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문제 정의
- 따라서 본 연구는 제주 해안지역에 분포하는 수종의 식물을 대상으로 제주지역 농작물 재배 시 발생하는 병원균에 대해 in vitro상에서 항균활성 측정하여 친환경 살균제 개발 시 기초자료로 제공하고자 실시하였다.
- 본 연구는 자생식물인 순비기나무, 번행초, 사철쑥 등을 이용하여 친환경 농자재로 개발하기 위한 기초자료를 제공하고자 수용성 추출액 농도에 따른 Stemphylium vesicarium, Penicillium italicum, Sclerotinia sclerotiorum, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Rhizoctoniasolani, Colletotrichum gloeosporioides 7종의 작물 병원균에 대해 생장을 조사하였다.
제안 방법
- 다시 여기에 1 N NaOH 300 ㎕를 잘 혼합시켜 37℃의 water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 시료 용액 대신 증류수로 동일하게 처리하였으며, 표준곡선은 naringin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 이용하여 표준 검량곡선을 작성하고 이로부터 플라보노이드 함량을 구하였다.
- 공여체식물의 수용성 추출액은 음지에서 건조시킨 전초를 분쇄하여 건중량 100 g당 1,000 ㎖의 증류수를 넣어 고온가압추출(Autoclave extraction) 하였다. 이 여과된 추출액을 100%로 임의로 정하여 증류수로 75%, 50%, 25%로 희석하였고 배지 제조 시 물 대신 수용성 추출액을 첨가하였으며 대조구는 24시간 전에 받아둔 증류수를 사용하였다.
- 실험에 사용된 균은 Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Penicillium italicum, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Stemphylium vesicarium으로 한국 농업미생물자원센터(KACC)에서 분양 받아 사용하였고 대조구의 배지는 증류수 900 ml에 Potato dextrose agar 39 g과 Agar 5 g을 혼합하여 조성하였으며 실험구 배지는 증류수 대신 각각의 추출물을 넣어 사용하였다. 균주는 1주에서 2주 동안 배양한 후 동일한 사이즈를 얻기 위해 Cork borer (직경 8 mm)를 이용하였으며 배지가 굳은 후 배양된 균주를 배지의 가운데에 접합 한 후 5~7일 동안 Colony diameter를 측정하였고 대조구에 대한 상대성장률 (Relative growth ratio)을 산출하였다.
- 공여체식물의 수용성 추출액은 음지에서 건조시킨 전초를 분쇄하여 건중량 100 g당 1,000 ㎖의 증류수를 넣어 고온가압추출(Autoclave extraction) 하였다. 이 여과된 추출액을 100%로 임의로 정하여 증류수로 75%, 50%, 25%로 희석하였고 배지 제조 시 물 대신 수용성 추출액을 첨가하였으며 대조구는 24시간 전에 받아둔 증류수를 사용하였다.
대상 데이터
- 검정식물(Test plants)인 순비기나무(Vitex rotundifolia), 무화과(Ficus carica), 사철쑥 (Artemisia capillaris)은 제주특별자치도 제주시 이호해수욕장 해변근처에 채집하였고, 번행초(Tetragonia tetragonoides)는 제주시 한경면 고산리 수월봉 해안근처에서 채집하였다. 한편 황근(Hibiscus hamabo)은 환경부지정 멸종위기 야생식물 2급으로 제주지역 해안가와 전라남도 도서지역에 일부에 분포하는데 본 실험에서 사용된 시료는 제주대학교 내에 조경수로 식재된 황근을 대상으로 채집하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 균은 Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Penicillium italicum, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Stemphylium vesicarium으로 한국 농업미생물자원센터(KACC)에서 분양 받아 사용하였고 대조구의 배지는 증류수 900 ml에 Potato dextrose agar 39 g과 Agar 5 g을 혼합하여 조성하였으며 실험구 배지는 증류수 대신 각각의 추출물을 넣어 사용하였다. 균주는 1주에서 2주 동안 배양한 후 동일한 사이즈를 얻기 위해 Cork borer (직경 8 mm)를 이용하였으며 배지가 굳은 후 배양된 균주를 배지의 가운데에 접합 한 후 5~7일 동안 Colony diameter를 측정하였고 대조구에 대한 상대성장률 (Relative growth ratio)을 산출하였다.
- 검정식물(Test plants)인 순비기나무(Vitex rotundifolia), 무화과(Ficus carica), 사철쑥 (Artemisia capillaris)은 제주특별자치도 제주시 이호해수욕장 해변근처에 채집하였고, 번행초(Tetragonia tetragonoides)는 제주시 한경면 고산리 수월봉 해안근처에서 채집하였다. 한편 황근(Hibiscus hamabo)은 환경부지정 멸종위기 야생식물 2급으로 제주지역 해안가와 전라남도 도서지역에 일부에 분포하는데 본 실험에서 사용된 시료는 제주대학교 내에 조경수로 식재된 황근을 대상으로 채집하여 사용하였다. 채집된 시료는 전초를 3 cm 정도로 잘라 음건하여 사용하였다.
데이터처리
- 1) The different letters in species indicate significantly difference at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 1) The different letters in species indicate significantly difference at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
이론/모형
- 수용성 추출액의 총 페놀함량은 Prussian blue법(Graham, 1992)으로 3회 반복 측정하였고, 각각 시료의 수용성 추출액 100 ㎕에 증류수 3 ㎖, 0.01 M FeCl3/0.1 N HCl 1 ㎖, 0.016 M K3Fe(CN)6 1 ㎖을 혼합하여 진탕한 후 실온에서 15분간 방치 후 stabilizer (H2O : 1% gum arabic : 85% phosphoric acid = 3:1:1, v/v/v) 5 ㎖를 첨가한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 수용성 추출액의 플라보노이드 함량은 Kim (2001)의 방법에 따라 3회 반복 측정하였고 각각 시료의 수용성추출액 100 ㎕를 시험관에 취하고 3 ㎖의 diethylene glycol을 가하여 잘 혼합하였다. 다시 여기에 1 N NaOH 300 ㎕를 잘 혼합시켜 37℃의 water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 01)에서 역의 상관을 보였으며 Rhizoctonia solani과 Colletotrichum gloeosporioides은 모든 공여체식물에서 역의 상관을 보였다. 100% 처리구에서 균사의 생장억제 활성은 번행초인 경우 Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides에 대해 각각 94%, 50%, 80%의 억제율을 보였다. 사철쑥인 경우 Stemphylium vesicarium, Pythium ultimum에 대해 각각 43%, 90%의 억제율을 보였다.
- Stemphylium vesicarium 경우 번행초와 사철쑥에서 농도 증가에 따라 각각 r = -0.857 (p<0.01), r = -0.868 (p<0.01)로 역의 상관을 보였고 Penicillium italicum은 순비기나무 r = -0.833 (p<0.01), Sclerotinia sclerotiorum은 순비기나무 r = -0.862 (p<0.01)와 사철쑥 r = -0.902 (p<0.01), Botrytis cinerea은 번행초 r = -0.896 (p<0.01)에서 역의 상관을 보였으며 Rhizoctonia solani과 Colletotrichum gloeosporioides은 모든 공여체식물에서 역의 상관을 보였다.
- 수용성 추출액 25%농도 기준으로 상대생장율을 비교하여 보면 대조구에 비해서 12~46%의 균사생장 억제가 일어나는데 사철쑥(12%), 순비기나무(21%), 번행초(23%), 무화과(41%), 황근(46%) 순으로 억제가 증가하였다. 각각의 시료 추출액 농도에 따른 가장 억제율이 높은 것은 황근이 50% 추출액에서 51%가 억제되는 것으로 분석되었다(Fig. 2).
- 공여체식물별에 따른 수용성 추출액 농도가 증가됨에 따라 작물 병원균 균사의 생장이 감소하는 경항을 보이나 공여체식물과 병원균의 종류에 따라 억제의 정도차이를 보였다. Stemphylium vesicarium 경우 번행초와 사철쑥에서 농도 증가에 따라 각각 r = -0.
- 수용성 추출물의 농도별 탄저병원균의 균사생장 억제효과를 보면 농도가 증가함에 따라 감소되는 경향을 보인다. 그중 번행초인 경우 50% 처리구부터 54%의 균사 억제율을 보이고 75% 처리구와 100% 처리구에서 80% 이상의 높은 균사 억제율을 보였다. 다른 검정식물에서는 27~39%의 억제율을 보이는 것으로 분석되었다(Fig.
- 따라서 in vitro 상에서 해안식물의 수용성 추출액 농도에 따른 생육을 비교한 결과 번행초와 사철쑥은 농도 증가에 따라 각각 r = -0.857 (p<0.01), r = -0.868 (p<0.01)로 순차적 역의 상관을 보이고 100% 처리구에서는 대조구에 비해 약 43%가 생장이 지연된 것으로 분석되었다.
- (1981)과 Ko and Yang (2011)이 식물체에 함유된 페놀성 물질과 플라보노이드는 항균활성을 나타내고 페놀성 물질과 플라보노이드를 상대적으로 높게 함유할수록 항균활성이 높아진다고 한다. 따라서 각 시료별 수용성 추출액에서 총 페놀 함량을 분석한 결과 사철쑥 16.15 mg/g, 무화과 7.81 mg/g, 순비기나무 6.18 mg/g, 황근 5.25 mg/g, 번행초 4.41 mg/g 순으로 조사되었다.
- 따라서 균핵병 방제를 위한 기초자료로 제공하고자 해안식물의 수용성 추출액을 이용한 균핵병의 생육을 조사하였는데 순비기나무, 사철쑥은 농도 증가에 따라 각각 r = -0.862 (p<0.01), r = -0.902 (p<0.01)로 순차적 역의 상관을 보이나 최대 17%의 생육속도 억제율을 보여 다른 병원균에 비해 억제율이 다소 낮은 것으로 분석되었다.
- 토양전염성병원균에 의한 모잘록병의 방제는 토양의 물리화학적 성질의 개선, 저항성 품종의 재배 등과 같은 경종적 방법 및 화학적 방법들에 의해 이루어지고 있으나 대부분의 화학적 방제에 의존하고 있다. 따라서 모잘록병 생물학적 방제를 위한 기초자료로 제공하고자 해안식물의 수용성 추출액을 이용한 모잘록병의 생육을 조사하였는데 대부분 검정식물 수용성 추출액이 모잘록병에 높은 생육속도 억제율을 보이는 것으로 나타났다.
- (2013)은 소나무 줄기와 측백나무 잎을 메탄 추출하여 감압 농축 후 추출물을 소량의 메탄올 또는 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹인 후 적정 농도로 희석하여 항균활성 평가한 결과 소나무 추출물과 측백나무 추출물 1,000배액 처리시 각각 74%, 68%의 항균활성을 보였다. 따라서 본 실험과 추출방식은 다르지만 무화과와 소나무 추출물의 항균활성과 번행초와 측백나무 추출물의 항균활성이 비슷한 경향으로 분석되었다(Fig. 6).
- Lee and Seo (2003)도 인진호 추출물의 분획용매에 따른 식중독 세균들에 대해 항균성 검정 결과 거의 모든 분획물에서 항균활성이 나타나 단일 물질보다는 여러 성분일 것으로 추정 하였다. 따라서 본 실험에서도 총 페놀과 플라보노이드 함량이 적은 시료에서 높은 항균활성을 보이는 이유는 각각의 병원균 종류에 따라 공여체식물에 함유되어 있는 여러 물질이 발현한 것으로 판단된다.
- 따라서 잿빛곰팡이 생물학적 방제를 위한 기초자료로 제공하고자 해안식물의 수용성 추출액을 이용한 잿빛곰팡이의 생육을 조사하였는데 번행초 수용성 추출액인 경우 농도가 증가함에 따라 r = -0.896 (p<0.01)로 순차적 역의 상관을 보였고 100% 처리구에서는 50%의 균사억제 효과를 나타냈다.
- , 2001, 2004). 따라서 제주지역 해안에 분포하는 수종의 자생식물을 이용하여 갈색무늬병이 생물학적 방제를 위한 기초자료를 제공하고자 수용성 추출액에 대한 갈색무늬병의 생육을 조사하였는데 검정식물 대부분이 농도가 증가할수록 균사생장 억제효과가 증가하는 경향을 보였다.
- 따라서 푸른곰팡이병 방제에 대한 기초자료를 제공하고자 해안식물의 수용성 추출액을 이용한 푸른곰팡이의 생육을 조사하였는데 순비기나무의 추출액은 농도가 증가함에 따라 순차적인 생육저해(r = -0.833, p<0.01)가 일어나고 사철쑥, 황근인 경우는 수용성 추출액 농도 50~75%까지 순차적인 감소를 보이다가 생육이 증가하는 것으로 나타났다.
- 01)로 순차적 역의 상관을 보이나 최대 17%의 생육속도 억제율을 보여 다른 병원균에 비해 억제율이 다소 낮은 것으로 분석되었다. 무화과 수용성 추출액인 경우 대조 구에 비해 90~100% 생장되어 균핵병에 효과가 없는 것으로 나타났고 황근이 10~26%로 검정식물에서 균핵병에 대해 가장 높은 항균력을 보였다(Fig. 3).
- 번행초인 경우는 총 페놀과 플라보노이드 함량은 제일 낮은 것으로 산출이 되었고 모잘록병, 탄저병 등에 항균활성이 높은 것으로 나타나 본 실험에서는 총 페놀 함량과 플라보노이드 함량에 따른 항균활성은 상관을 보이지 않았다.
- 수용성 추출액 25%농도 기준으로 상대생장율을 비교하여 보면 대조구에 비해서 12~46%의 균사생장 억제가 일어나는데 사철쑥(12%), 순비기나무(21%), 번행초(23%), 무화과(41%), 황근(46%) 순으로 억제가 증가하였다. 각각의 시료 추출액 농도에 따른 가장 억제율이 높은 것은 황근이 50% 추출액에서 51%가 억제되는 것으로 분석되었다(Fig.
- 잎마름병(S. vesicarium)의 억제 효과를 보면 순비기나무를 제외한 실험구에서 대조구에 비해 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 저농도인 25% 처리구에서의 균사생장 억제효과를 보면 순비기나무 28%, 황근 29%, 사철쑥 39%, 번행초 40%, 무화과 50% 순으로 증가하였고 고농도인 100% 처리구에서는 황근 43%, 순비기나무 51%, 사철쑥 61%, 번행초 68%, 무화과 74% 순으로 증가하였다. Kang et al.
- 특히 번행초와 무화과의 추출액 농도 75% 처리구에서는 94%가 억제되어 전혀 발생하지 않아 가장 높은 억제율을 보였고 번행초와 사철쑥에서도 100% 처리구에서 90~94%로 높은 억제율을 보였다. 반면 검정식물인 황근 수용성추출액은 15~52% 가장 낮은 활성을 보였다 (Fig.
- 플라보노이드는 사철쑥 27.57 mg/g, 순비기나무 12.49 mg/g, 무화과 11.45 mg/g, 황근 5.77 mg/g, 번행초 5.08 mg/g 순으로 조사되었으며 총 페놀 함량에 따른 플라보노이드 함량은 정의 상관으로 r = 0.977 (p<0.01)로 조사되었다.
- 항균활성을 보이는 수용체식물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 사철쑥 16.15 mg/g, 무화과 7.81 mg/g, 순비기나무 6.18 mg/g, 황근 5.25 mg/g, 번행초 4.41 mg/g 순으로 조사되었고 플라보노이드는 사철쑥 27.57 mg/g, 순비기나무 12.49 mg/g, 무화과 11.45 mg/g, 황근 5.77 mg/g, 번행초 5.08 mg/g 순으로 분석되었다.
- 사철쑥인 경우 Stemphylium vesicarium, Pythium ultimum에 대해 각각 43%, 90%의 억제율을 보였다. 황근은 Penicillium italicum, Sclerotinia sclerotiorum에서 각각 50%, 26%가 억제되었으며 무화과는 Rhizoctonia solani에 대해 74%가 균사 생장이 억제되었다.
후속연구
- , 1989). 이러한 식물 고유의 방어능력을 대사공학연구를 통하여 증진시키거나 또는 직접 그 물질을 이용한 방제기술을 이용하여 응용한다면 친환경 농업, 지속농업이 가능하게 될 것으로 생각된다.
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