 (HeLa, HepG2, COS-7)를 사용하여 입체 배양을 실시 하였다. 입체 형태로 세포를 배양한 후 세슘, 스트론튬, 코발트 농도 변화에 따라 세포 생존능력을 분석하였다. 이때 입체 배양세포에서 생존능력이 단층 배양세포 보다 최대 42% 우수한 것을 확인하였다. 입체 배양구조체는 세포가 형태 및 생리학적으로 in vivo환경인 조직과 비슷하게 배양을 가능하게 하였다. 따라서, 입체 배양구조체는 기존의 단층 배양 한계점인 in vivo 환경에 적용시킬 수 없다는 한계를 극복하였다. 본 입체 배양 기술이 중금속 독성평가 및 단시간 내에 다수의 물질 분석을 수행하는 고속 대량 스크리닝 기술에 활용될 것으로 기대한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Currently, there are 442 operating nuclear power plants in the world, and 62 more are under construction. According to this reasoning, the treatment of radioactive waste is important to prevent the environmental ecosystem including humans, animals, and plants. Especially, a leakage of radioactive waste causes not only regional problem but also serious global one. In this study, we demonstrate the effect of radioisotopes (e.g., cesium, strontium, and cobalt) on a 3D culture cell. To develop the 3D cell culture system, we used a 96-well-culture plate with biocompatible agarose hydrogel. Using this method, we can perform the 3D cell culture system with three different cell lines such as HeLa, HepG2, and COS-7. In addition, we conducted a cell viability test in the presence of radioisotopes. Interestingly, the 3D morphological cells showed 42% higher cell viability than those on the 2D against cesium. This result indicates that the 3D platform provides cells morphological and physiological characteristic similar to in vivo grown tissues. Moreover, it overcomes the limitation of conventional cell culture system that can't reflect in vivo systems. Finally, we believe that the proposed approach can be applied a new strategy for simple high-throughput screening and accurate evaluation of metal toxicity assay.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서, 본 연구는 아가로오스 지지체 기반 삼차원 입체 세포배양 기술을 이용하여 암세포와 정상세포로 구성되어있는 삼차원 체내 환경 모사 구조체를 구현하였다. 또한, 기존의 세포 배양방법인 단층 세포배양과 본 실험에서 제작된 입체 배양구조체에 세슘, 스트론튬, 코발트를 노출시킴으로써 방사성 핵종 원소의 영향력을 정량적으로 평가하였다.
또한, 방사성 폐기물 유출은 그 지역뿐만 아니라 전 세계적으로 심각한 문제를 야기한다. 본 연구는 입체 배양세포에 방사성 핵종원소(세슘, 스트론튬, 코발트)를 처리하였고 이에 대한 영향력을 확인하였다. 입체 배양 구조체는 아가로오스 하이드로겔을 이용하여 제작했으며 암세포 및 정상세포(HeLa, HepG2, COS-7)를 사용하여 입체 배양을 실시 하였다.
본 연구에서는 아가로오스 하이드로겔을 이용하여 입체배양구조체를 제작하였으며, 동일한 배양접시에 입체 배양구조체와 기존의 단층 세포 배양방법을 구현함으로써 세슘, 스트론튬, 코발트에 대한 세포의 생존능력을 관찰할 수 있는 실시간 다중분석 시스템을 개발하였다. 입체 배양구조체를 통해 3차원 입체 배양이 가능하며 3차원 배양 세포에 외부환경 방해인자(세슘, 스트론튬, 코발트)를 처리하였을 때 모든 투여군에서 단층 배양 세포보다 외부환경 방해인자에 대하여 생존능력이 우수한 것을 흡광도 분석 및 세포 형광염색을 통해 정성, 정량적으로 보여주었다.

제안 방법

Fig. 3과 같이 세슘, 스트론튬, 코발트와 같은 다양한 외부환경 방해인자로 작용하는 방사성 핵종 원소를 처리함으로써 세포 생존능력을 분석하였다. 이는 곧, 우리가 살고 있는 자연계에서 충분히 일어날 수 있는 방사성 핵종 오염으로 해석될 수 있으며, 실험은 세슘, 스트론튬, 코발트를 0.
Fig. 6과 같이 입체 배양구조체에서 세슘 농도에 따른 세포 생존능력을 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kits(live: Calcein acetoxymethyl ester, Calcein-AM, dead: Ethidium homodimer-1, Ethd-1)을 사용하여 형광 분석을 수행하였다. 입체 배양구조체에서 48시간 동안 배양된 세포를 50 mg L^-1 세슘 환경에 6시간 동안 노출했으며, 세포 사멸이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
각 세포들은 24시간 후에 제작된 입체 배양구조체에서 3차원 구조를 갖는 구 형태로 배양되는 것을 광학 현미경 (Leica DFC500 R2 Digital Camera & SW Kit, Germany) 이미지 분석을 통해 확인하였다.
이를 이용하여 입체 배양구조체 내부에 1시간, 24시간 10 μl씩 처리함으로써 실험을 수행하였다. 그 후 CCK8 시약을 이용하여 세포 생존능력을 분석하였다(Fig. 1). 각 세포들은 24시간 후에 제작된 입체 배양구조체에서 3차원 구조를 갖는 구 형태로 배양되는 것을 광학 현미경 (Leica DFC500 R2 Digital Camera & SW Kit, Germany) 이미지 분석을 통해 확인하였다.
추출된 세포들은 1×10⁵ mL^-1의 농도로 입체 배양구조체 내부에 100 μl 씩 분주 후 48시간 동안 이산화탄소 배양기에서 삼차원 세포배양을 실시하였다. 다양한 농도의 방사성 핵종 원소는 세슘 (Cs⁺; 1000 mg L^-1, 7.52 mM), 스트론튬 (Sr²⁺; 1000 mgL^-1, 11.5 mM), 코발트(Co²⁺; 1000 mg L^-1, 17.0 mM) 기준용액을 배지에 희석하여 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 mg L^-1의 농도를 만들었다. 이를 이용하여 입체 배양구조체 내부에 1시간, 24시간 10 μl씩 처리함으로써 실험을 수행하였다.
세포들을 배양하기 위한 배지는 Gibco (NY, USA)에서 구매한 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), FBS (Fetal bovine serum), PS(penicillin-streptomycin)를 사용하였다. 또한 각 세포에 방사성 핵종 원소 농도에 따른 세포 생존능력을 알아보기 위해 세슘 (Cs⁺), 스트론튬 (Sr²⁺), 코발트 (Co²⁺)는 KANTO Chemical (Tokyo, Japan)에서 구매한 기준용액 (standard solution, 1000 mg L^-1)을 배지로 희석시켜 다양한 농도의 용액을 제조하였으며, 이에 대한 확인을 위해 CCK-8 (Cell Counting Kit-8) 시약과 형광시약 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kits를 Dojindo (Tokyo, Japan), Invitrogen(Eugene, UK)에서 각각 구매하여 분석에 이용하였다.
따라서, 본 연구는 아가로오스 지지체 기반 삼차원 입체 세포배양 기술을 이용하여 암세포와 정상세포로 구성되어있는 삼차원 체내 환경 모사 구조체를 구현하였다. 또한, 기존의 세포 배양방법인 단층 세포배양과 본 실험에서 제작된 입체 배양구조체에 세슘, 스트론튬, 코발트를 노출시킴으로써 방사성 핵종 원소의 영향력을 정량적으로 평가하였다.
5, 1, 5, 10, 50 mg L^-1의 농도를 갖도록 배지에 희석해 48시간 이상 배양시킨 세포로 단시간(1시간) 동안 노출함으로써 수행되었다. 생존능력이 우수할수록 주황색 포르마잔을 더욱 더 많이 형성하므로, 이를 통해 Fig. 3A-C와 같이 실시간 비교/분석을 수행할 수 있었다. 직선회귀법 (linear regression analysis)을 통한 단층 배양세포의 25% 치사량(lethal dose, LD₂₅)을 분석의 척도로 사용하였으며, 실험 결과 다양한 세슘 농도에 따른 서로 다른 세포의 25% 치사량 농도는 HeLa: 8 mg L^-1, HepG2: 10 mg L^-1, COS-7: 1.
세슘, 스트론튬, 코발트 처리시간 증가에 따른 세포 생존능력을 확인하고자 Fig. 4와 같이 단층 배양세포와 입체 배양구조체에 세슘, 스트론튬, 코발트를 24시간 동안 처리하였다. 세슘, 스트론튬, 코발트를 24시간 처리 하였을때 25% 치사량 농도는 단층 배양세포에서 세슘 처리를 하였을 때 HeLa: 15 mg L^-1, HepG2: 1.
세슘, 스트론튬, 코발트에 대한 세포 생존능력을 확인하기 위해 CCK8 시약을 이용하여 세포 염색을 수행하였고, micro plate reader (Infinite®, Tecan Co, Switzerland)를 사용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
세포 생존능력을 확인함에 있어 세포 배가시간이 주요 변수로 작용함을 증명하기 위해 50 mg L^-1 농도의 세슘을 단층 배양세포와 입체 배양세포에 노출시킴으로써 시간에 따른 각각의 세포 생존능력을 확인하였다(Fig. 5). 세슘 처리 후 1시간 동안 HeLa 암세포는 입체 배양세포에서 32%, 단층 배양세포에서 48%가 사멸하는 경향성을 보이며(Fig.
3과 같이 세슘, 스트론튬, 코발트와 같은 다양한 외부환경 방해인자로 작용하는 방사성 핵종 원소를 처리함으로써 세포 생존능력을 분석하였다. 이는 곧, 우리가 살고 있는 자연계에서 충분히 일어날 수 있는 방사성 핵종 오염으로 해석될 수 있으며, 실험은 세슘, 스트론튬, 코발트를 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 mg L^-1의 농도를 갖도록 배지에 희석해 48시간 이상 배양시킨 세포로 단시간(1시간) 동안 노출함으로써 수행되었다. 생존능력이 우수할수록 주황색 포르마잔을 더욱 더 많이 형성하므로, 이를 통해 Fig.
이를 이용하여 입체 배양구조체 내부에 1시간, 24시간 10 μl씩 처리함으로써 실험을 수행하였다.
2A). 이를 통해 Fig. 2B와 같이 하나의 세포배양 시스템 내에서 2차원과 3차원 세포배양을 동시에 수행할 수 있는 다중 배양시스템을 구축하였다. 일반적으로 이차원 세포 배양은 Fig.
입체 배양 구조체 내부에서 세포들의 삼차원 입체배양은 광학 현미경을 이용하여 확인하였다. 세슘, 스트론튬, 코발트에 대한 세포 생존능력을 확인하기 위해 CCK8 시약을 이용하여 세포 염색을 수행하였고, micro plate reader (Infinite®, Tecan Co, Switzerland)를 사용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
입체 배양 구조체는 아가로오스 하이드로겔을 이용하여 제작했으며 암세포 및 정상세포(HeLa, HepG2, COS-7)를 사용하여 입체 배양을 실시 하였다. 입체 형태로 세포를 배양한 후 세슘, 스트론튬, 코발트 농도 변화에 따라 세포 생존능력을 분석하였다. 이때 입체 배양세포에서 생존능력이 단층 배양세포 보다 최대 42% 우수한 것을 확인하였다.
분석 원리는 CCK-8(테트라졸리움염, tetrazolium salt) 물질이 세포 내 탈수소효소 (dehydrogenase)에 의한 환원 (reduction)을 통해 주황색 포르마잔 (formazan)을 형성하여 흡광도 분석을 통해 세포 생존능력 확인이 가능하다. 추가적으로 형광이미지 분석은 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kits (live: Calcein acetoxymethyl ester, Calcein-AM, dead: Ethidium homodimer-1, Ethd-1) 시약 처리 후 공초점 현미경(CLSM; Cal Zeiss, LSM 800, Germany)을 이용하여 관찰하였다. 분석 원리는 세포 내의 에스테라아제 (esterase) 효소가 Calcein-AM의 AM (acetoxymethyl ester) 작용기를 분해시켜 활성된 Calcein 화합물이 세포 내부의 칼슘(Ca²⁺) 이온과 결합을 통해 형광(λ_em =517)을 발하게 되며, Ethd-1은 세포사멸에 의한 세포막 파괴를 통해 핵의 DNA와 결합함으로써 형광(λ_em =617 nm)을 발하게 된다.
추출된 세포들은 1×105 mL-1의 농도로 입체 배양구조체 내부에 100 μl 씩 분주 후 48시간 동안 이산화탄소 배양기에서 삼차원 세포배양을 실시하였다.

대상 데이터

본 실험에서 사용한 입체 배양구조체는 다음과 같다(Fig. 2A). 이를 통해 Fig.
세포 배양에 사용된 배지는 500 mL DMEM에 10% FBS, 1% PS로 구성되어 있으며 HeLa, HepG2, COS-7 세포들을 60×15 mm 원형 배양접시 Corning (NY, USA)에서 72시간 동안 이산화탄소 배양기(CO2 incubator)를 통해 배양하였다.
입체 배양구조체를 만들기 위한 배양 접시(96-well-culture plate)는 SPL(Gyeonggido, Korea)에서 구매하였고, 지지체로 쓰이는 아가로오스는 BMA(ME, USA)에서 구매하였다. 세포들을 배양하기 위한 배지는 Gibco (NY, USA)에서 구매한 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), FBS (Fetal bovine serum), PS(penicillin-streptomycin)를 사용하였다. 또한 각 세포에 방사성 핵종 원소 농도에 따른 세포 생존능력을 알아보기 위해 세슘 (Cs⁺), 스트론튬 (Sr²⁺), 코발트 (Co²⁺)는 KANTO Chemical (Tokyo, Japan)에서 구매한 기준용액 (standard solution, 1000 mg L^-1)을 배지로 희석시켜 다양한 농도의 용액을 제조하였으며, 이에 대한 확인을 위해 CCK-8 (Cell Counting Kit-8) 시약과 형광시약 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kits를 Dojindo (Tokyo, Japan), Invitrogen(Eugene, UK)에서 각각 구매하여 분석에 이용하였다.
암세포인 자궁경부암세포 (adenocarcinoma, HeLa), 간암세포 (hepatocellular carcinoma, HepG2), 정상 세포인 원숭이 신장표피세포 (monkey kidney fibroblast, COS-7)는ATCC (VA, USA)에서 구매하였다. 입체 배양구조체를 만들기 위한 배양 접시(96-well-culture plate)는 SPL(Gyeonggido, Korea)에서 구매하였고, 지지체로 쓰이는 아가로오스는 BMA(ME, USA)에서 구매하였다.
본 연구는 입체 배양세포에 방사성 핵종원소(세슘, 스트론튬, 코발트)를 처리하였고 이에 대한 영향력을 확인하였다. 입체 배양 구조체는 아가로오스 하이드로겔을 이용하여 제작했으며 암세포 및 정상세포(HeLa, HepG2, COS-7)를 사용하여 입체 배양을 실시 하였다. 입체 형태로 세포를 배양한 후 세슘, 스트론튬, 코발트 농도 변화에 따라 세포 생존능력을 분석하였다.
암세포인 자궁경부암세포 (adenocarcinoma, HeLa), 간암세포 (hepatocellular carcinoma, HepG2), 정상 세포인 원숭이 신장표피세포 (monkey kidney fibroblast, COS-7)는ATCC (VA, USA)에서 구매하였다. 입체 배양구조체를 만들기 위한 배양 접시(96-well-culture plate)는 SPL(Gyeonggido, Korea)에서 구매하였고, 지지체로 쓰이는 아가로오스는 BMA(ME, USA)에서 구매하였다. 세포들을 배양하기 위한 배지는 Gibco (NY, USA)에서 구매한 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), FBS (Fetal bovine serum), PS(penicillin-streptomycin)를 사용하였다.

데이터처리

All values are mean±standard deviation (SD). Results were analyzed by one-way ANOVA tests. # vs.
또한, 동일한 96-well-culture plate의 2차원과 3차원 세포 배양에서 세슘, 스트론튬, 코발트에 따른 세포 독성평가를 일원배치 분산분석법(one-way ANOVA test)을 통해 분석하였으며, p<0.05의 수준에서 유의성을 검정하였다.
또한, 일원배치 분산분석법(one-way ANOVA test)을 사용하여 통계 분석한 결과 세슘, 스트론튬, 코발트에 대한 처리 농도가 높아질수록 유의함을 확인하였다(p<0.05).

성능/효과

본 결과를 통해 세슘에 대한 저항성(resistance)은 HeLa 암세포가 COS-7 정상세포보다 우수하며, 장시간 관찰결과 모든 세포에서 세포 생존능력이 향상됨을 확인할 수 있다. 그리고 단층 배양을 통한 세포들이 입체 배양세포보다 생존능력이 기하 급수적으로 향상되었다. 본 실험을 통해 세포의 배가시 간이 세포 생존능력에 영향을 끼치며, 정상세포보다 암세포가 외부환경 방해인자에 저항성이 우수함을 확인할 수 있었다.
위 추측에 대한 근거로써 본 그룹에서 조사결과 각각의 세포 배가시간은 HeLa: 24시간, HepG2: 20시간, COS-7: 18시간 임을 확인하였다. 따라서, 세포 배가시간이 짧은 COS-7 세포의 세포 분열이 다른 세포들보다 월등하게 일어나 상대적으로 세포 생존능력이 향상된 것으로 보인다. 또한, 일원배치 분산분석법(one-way ANOVA test)을 사용하여 통계 분석한 결과 세슘, 스트론튬, 코발트에 대한 처리 농도가 높아질수록 유의함을 확인하였다(p<0.
입체 배양구조체는 세포가 형태 및 생리학적으로 in vivo환경인 조직과 비슷하게 배양을 가능하게 하였다. 따라서, 입체 배양구조체는 기존의 단층 배양 한계점인 in vivo 환경에 적용시킬 수 없다는 한계를 극복하였다. 본 입체 배양 기술이 중금속 독성평가 및 단시간 내에 다수의 물질 분석을 수행하는 고속 대량 스크리닝 기술에 활용될 것으로 기대한다.
또한, 세포의 농도를 증가시킨 입체 배양세포의 세포 군집(1×107 cells mL-1)은 상대적으로 적은 세포 농도를 갖는 군집(1×105 cells mL-1)보다 사멸이 증가하는 것을 확인할 수 있다(Fig. 6C).
5B). 본 결과를 통해 세슘에 대한 저항성(resistance)은 HeLa 암세포가 COS-7 정상세포보다 우수하며, 장시간 관찰결과 모든 세포에서 세포 생존능력이 향상됨을 확인할 수 있다. 그리고 단층 배양을 통한 세포들이 입체 배양세포보다 생존능력이 기하 급수적으로 향상되었다.
그리고 단층 배양을 통한 세포들이 입체 배양세포보다 생존능력이 기하 급수적으로 향상되었다. 본 실험을 통해 세포의 배가시 간이 세포 생존능력에 영향을 끼치며, 정상세포보다 암세포가 외부환경 방해인자에 저항성이 우수함을 확인할 수 있었다.
5). 세슘 처리 후 1시간 동안 HeLa 암세포는 입체 배양세포에서 32%, 단층 배양세포에서 48%가 사멸하는 경향성을 보이며(Fig. 5A), 정상세포인 COS-7는 입체 배양세포에서 73% 단층 배양세포에서 80%의 세포사멸이 유도됨을 확인하였다(Fig. 5B). 본 결과를 통해 세슘에 대한 저항성(resistance)은 HeLa 암세포가 COS-7 정상세포보다 우수하며, 장시간 관찰결과 모든 세포에서 세포 생존능력이 향상됨을 확인할 수 있다.
4와 같이 단층 배양세포와 입체 배양구조체에 세슘, 스트론튬, 코발트를 24시간 동안 처리하였다. 세슘, 스트론튬, 코발트를 24시간 처리 하였을때 25% 치사량 농도는 단층 배양세포에서 세슘 처리를 하였을 때 HeLa: 15 mg L^-1, HepG2: 1.3 mg L^-1, COS-7: 20 mg L^-1으로 나타났고, 스트론튬에 대한 25% 치사량 농도는 HeLa: 16mg L^-1, HepG2: 8 mg L^-1, COS-7: 5 mg L^-1, 코발트의 25% 치사량 농도는 HeLa: 8 mg L^-1, HepG2: 4 mg L^-1, COS-7: 4mg L^-1으로 확인하였다(Fig. 4A-C). 앞서 실험한 1시간 처리 결과와 비교하였을 때 24시간 처리한 25% 치사량 농도값은 최대 15배 이상 향상됨을 확인하였다.
4A-C). 앞서 실험한 1시간 처리 결과와 비교하였을 때 24시간 처리한 25% 치사량 농도값은 최대 15배 이상 향상됨을 확인하였다. 이는 곧 세슘, 스트론튬, 코발트와 같은 외부환경 방해인자에 장시간 동안 노출되어도 세포사멸(apoptosis)이 유도되지 않음을 의미하며 역으로 세포 생존능력이 증가함을 보였다.
4C를 통해 정상세포인 COS-7에서 생존능력이 두드러지게 증가됨을 확인할 수 있으며, 이는 세포 배가시간(doubling time)에 의한 세포성장이 주요 원인으로 작용됨을 추측할 수 있다. 위 추측에 대한 근거로써 본 그룹에서 조사결과 각각의 세포 배가시간은 HeLa: 24시간, HepG2: 20시간, COS-7: 18시간 임을 확인하였다. 따라서, 세포 배가시간이 짧은 COS-7 세포의 세포 분열이 다른 세포들보다 월등하게 일어나 상대적으로 세포 생존능력이 향상된 것으로 보인다.
앞서 실험한 1시간 처리 결과와 비교하였을 때 24시간 처리한 25% 치사량 농도값은 최대 15배 이상 향상됨을 확인하였다. 이는 곧 세슘, 스트론튬, 코발트와 같은 외부환경 방해인자에 장시간 동안 노출되어도 세포사멸(apoptosis)이 유도되지 않음을 의미하며 역으로 세포 생존능력이 증가함을 보였다. Fig.
입체 형태로 세포를 배양한 후 세슘, 스트론튬, 코발트 농도 변화에 따라 세포 생존능력을 분석하였다. 이때 입체 배양세포에서 생존능력이 단층 배양세포 보다 최대 42% 우수한 것을 확인하였다. 입체 배양구조체는 세포가 형태 및 생리학적으로 in vivo환경인 조직과 비슷하게 배양을 가능하게 하였다.
2010). 이를 통해 삼차원 현상을 갖는 세포 군집은 세슘, 스트론튬, 코발트와 같은 외부환경 방해인자로부터 우수한 세포 생존능력을 보여줌을 확인하였다.
6C). 이를 통해 한정된 공간에서 세포 농도의 증가는 세포와 세포간의 뭉침 현상이 물리적 스트레스로 작용하여 세포 사멸이 단시간 내에 유도됨을 의미하며, 본 이미지 분석을 바탕으로 구조체를 구성하는 세포 개체농도는 세포 생존능력에 영향력이 있음을 확인할 수 있다.
2 mg L^-1으로 확인되었다. 이와 대조적으로 입체 배양된 세포의 25% 치사량은 코발트 처리를 통한 COS-7: 50 mgL^-1에서 나타남을 확인하였으며, 입체 배양세포는 단층 배양된 세포보다 최대 42%의 높은 생존능력을 보여주었다(Fig. 3C). 이를 통해 입체 배양세포가 우수한 생존률을 보이는 이유는 세포 응집을 통한 세포-세포간의 상호작용 거리가 단축됨으로써 면역을 담당하는 인터류킨(interleukin), 생식을 담당하는 케모카인(chemokine)과 같은 생물활성 단백질이 활발하게 분비됨으로써 인위적 외부환경 자극으로부터 방어가 가능하기 때문이다(Luca Mariotti et al.
본 연구에서는 아가로오스 하이드로겔을 이용하여 입체배양구조체를 제작하였으며, 동일한 배양접시에 입체 배양구조체와 기존의 단층 세포 배양방법을 구현함으로써 세슘, 스트론튬, 코발트에 대한 세포의 생존능력을 관찰할 수 있는 실시간 다중분석 시스템을 개발하였다. 입체 배양구조체를 통해 3차원 입체 배양이 가능하며 3차원 배양 세포에 외부환경 방해인자(세슘, 스트론튬, 코발트)를 처리하였을 때 모든 투여군에서 단층 배양 세포보다 외부환경 방해인자에 대하여 생존능력이 우수한 것을 흡광도 분석 및 세포 형광염색을 통해 정성, 정량적으로 보여주었다. 본 기술은 체외 (in vitro)에서 간접적으로 체내(in vivo)를 모사 할 수 있기 때문에 방사성 핵종 원소 영향 평가 뿐만 아니라, 약물 독성 능력평가 및 신약개발을 위한 플랫폼 기술로 활용될 수 있을 것으로 보인다.
6과 같이 입체 배양구조체에서 세슘 농도에 따른 세포 생존능력을 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kits(live: Calcein acetoxymethyl ester, Calcein-AM, dead: Ethidium homodimer-1, Ethd-1)을 사용하여 형광 분석을 수행하였다. 입체 배양구조체에서 48시간 동안 배양된 세포를 50 mg L^-1 세슘 환경에 6시간 동안 노출했으며, 세포 사멸이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 6A, B). 또한, 세포의 농도를 증가시킨 입체 배양세포의 세포 군집(1×10⁷ cells mL^-1)은 상대적으로 적은 세포 농도를 갖는 군집(1×10⁵ cells mL^-1)보다 사멸이 증가하는 것을 확인할 수 있다(Fig.
3A-C와 같이 실시간 비교/분석을 수행할 수 있었다. 직선회귀법 (linear regression analysis)을 통한 단층 배양세포의 25% 치사량(lethal dose, LD₂₅)을 분석의 척도로 사용하였으며, 실험 결과 다양한 세슘 농도에 따른 서로 다른 세포의 25% 치사량 농도는 HeLa: 8 mg L^-1, HepG2: 10 mg L^-1, COS-7: 1.5 mg L^-1, 스트론튬 농도에 따른 세포 25% 치사량 농도는 HeLa: 0.7 mg L^-1, HepG2: 4 mg L^-1, COS-7: 0.5 mg L^-1, 그리고 코발트의 25% 치사량 농도는 HeLa: 0.6 mg L^-1, HepG2: 5 mg L^-1, COS7: 1.2 mg L^-1으로 확인되었다. 이와 대조적으로 입체 배양된 세포의 25% 치사량은 코발트 처리를 통한 COS-7: 50 mgL^-1에서 나타남을 확인하였으며, 입체 배양세포는 단층 배양된 세포보다 최대 42%의 높은 생존능력을 보여주었다(Fig.

후속연구

그 후 아가로오스 포면 위로 피브로넥틴(fibronectin), 셀렉틴(selection),그리고 콜라겐(collagen)과 같은 세포막 표면 단백질의 부착이 이루어지기 때문에 세포간의 인위적 응집이 이루어진다. 그러므로 본 시스템은 실시간으로 서로 다른 배양 환경에서의 비교 및 분석이 수월하며, 이를 통해 보다 정확한 분석이 가능하다는 장점을 갖는다.
입체 배양구조체를 통해 3차원 입체 배양이 가능하며 3차원 배양 세포에 외부환경 방해인자(세슘, 스트론튬, 코발트)를 처리하였을 때 모든 투여군에서 단층 배양 세포보다 외부환경 방해인자에 대하여 생존능력이 우수한 것을 흡광도 분석 및 세포 형광염색을 통해 정성, 정량적으로 보여주었다. 본 기술은 체외 (in vitro)에서 간접적으로 체내(in vivo)를 모사 할 수 있기 때문에 방사성 핵종 원소 영향 평가 뿐만 아니라, 약물 독성 능력평가 및 신약개발을 위한 플랫폼 기술로 활용될 수 있을 것으로 보인다.
따라서, 입체 배양구조체는 기존의 단층 배양 한계점인 in vivo 환경에 적용시킬 수 없다는 한계를 극복하였다. 본 입체 배양 기술이 중금속 독성평가 및 단시간 내에 다수의 물질 분석을 수행하는 고속 대량 스크리닝 기술에 활용될 것으로 기대한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	세슘-137 피폭 시 인체에 끼치는 영향은 무엇인가?	세슘-137와 스트론튬-90는 생체 필수 원소인 칼륨(K+)과 칼슘(Ca2+)의 화학적 성질 및 거동이 유사하기 때문에 인간을 포함한 생태계를 구성하고 있는 유기체(organism) 내부로 쉽게 흡수된다. 이를 통해 세슘-137의 피폭은 과잉 자극 감수성(hyperirritability)과 발작 및 사망에 이르게 되며, 스트론튬-90은 골수 암 (acute myeloid leukemia)과 백혈병 (leukemia), 그리고 과잉 축적으로 인한 유전적 돌연변이 등을 유발할 수 있다(Chen 1997). 그리고 코발트-60에 의한 장기간 노출은 속 쓰림 및 어지러움증, 심하면 국부적 피부괴사(necrosis)를 유발한다(Seymour1997).
	코발트-60에 장기간 노출 시 발생하는 병증은 무엇인가?	이를 통해 세슘-137의 피폭은 과잉 자극 감수성(hyperirritability)과 발작 및 사망에 이르게 되며, 스트론튬-90은 골수 암 (acute myeloid leukemia)과 백혈병 (leukemia), 그리고 과잉 축적으로 인한 유전적 돌연변이 등을 유발할 수 있다(Chen 1997). 그리고 코발트-60에 의한 장기간 노출은 속 쓰림 및 어지러움증, 심하면 국부적 피부괴사(necrosis)를 유발한다(Seymour1997). 이러한 방사성 핵종 원소의 생물학적 영향력 및 이를 통해 유발되는 문제에 대한 해결방법 개선을 위해 다양한 세포 및 배양방법을 이용하여 방사성 핵종 원소들에 대한 세포 생존능력을 분석하는 연구에 관심이 집중되고 있다(Avery 1995; Mothersill and Seymour 1997).
	예상하지 못한 천재지변 및 방사성 폐기물에 의한 원자력 발전소의 위험성의 예를 보여주는 사건은 무엇이 있는가?	하지만, 예상하지 못한 천재지변 및 방사성 폐기물에 의한 원자력 발전소의 위험성은 범국제적 문제로 화제가 되고 있는 상황이며 이에 대한 대책이 시급한 실정이다. 대표적인 예를 들면 1979년 미국의 스리마일 섬 원전사고, 1986년 우크라이나 체르노빌 원전사고, 그리고 최근 2011년 일본의 후쿠시마 원전사고를 통해 대량의 방사성 물질(radioactive material)이 유출되는 재난이 발생되었다(Hirose 2012). 이중에서 핵분열 생성물인 세슘-137(137Cs), 스트론튬-90(90Sr), 코발트-60(60Co)의 대량유출이 심각한 문제로 집중되고 있으며, 주로 대기 및 토양, 그리고 해수 등에 치명적인 환경 오염 및 파괴를 야기시킨다 (Mosquera et al.

참고문헌 (28)

Avery SV. 1995. Caesium accumulation by microorganisms: uptake mechanisms, cation competition, compartmentalization and toxicity. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 14:76-84.
Chakraborty D, S Maljim, A bandyopadhyay and S Basu. 2007. Biosorption of cesium-137 and strontium-90 by mucilaginous seeds of Ocimum basilicum. Bioresour. Technol. 98:2949-2952.

상세보기
Chen JP. 1997. Batch and continuous adsorption of strontium by plant root tissues. Bioresour. Technol. 60:185-189.

상세보기
Daneshmandi S, SP Dibazar and S Fateh. 2016. Effects of 3-dimensional culture conditions(collagen-chitosan nano-scaffolds) on maturation of dendritic cells and their capacity to interact with T-lymphocytes. J. immunotoxicl. 13:235-242.

상세보기
Ehsan SM, KM Welch-Reardon, ML Hughes and SC George. 2014. A three-dimensional in vitro model of tumor cell intravasation. Integr. Biol. 6:603-610.

상세보기
Haessler U, Y Kalinin, MA Swartz and M Wu. 2009. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices 11:827-835.

상세보기
Hirose K. 2012. 2011 Fukushima Dai-ichi nuclear power plant accident: summary of regional radioactive deposition monitoring results. J. Environ. Radioact. 111:13-17.

상세보기
Jeong HH, YG Kim, SC Jang, H Yi and CS Lee. 2012. Profiling surface glycans on live cells and tissues using quantum dot-lectin nanoconjugates. Lab Chip. 12:3290-3295.

상세보기
Kim J, JR Staunton and K Tanner. 2016. Independent Control of Topography for 3D Patterning of the ECM Microenvironment. Adv. Mater. 28:132-137.

상세보기
Kurth I, K Franke, T Pompe, M Bornhauser and C Werner. 2009. Hematopoietic stem and progenitor cells in adhesive microcavities. Integr. Biol. 1:427-434.

상세보기
Lee JH. 2016. pp 020001. Status and prospect of NDT technology for nuclear energy industry in Korea. 42ND ANNUAL REVIEW OF PROGRESS IN QUANTITATIVE NONDESTRUCTIVE EVALUATION: Incorporating the 6th European-American Workshop on Reliability of NDE. Korea.
Lee W, D Kwon, W Choi, GY Jung and S Jeon. 2015. 3D-printed microfluidic device for the detection of pathogenic bacteria using size-based separation in helical channel with trapezoid cross-section. Sci. Rep. 5:7717.

상세보기
Loessner D, JA Flegg, HM Byrne, J Clements and D Hutmacher. 2013. Growth of confined cancer spheroids: a combined experimental and mathematical modelling approach. Integr. Biol. 5:597-605.

상세보기
Luca M, F Angelica, A Daniele, B Aless, R Elena and O Andrea. 2010. Effects of ionizing radiation on cell-to-cell communication. Radiat. Res. 174:280-289.

상세보기
Marelli B, C Alessandiron, G Freddi and S Nazhat. 2014. Anionic fibroin-derived polypeptides accelerate MSC osteoblastic differentiation in a three-dimensional osteoid-like dense collagen niche. J. Mater. Chem. B. Mater. Biol. Med. 2:5339-5343.

상세보기
Mercey E, P Obeid, D Glaise, ML Calvo-Munoz, C Guguen-Guillouzo and B Fouque. 2010. The application of 3D micropatterning of agarose substrate for cell culture and in situ comet assays. Biomaterials 31:3156-3165.

상세보기
Mosquera B, C Carvalho, R Veiga, L Mangia and R Anjos. 2006. 137 Cs distribution in tropical fruit trees after soil contamination. Environ. Exp. Bot. 55:273-281.

상세보기
Mothersill C and C Seymour. 1997. Medium from irradiated human epithelial cells but not human fibroblasts reduces the clonogenic survival of unirradiated cells. Int. J. Radiat. Biol. 71:421-427.

상세보기
Munarin F, S Guerrerio, M Grellier, M Tanzi, M Barbosa, P Petrini and P Granja. 2011. Pectin-based injectable biomaterials for bone tissue engineering. Biomacromolecules 12:568-577.

상세보기
Persidis A. 1998. High-throughput screening. Nat. Biotechnol. 16:488-489.

상세보기
Seo SJ, IY Kim, YJ Choi, T Akaike and CS Cho. 2006. Enhanced liver functions of hepatocytes cocultured with NIH 3T3 in the alginate/galactosylated chitosan scaffold. Biomaterials 27:1487-1495.

상세보기
Seymour CM. 1997. Survival of human epithelial cells irradiated with cobalt 60 as microcolonies or single cells. Int. J. Radiat. Biol. 72:597-606.

상세보기
Shen Z, J Bi, D Nguyen, CJ Xian, H Zhang and S Dai. 2012. Exploring thermal reversible hydrogels for stem cell expansion in three-dimensions. Soft Matter 8:7250-7257.

상세보기
Smith BH, LS Gazda, BL Conn, K Jain, S Asina, DM Levine, TS Parker, MA Laramore, PC Martis and HV Vinerean. Three-dimensional culture of mouse renal carcinoma cells in agarose macrobeads selects for a subpopulation of cells with cancer stem cell or cancer progenitor properties. Cancer Res. 71:716-724.
Song K, HH Jeong, SH Jin, JS Park and CS Lee. 2014. Optimization of microwell-based cell docking in microvalve integrated microfluidic device. BioChip J. 8:227-233.

상세보기
Torisawa YS, B Mosadegh, GD Luker, M Morell, KS O'Shea and S Takayama. 2009. Microfluidic hydrodynamic cellular patterning for systematic formation of co-culture spheroids. Integr. Biol. 1:649-654.

상세보기
Zhang W, T Liu, X Hu and J Gond. 2012. Novel nanofibrous composite of chitosan-CaCO 3 fabricated by electrolytic biomineralization and its cell biocompatibility. RSC Adv. 2:514-519.

상세보기
Zhu YG and E Smolders. 2000. Plant uptake of radiocaesium: a review of mechanisms, regulation and application. J. Exp. Bot. 51:1635-1645.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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