양이온교환 고성능액체크로마토그래피에서 라이소자임을 분석하고, 실험결과인 크로마토그램을 통해 모멘트 분석을 수행하였다. 용리 인산완충용액은 1.0, 0.75, 0.5 M의 소금을 포함하였다. 실험변수는 유량, 용리 완충용액중 소금 농도, 시료의 농도로 하였다. General rate (GR) model을 도입하여 1차와 2차 모멘트를 해석하였다. 1차 모멘트 해석에서 평형상수 K를 구할 수 있으며, 이는 $L/u_0$ vs. $({\mu}_1-t_0)/(1-{\varepsilon}_e)(1-{\varepsilon}_i)$]를 도식화했을 때의 기울기이다. 2차 모멘트 해석에서 입자내 확산계수는 이론단수 실험자료에서 계산하였다. 모멘트 분석결과를 통해 여러 물질전달 현상이 이론단 상당높이(HETP)에 주는 영향을 알아보기 위해 van Deemter plot을 작성하고, 총괄 이론단 상당높이($H_{total}$)에 기여하는 $H_{ax}$, $H_f$, 그리고 $H_d$를 조사하였다. 그 중 입자내 확산계수를 나타내는 $H_d$가 가장 지배적이었고, 외부 물질전달 계수를 나타내는 $H_f$의 영향이 가장 미미했다.
양이온교환 고성능액체크로마토그래피에서 라이소자임을 분석하고, 실험결과인 크로마토그램을 통해 모멘트 분석을 수행하였다. 용리 인산완충용액은 1.0, 0.75, 0.5 M의 소금을 포함하였다. 실험변수는 유량, 용리 완충용액중 소금 농도, 시료의 농도로 하였다. General rate (GR) model을 도입하여 1차와 2차 모멘트를 해석하였다. 1차 모멘트 해석에서 평형상수 K를 구할 수 있으며, 이는 $L/u_0$ vs. $({\mu}_1-t_0)/(1-{\varepsilon}_e)(1-{\varepsilon}_i)$]를 도식화했을 때의 기울기이다. 2차 모멘트 해석에서 입자내 확산계수는 이론단수 실험자료에서 계산하였다. 모멘트 분석결과를 통해 여러 물질전달 현상이 이론단 상당높이(HETP)에 주는 영향을 알아보기 위해 van Deemter plot을 작성하고, 총괄 이론단 상당높이($H_{total}$)에 기여하는 $H_{ax}$, $H_f$, 그리고 $H_d$를 조사하였다. 그 중 입자내 확산계수를 나타내는 $H_d$가 가장 지배적이었고, 외부 물질전달 계수를 나타내는 $H_f$의 영향이 가장 미미했다.
The moment analysis of lysozyme was implemented using chromatograms that were obtained from weak cation exchange column in high performance liquid chromatography system. Three elution sodium phosphate buffers containing 1.0, 0.75, 0.5M sodium chloride were used. Experiments were conducted by varying...
The moment analysis of lysozyme was implemented using chromatograms that were obtained from weak cation exchange column in high performance liquid chromatography system. Three elution sodium phosphate buffers containing 1.0, 0.75, 0.5M sodium chloride were used. Experiments were conducted by varying flow rate, elution sodium chloride concentration, and lysozyme solute concentration. The general rate (GR) model was employed to calculate the first moment and the second moment. By plotting $L/u_0$ vs. $({\mu}_1-t_0)/(1-{\varepsilon}_e)(1-{\varepsilon}_i)$] equilibrium constants (K) were obtained from first moment analysis. Intra-particle diffusivity was obtained from theoretical plate number data. Based on the results of moment analysis, van Deemter plots were drawn in order to investigate the contributions of $H_{ax}$, $H_f$, and $H_d$ to total Height Equivalent to a Theoretical Plate (HETP, $H_{total}$). The effect of intra-particle diffusion ($H_d$) was the most dominant factor contributing to HETP while external mass transfer ($H_f$) was negligible factor.
The moment analysis of lysozyme was implemented using chromatograms that were obtained from weak cation exchange column in high performance liquid chromatography system. Three elution sodium phosphate buffers containing 1.0, 0.75, 0.5M sodium chloride were used. Experiments were conducted by varying flow rate, elution sodium chloride concentration, and lysozyme solute concentration. The general rate (GR) model was employed to calculate the first moment and the second moment. By plotting $L/u_0$ vs. $({\mu}_1-t_0)/(1-{\varepsilon}_e)(1-{\varepsilon}_i)$] equilibrium constants (K) were obtained from first moment analysis. Intra-particle diffusivity was obtained from theoretical plate number data. Based on the results of moment analysis, van Deemter plots were drawn in order to investigate the contributions of $H_{ax}$, $H_f$, and $H_d$ to total Height Equivalent to a Theoretical Plate (HETP, $H_{total}$). The effect of intra-particle diffusion ($H_d$) was the most dominant factor contributing to HETP while external mass transfer ($H_f$) was negligible factor.
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문제 정의
MA의 결과는 공정의 최적 조건을 찾을 수 있는 정보를 제공하고, 크로마토그래피 전산모사에 도움이 되는 인자를 제공하여 scale-up 부분에 도움이 될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 단백질 시료를 효율적으로 분리할 수 있는 조건을 찾기 위해, 이온교환 컬럼 내부에서 일어나는 전달현상을 분석하여 시료의 분리 동특성을 파악하고, 이론과 실험을 병행하는 방법을 제시하고자 한다.
모멘트 분석(Moment analysis; MA)은 실험결과인 크로마토그램을 분석하여 컬럼 내에서 시료의 동특성을 정량화하여 용리경향을 파악하는데 목적이 있다. MA는 1960년대부터 van Deemter 및 Knox의 방정식을 토대로 시작되었다.
5 ml/min에대한 결과를 살펴보았다. 이로써 시료의 농도, 유량, NaCl 농도가 결과에 각각 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. 실험의 정밀도를 위해 같은 시료를 3회씩 분석하였으나 결과에 큰 차이가 없어 하나의 결과만을 Fig.
제안 방법
HETP와 유량이 선형관계를 갖는 GR model을 사용하여 moment 분석을 하였다. First moment는 식 (4)를 통해 계산할 수 있고, moment 값은 용리시간을 나타내며, 평형상수(K)를 구할 수 있다.
Htotal에서 Hax와 Hf빼서 Hd를 얻고, δd와 De를 역추산하였다.
MA를 위해 먼저 필요한 인자인 컬럼의 전체 공극률(εt), 컬럼에서 고정상으로 채워진 부분을 제외한 외부공극률(εe), 고정상 입자에서 기공에 대한 내부공극률(εi) 및 시료가 고정상과 상호작용 없이 용리되는 시간인 dead time (t0)을 계산하였다.
MA연구는 주로 HETP와 유량사이의 관계를 선형적으로 나타낼 수 있는 general rate (GR) model을 중심으로 발전되어 왔으며, 분리공정을 위한 동특성을 파악하는 데는 용리시간과 peak의 너비를 나타내는 first와 second moment만으로도 충분하기 때문에 본 연구에서는 두 moment만 다루었다. First moment는 상평형 열역학의 영향을 받기 때문에 평형상수(K)를 알 수 있다.
Second moment는 axial dispersion, external mass transfer, intraparticle diffusion 순서로 정량분석하고, van Deemter plot을 통해 정성적 결과를 살펴보았다.
4). 각 변수에 대한 분리특성을 알아보고, 이를 기반으로 MA를 수행하였다.
) 모델의 UV파장은 단백질이 가장 잘 검출하는 280 nm로 설정했다. 검출된 전기적 신호를 Autochro Data Module (Younglin Instrument, Korea) 프로그램을 통해 디지털 신호로 바꾸어 PC로 확인하였다(Fig. 3). 샘플의 양은 20 μl, 펌프의 유량은 0.
5 ml/min로 했다. 시료의 세 가지 농도, 용리 완충용액의 NaCl농도 및 유량을 각각 3가지씩 설정하여 총 27가지의 크로마토그램을 얻었다(Fig. 4). 각 변수에 대한 분리특성을 알아보고, 이를 기반으로 MA를 수행하였다.
실험결과로부터 axial dispersion, external mass transfer, intraparticle diffusion 순서대로 필요한 인자를 계산하였다. 먼저, axial dispersion moment에 필요한 DL 계산식은 분자확산과 eddy 확산으로 구성되어 있고, 아래와 같다.
양이온교환 HPLC에서 라이소자임을 3가지 시료농도, 이동상 및 유량에 대한 27가지의 크로마토그램을 분석하여 각각의 MA를 비교하였다.
용리 완충용액의 NaCl 농도가 0.5, 0.75, 1.0 M의 순서로 실험을 수행했고, 3, 5, 7 mg/ml의 lysozyme 표준시료를 0.5, 1.0, 1.5 ml/min에대한 결과를 살펴보았다. 이로써 시료의 농도, 유량, NaCl 농도가 결과에 각각 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다.
등용리 방법(isocratic method)을 사용했다. 이온교환 크로마토그래피에서는 2가지의 이동상(평형 및 용리 완충용액)이 필요하기 때문에 대부분 펌프를 2대 사용하지만, 본 연구에서는 두 이동상과 펌프에 연결되는 유로를 3 way valve로 연결함으로써 110B solvent delivery module pump(Beckman, USA)펌프 1대로 구현하였다. 기포는 filter에서 걸러졌고, 시료는 샘플주입밸브인 RHEODYNE 7010 (Rheodyne, California, U.
라이소자임은 단백질 크로마토그래피 연구에서 대표물질로 쓰이며 본 연구에서도 MA를 적용하기 위한 단백질로 선정하였다. 컬럼 내에서 라이소자임을 탈착시킬 염(salt)의 농도 3가지, 라이소자임 표준 시료농도 3가지, HPLC의 유량 3가지를 실험변수로 설정하여 총 27가지의 크로마토그램을 얻고, MA를 수행하여 분리특성을 조사하였다. 양이온교환 HPLC 크로마토그래피를 사용하여 라이소자임을 분리할 때 MA를 적용한 것은 문헌조사 결과 본 연구가 처음인 것으로 사료된다.
평형 완충용액은 pH 9.2 30 mM sodium phosphate buffer (Sigma aldrich, U.S.A.)를 사용했고, 용리 완충용액은 평형 완충용액에 sodium chloride(DUKSAN, Korea)을 서로 다른 세 가지의 농도(0.5, 0.75, 1.0 M)가 되도록 용해시켜 제조했다. 라이소자임 시료는 평형 완충 용액 10 ml에 라이소자임 표준시료(Sigma aldrich, U.
대상 데이터
, Canada)모델의 컬럼오븐을 사용하였다. 783A programmable absorbance detector (Applied Biosystems, U.S.A.) 모델의 UV파장은 단백질이 가장 잘 검출하는 280 nm로 설정했다. 검출된 전기적 신호를 Autochro Data Module (Younglin Instrument, Korea) 프로그램을 통해 디지털 신호로 바꾸어 PC로 확인하였다(Fig.
기포는 filter에서 걸러졌고, 시료는 샘플주입밸브인 RHEODYNE 7010 (Rheodyne, California, U.S.A.)를 통해 직경이 5 um 입자로 채워진 4.6×250 mm 사이즈의 HP HENENCHEM, WCX-300(Aglient, U.S.A.)컬럼으로 주입되었다.
고성능액체크로마토그래피(High performance liquid chromatography; HPLC)는 혼합물에서 분리·정제하는 데 유용한 장치이기 때문에 HPLC에 양이온교환 컬럼을 결합하여 양이온교환 HPLC를 구성하였다[5]. 라이소자임은 단백질 크로마토그래피 연구에서 대표물질로 쓰이며 본 연구에서도 MA를 적용하기 위한 단백질로 선정하였다. 컬럼 내에서 라이소자임을 탈착시킬 염(salt)의 농도 3가지, 라이소자임 표준 시료농도 3가지, HPLC의 유량 3가지를 실험변수로 설정하여 총 27가지의 크로마토그램을 얻고, MA를 수행하여 분리특성을 조사하였다.
데이터처리
External mass transfer coefficient (kf)는 Wilson-Geankoplis 상관관계식을 통해 구했고, 결과를 바탕으로 δf 및 Hf를 계산하였다.
와 유량간의 관계를 나타낸 van Deemter equation이고, A, B, C를 van Deemter coefficient라고 한다. MA를 통해 물질전달계수들을 정량적으로 분석하고, van Deemter coefficient를 MATLAB에 적용시켜 정성적인 결과를 확인하였다.
이론/모형
Second moment는 axial dispersion, external mass transfer, intraparticle diffusion의 합으로 표현할 수 있고, 물질전달계수와 HETP값을 결정한다. Axial dispersion coefficient 계산 시 필요한 용질의 molecular diffusivity (Dm)는 Wilke-Chang 방정식을 통해 계산했다. DL을 사용해 δax 및 Hax를 계산하였다.
다음으로 external mass transfer coefficient (kf)를 구하기 위해 Wilson-Geankoplis corelation을 사용했고, 식(13)에 나타냈다.
등용리 방법(isocratic method)을 사용했다. 이온교환 크로마토그래피에서는 2가지의 이동상(평형 및 용리 완충용액)이 필요하기 때문에 대부분 펌프를 2대 사용하지만, 본 연구에서는 두 이동상과 펌프에 연결되는 유로를 3 way valve로 연결함으로써 110B solvent delivery module pump(Beckman, USA)펌프 1대로 구현하였다.
)컬럼으로 주입되었다. 컬럼의 온도를 25 oC로 유지하기 위해 BAS LC-22C Temperature Controller (SpectraLab Scientific Inc., Canada)모델의 컬럼오븐을 사용하였다. 783A programmable absorbance detector (Applied Biosystems, U.
성능/효과
Htotal에서 Hax와 Hf빼서 Hd를 얻고, δd와 De를 역추산하였다. De값은 NaCl의 농도가 낮을수록 감소했고, 농도 및 유량이 증가할 때에는 값이 커졌다. 유량이 증가하면 유체의 흐름이 빨라지기 때문에 De가 증가한 것으로 보인다.
8B에 나타냈다. Hax가 RP-HPLC일 때보다 더 넓은 범위의 유량에 영향을 미치고, 약 0.1 cm/s 이상부터는 Hd가 지배적이었다. Hf는 영향력이 미미했다.
Van Deemter coefficient를 계산하여 van Deemter plot을 통해 정성적 결과를 살펴본 결과, 용리가 빠른 용매의 곡선 경사가 완만했다. 일정 지점까지 Hax와 Hd가 Htotal에 영향을 주다가 일정 유량을 넘어서면 Hd가 지배적이었고, Hf는 영향이 미미했다.
실험결과인 크로마토그램으로부터 MA를 통해 컬럼 내부에서 용리평형(retention equilibrium)에 관련된 first moment (μ1)와 peak의 너비를 결정하는 second moment (μ2)의 경향을 알 수 있다.
Van Deemter coefficient를 계산하여 van Deemter plot을 통해 정성적 결과를 살펴본 결과, 용리가 빠른 용매의 곡선 경사가 완만했다. 일정 지점까지 Hax와 Hd가 Htotal에 영향을 주다가 일정 유량을 넘어서면 Hd가 지배적이었고, Hf는 영향이 미미했다.
2)[2]. 최종적으로 물질전달현상을 분석한 결과를 이용해 컬럼의 길이를 이론단수로 나눈 값인 이론단 상당높이(Height equivalent to a theoretical plate; HETP)와 유량사이의 관계를 정성적으로 나타낼 수 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
모멘트 분석의 목적은 무엇인가?
모멘트 분석(Moment analysis; MA)은 실험결과인 크로마토그램을 분석하여 컬럼 내에서 시료의 동특성을 정량화하여 용리경향을 파악하는데 목적이 있다. MA는 1960년대부터 van Deemter 및 Knox의방정식을 토대로 시작되었다.
양이온교환 고성능액체크로마토그래피의 실험 변수로는 무엇을 설정하였는가?
5 M의 소금을 포함하였다. 실험변수는 유량, 용리 완충용액중 소금 농도, 시료의 농도로 하였다. General rate (GR) model을 도입하여 1차와 2차 모멘트를 해석하였다.
MA는 무엇을 토대로 시작되었는가?
모멘트 분석(Moment analysis; MA)은 실험결과인 크로마토그램을 분석하여 컬럼 내에서 시료의 동특성을 정량화하여 용리경향을 파악하는데 목적이 있다. MA는 1960년대부터 van Deemter 및 Knox의방정식을 토대로 시작되었다. 초기에는 peak의 면적을 나타내는 zero moment로 시작하여 시료의 용리시간을 나타내는 first moment, peak의 너비를 나타내는 second moment, peak의 대칭성에 관련된 third moment 순서로 연구가 발전했다.
참고문헌 (10)
Otto, G., "Interpretation of Asymmetric Curves in Linear Chromatography," Anal. Chem., 43(14), 1934-1937(1971).
Kim, H. M., Kim, A. R., Lee, C. S., and Kim, I. H., "Identification of Proteins in Egg White using Ion Exchange Cartridge and RP-HPLC," Korean Chem. Eng. Res., 50(4), 713-717(2012).
Ko, K. Y. and Kim, I. H., "The Effect of pH and Temperature on Lysozyme Separation in Ion-exchange Chromatography," Korean Chem. Eng. Res., 52(1), 98-105(2014).
Suzuki, M., Adsorption engineering, Kodansha, Elsevier, Tokyo, Japan(1990).
Liu, Z., Roininen, J., Pilkkinen, I., Saari, P., Sainio, T. and Alopaeus, V., "A New Moment Analysis Method to Estimate the Characteristic Parameters in Chromatographic General Rate Model," Computers and Chemical Engineering, 55, 50-60(2013).
Kestin, J., Khalifa, H. E. and Correia, R. J., "Tables of the Dynamic and Kinematic Viscosity of Aqueous NaCl Solutions in the Temperature Range $20-150^{\circ}C$ and the Pressure Range 0.1-35 MPa," J. Phys. Chem. Ref. Data, 10(1), 71-87(1981).
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