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문제 정의
- 약리작용에 대한 연구는 라디칼 소거 활성 및 LDL 산화 억제를 보이는 항산화 활성에 관한 연구14-15), 산화스트레스와 연관된 당뇨 합병증을 예방하는 효과16), 지방분해활성을 촉진하는 항비만 효과17) 등이 보고되어있다. 본 연구는 荷葉의 항산화 효과와 피부 탄력 및 주름 개선에 관련된 콜라겐 생합성 촉진 및 분해억제효능 확인하기 위해 DPPH, ABTS+, Superoxide anion radical 라디컬소거능과 자외선 조사한 섬유아세포(CCD-986sk) cell에서 MMP-1 저해활성을 조사하였다.
- 본 연구는 연의 잎(荷葉)의 항산화 및 항노화 효능을 조사하였고 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 측정하였다. CCD-986sk 세포에 NN-L 에탄올 추출물 1, 5, 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하여 48시간 처리한 결과 5, 10, 50, 100 μg/mL 농도구간에서 100%에 가까운 세포 생존율을 확인하였다. 실험결과(Fig 5)에 따라 50 μg/mL 이하 농도에서 MMP-1 저해 활성 측정과 단백질 발현 실험을 하였다.
- CCD-986sk 세포에서 NN-L 에탄올 추출물이 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 이용한 세포 생존율을 측정하였다. CCD-986sk 세포에 NN-L 에탄올 추출물 1, 5, 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하여 48시간 처리한 결과 5, 10, 50, 100 μg/mL 농도구간에서 100%에 가까운 세포 생존율을 확인하였다.
- 측정하였다. Fibroblast (CCD-986sk) cell를 96 well plate에 5×103 cells/ml이 되게 seeding하고 PBS을 첨가한 다음 자외선을 조사하고 시료를 농도별로 20 μL 처리한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 48시간 배양하였다. 배양 후 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 20 μL를 첨가하여 3시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well 당 DMSO 150 μL를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 분리된 단백질은 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5%skim milk in TBST)에서 incubation시켰다. MMP-1 각각의 1차 항체를 1:1000으로 희석하여 4oC에서 over night 한 다음, 다시 10 분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 mouse anti-rabbit IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 실온에서 1시간 동안 붙이고, 3회 washing 한 뒤 LAS 4, 000 imageanalyzer (Fugifilm life science, Japan) 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.
- 시료 용액 (20 μL)을 60배 희석하고 Folin - Ciocalteau's phenol reagent (100 μL)를 첨가하여 혼합한 후 5분간 실온에서 반응시키고 포화 Na2CO3 용액(300 μL)을 가하여 1시간 실온에서 방치하고, 760nm에서 흡광도를 측정한 후, 표준물질인 tannic acid로 미리 작성한 표준 곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다.
- 시료의 추출은 70% 에탄올을 시료 중량의 10배를 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였고, 얻어진 여액은 여과 (Whatman NO. 5) 및 감압 농축(Rotary vaccum evaporatory)하여 동결건조 후 4℃냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.
- CCD-986sk 세포에 NN-L 에탄올 추출물 1, 5, 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하여 48시간 처리한 결과 5, 10, 50, 100 μg/mL 농도구간에서 100%에 가까운 세포 생존율을 확인하였다. 실험결과(Fig 5)에 따라 50 μg/mL 이하 농도에서 MMP-1 저해 활성 측정과 단백질 발현 실험을 하였다.
- 후 24시간을 안정화하였다. 이후, 배양된 배지를 제거하고 PBS을 첨가한 다음 자외선을 조사하고 이때 MMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α를 10 ng/mL의 농도로 첨가하고 시료를 농도별로 처리한 후 48시간을 배양하였다. 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였으며 Gross 등25)의 방법에 따라 MMP-1 biotrack activity assay kit (Amersham Bioscience, USA)을 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 연꽃, 연잎, 연 줄기는 대구 반야월 연 재배 농장에서 7월에 채취한 것을 건조하여 사용하였다. 시료의 추출은 70% 에탄올을 시료 중량의 10배를 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였고, 얻어진 여액은 여과 (Whatman NO.
- 본 실험에서 사용한 섬유아세포는 (CCD-986sk) Korean Cell Line Bank(KCLB)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양 시약 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMED), fetal bovine serum (FBS), 0.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었다. 통계처리는 Students's t-test로 검정하였고, 정상 세포군과 비교하여 p<0.
- 통계처리는 Students's t-test로 검정하였고, 정상 세포군과 비교하여 p<0.05 이하의 경우 유의적인 차이가 있다고 판정하였다.
이론/모형
- ABTS radical scavenging을 이용한 항산화력 측정은 Fellegrini의20) 방법에 의하여 측정하였다. 7 mM 2, 2'-azino- bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)와 2.
- Collagenase 저해 능은 Wűnsch 등24)의방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.
- DPPH 전자공여 능 (EDA; electron donating ability)은 Blois의19) 방법에 따라 측정하였다. 각 시료 용액 120 μL에 0.
- Elastase 저해능은 Cannell 등23)의 방법에 따라 측정하였다. 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.
- Superoxide anion radical 소거능은 nitrobule tetrazolium (NBT) 환원방법21) 에 의해 측정하였다. 각 시료 용액 0.
- 세포 생존율 측정은 Camichael22)의 방법에 따라 측정하였다. Fibroblast (CCD-986sk) cell를 96 well plate에 5×103 cells/ml이 되게 seeding하고 PBS을 첨가한 다음 자외선을 조사하고 시료를 농도별로 20 μL 처리한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 48시간 배양하였다.
- 이후, 배양된 배지를 제거하고 PBS을 첨가한 다음 자외선을 조사하고 이때 MMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α를 10 ng/mL의 농도로 첨가하고 시료를 농도별로 처리한 후 48시간을 배양하였다. 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였으며 Gross 등25)의 방법에 따라 MMP-1 biotrack activity assay kit (Amersham Bioscience, USA)을 이용하여 측정하였다.
- 폴리페놀의 정량은 Folin-danis18) 방법을 이용하였다. 시료 용액 (20 μL)을 60배 희석하고 Folin - Ciocalteau's phenol reagent (100 μL)를 첨가하여 혼합한 후 5분간 실온에서 반응시키고 포화 Na2CO3 용액(300 μL)을 가하여 1시간 실온에서 방치하고, 760nm에서 흡광도를 측정한 후, 표준물질인 tannic acid로 미리 작성한 표준 곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다.
성능/효과
- 1. DPPH radicla 소거능을 비교 측정한 결과, 1000ug/mL 에서 NN-L(91.43%)서 가장 우수한 DPPH radicla 소거능을 확인하였으며 대조군인 Vit. C (93.
- Elastase는 진피 내 피부 탄력을 유지하는 기질 단백질인 elastin의 분해에 관련되며, 피부의 주름 및 탄력성 소실 등을 유발한다. 1000ug/mL 에서 NN-L(42.8%)에서 가장 우수한 elastase 억제능을 확인하였다. 같은 농도에서 Vit.
- 2. ABTS+ radicla 소거능을 비교 측정한 결과, 100 μg/mL 에서 NN-L(97.1%)에서 가장 우수한 radicla 소거능을 확인하였으며 대조군인 Vit. C (99.
- 3. Superoxide anion radical 소거 능을 비교 측정한 결과, 1000 μg/mL에서 NN-L(73.7%)에서 가장 우수한 radical 소거능을 확인하였으며 대조군인 Vit. C (81.
- 4. Elastase 저해활성을 비교 측정한 결과, 1000ug/mL 에서 NN-L(42.8%)에서 가장 우수한 elastase 억제능을 확인하였다.
- 5. Collagenase 저해 활성을 비교 측정한 결과, 1000μg/mL 에서 NN-L(77.2%)에서 가장 우수한 collagenas 억제능을 확인하였다. 양성 대조군인 Vit.
- 6. 피부 섬유아세포(CCD986-sk)에서 높은 안전성을 나타내었으며, NN-L 에탄올 추출물 5, 10, 50, 100 μg/mL 농도구간에서 100%에 가까운 세포 생존율을 확인 하였다.
- 7. CCD986-sk 세포에 자외선 B를 노출시킨 경우 추출물을 처리한 군에서는 MMP-1 수준이 TNF-α 단독 처리 군보다 감소되었으며, elastase 저해활성 측정에서도 농도에 비례하여 우수한 효능을 나타냄을 알 수 있었다.
- Folin-Ciocalteu을 이용한 Folin-Denis 법으로 연의 꽃 (NN-F), 잎(NN-L), 줄기(NN-S) 에탄올 추출물의 페놀성 화합물 함량을 tannic acid 으로 환산하여 비교측정한 결과, NN-L(213.5±1.12)에서 NN-F(182.7±1.68)와 NN-S (49.6±0.69) 보다 많은 폴리페놀 함량을 확인하였다.
- 의해 유도된다. NN-L 에탄올 추출물 처리군에서 MMP-1의 단백질 발현을 확인한 결과, NN-L 에탄올 추출물 50μg/mL의 농도에서 35.0%의 MMP-1의 단백질 발현 억제능을 확인 하였다(Fig 9). 결과에 따피부 탄력-L 에탄올 추출물이 피부탄력 및 주름 개선 효능에 기여할 것으로 판단된다.
- 4%)와 비교하면 다소 낮은 elastase 억제능이다. 본 연구 결과를 통해 대추 에틸아세테이트층이 elastase의 활성을 유의적으로 억제한 것을 확인하여 피부 노화 억제에 도움을 줄 수 있음을 시사한다.
- 5%의 MMP-1의 발현 저해효과를 나타내었다. 본 연구결과를 통해 NN-L 에탄올 추출물이 collagenase 분해에 영향을 미치는 MMP-1의 활성을 억제함으로써 피부 노화 억제에 도움을 줄 수 있음을 의미한다.
- MMP-1 의 활성을 억제하여 collagen의 분해를 감소시키면, 피부 조직의 탄력을 유지하고 주름 생성을 예방할 수 있으므로 MMP-1 활성을 저해하는 연구가 점차 증가되고 있다28). 본 연구에서 MMP-1 저해활성과 MMP-1 protein 발현을 비교 평가한 결과 MMP-1의 활성이 29.5% 감소된 것을 확인 하였으며 MMP-1 protein 발현은 35.0% 감소되었다. 이들 결과는 NN-L이 피부노화 억제에 연관이 있다고 사료된다.
- 본연구에서 NN-L이 MMP-1 활성에 미치는 영향을 확인한 결과(Fig 8), UV-B를 처리하지 않은 군과 처리한 군은 각각 21.3%, 100%의 MMP-1을 생산하여 UV-B를 처리함으로써 MMP-1 양이 활성화됨을 확인할 수 있었다. NN-L 50 μ g/mL에서 29.
- 4%)와 비교하면 다소 낮은 elastase 억제능이다. 본 연구 결과를 통해 대추 에틸아세테이트층이 elastase의 활성을 유의적으로 억제한 것을 확인하여 피부 노화 억제에 도움을 줄 수 있음을 시사한다.
- 이들 결과는 NN-L이 피부노화 억제에 연관이 있다고 사료된다. 연의 각 부위(NN-F, NN-L, NN-S)별 추출물의 항산화, elastase, collagenase 저해활성에 대한 효능을 평가한 결과 NN-L이 가장 우수하였으며, 전체적으로 농도 의존적으로 활성이 나타남을 알 수 있었으며, 추가로 NN-L의 MMP-1 저해능과 protein 발현능에서도 유의한 결과를 확인하였다.
- 산화에 의한 피부 손상은 다양한 노화 징후 즉 기미, 주름, 건조 등의 증상과 밀접한 관련이 있으므로 항노화에 있어서 산화에 적극적으로 대응하는 것이 중요하다. 연의 꽃(NN-F), 잎(NN-L), 줄기(NN-S) 에탄올 추출물의 페놀성 화합물 함량을 비교측정한 결과, NN-L(213.5 ± 1.12) 에서 NN-F(182.7 ± 1.68)와 NN-S(49.6 ± 0.69) 보다 많은 폴리페놀 함량을 확인하였다. NN-F, NN-L, NN-S 에서 DPPH, ABTS+ radical 소거 능을 측정한 결과 NN-L 에서 가장 우수한 radical 소거 능을 확인 하였으며 대조군인 Vitamin C 보다는 높지 않으나 유사한 ridical 소거능을 확인함으로 이후 분획 및 정제과정을 거친다면 더 우수한 효능효과를 기대할 수 있을 것이라 사료된다.
- 이로 인해 피부 표면이 거칠고 비대해 지며 깊은 주름이 생기게 된다. 연의 꽃, 잎, 줄기 에탄올 추출물에서 주름 생성과 관련된 collagenase 저해 활성을 비교 측정한 결과 (Fig 7), 1000μg/mL에서 NN-L(77.2%), NN-F(26.1%), NN-S(47.9%)으로 NN-L에서 가장 우수한 collagenas 억제능을 확인하였다. 양성 대조군인 Vit.
- 피부 노화의 주원인중의 하나인 elastin 분해효소인 elastase의 활성을 저하시킴으로써 피부 노화를 억제할 수 있다. 연의 꽃, 잎, 줄기 에탄올 추출물에서 주름 생성과 관련된 elastase 저해 활성을 비교 측정한 결과, 1000ug/mL에서 NN-L(42.8%), NN-F(9.5%), NN-S(17.9%)으로 NN-L에서 가장 우수한 elastase 억제능을 확인하였다(Fig 6). 같은 농도에서 Vit.
후속연구
- 69) 보다 많은 폴리페놀 함량을 확인하였다. NN-F, NN-L, NN-S 에서 DPPH, ABTS+ radical 소거 능을 측정한 결과 NN-L 에서 가장 우수한 radical 소거 능을 확인 하였으며 대조군인 Vitamin C 보다는 높지 않으나 유사한 ridical 소거능을 확인함으로 이후 분획 및 정제과정을 거친다면 더 우수한 효능효과를 기대할 수 있을 것이라 사료된다. Elastase는 진피 내 피부 탄력을 유지하는 기질 단백질인 elastin의 분해에 관련되며, 피부의 주름 및 탄력성 소실 등을 유발한다.
- 0%의 MMP-1의 단백질 발현 억제능을 확인 하였다(Fig 9). 결과에 따피부 탄력-L 에탄올 추출물이 피부탄력 및 주름 개선 효능에 기여할 것으로 판단된다.
- 이상의 결과에서 하엽(荷葉) 에탄올 추출물은 낮은 세포독성을 나타내며 농도 의존적으로 항산화, 항노화 효능을 나타냄으로 피부 주름 개선에 도움을 주는 소재로서 가능성을 보여주었다고 사료된다.
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