[논문]인공피부모델 KeraSkinTM을 이용한 유전독성 평가

이수현; 정행선; 김설영; 김혜수; 임경민; 정영신; 최태부

doi:10.15230/scsk.2016.42.3.211

인공피부모델 KeraSkinTM을 이용한 유전독성 평가
Evaluating the Micronucleus Induction Potential for the Genotoxicity Assay Using the Human Skin Model, KeraSkinTM 원문보기

大韓化粧品學會誌 = Journal of the society of cosmetic scientists of Korea, v.42 no.3, 2016년, pp.211 - 216

이수현 ((주)바이오솔루션 부설연구소) , 정행선 ((주)바이오솔루션 부설연구소) , 김설영 ((주)바이오솔루션 부설연구소) , 김혜수 ((주)바이오솔루션 부설연구소) , 임경민 (이화여자대학교 약학대학 약학과) , 정영신 (호서대학교 생명보건과학대학 생명공학과) , 최태부 (건국대학교 공과대학 생물공학과)

초록
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소핵시험은 세포분열 단계 중 간기 세포의 세포질 내 소핵 유무를 조사함으로써 유전독성을 평가하는 시험법이다. 최근 화장품 안전성 평가에 동물실험을 금지하거나 최소화하려는 노력이 확산되고 있어 유전독성 평가에 있어서도 기존의 동물실험이 아닌 새로운 in vitro 시험법이 요구되고 있다. 본 연구에서는 3차원 배양인공피부모델인 KeraSkin$^{TM}$을 이용하여 도포 처치된 물질의 유전독성을 평가하였다. 2종의 유전독성물질인 mitomycin C (MMC)와 methyl methanesulfonate (MMS)는 농도 의존적으로 세포독성과 소핵 형성이 유도된 반면, 대조물질인 4-nitrophenol (4-NP)와 trichloroethylene (TCE)에서는 농도 의존적으로 세포독성은 관찰되었으나 소핵은 형성되지 않았다. 따라서 인공피부모델을 이용한 소핵시험이 화장품과 같은 피부적용물질의 in vitro 유전독성 평가에 유용할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Micronucleus test is genotoxicity assay for detection of micronuclei in the cytoplasm of interphase cells. The reduction and replacement of in vivo toxicity testing on animals require the development of in vitro models to predict the genotoxicity or other tests for cosmetic products. In this study, we evaluated a genotoxicity assay for topically applied chemicals using a three-dimensional human reconstructed skin model, KeraSkin$^{TM}$. Two genotoxins, mitomycin C (MMC) and methyl methanesulfonate (MMS), induced significant dose-related increases in cytotoxicity and micronuclei induction in the skin model. In contrast, two non-genotoxins, 4-nitrophenol (4-NP) and trichloroethylene (TCE), induced cytotoxicity but not micronucleus formation. In conclusion, micronucleus test using human skin model may be useful for predicting in vitro genotoxic potentials of cosmetic products.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 in vitro 소핵시험 가이드라인 OECD TG 487, “In vitro mammalian cell micronucleous test”(adopted 2014.9.26.)를 참고하여[22], 인공피부모델에서 in vitro 소핵시험을 가능성을 평가하였다.

제안 방법

본 연구에서는 기존 피부부식시험과 피부자극시험의 평가지표로서 사용한 세포생존율 이외에 인공피부 모델에서의 소핵유발 빈도를 측정함으로써 세포독성 시험뿐 아니라 유전독성시험에서도 인체의 위해성을 예측할 수 있는 시스템으로서의 가능성을 확인하였다.

대상 데이터

사람 정상 피부각질세포를 분화시켜서 제조한 인공 피부인 KeraSkin^TM (Biosolution, Korea)을 사용하였다.KeraSkin^TM은 사람 피부각질세포를 12 mm Millicell^®(Millicell cell culture insert, MerckMillipore, Germany)에 접종하여 단층세포층 배양을 위해 7일간 서브머지 배양(submerged culture)하고 각질화 분화를 위해 14일간기-액 배양(air-liquid interface culture)하여 제조하였다.
소핵시험에 사용된 물질은 기존의 보고를 참고하여[23], 독성이 잘 알려진 2종의 genotoxin과 2종의 dermal non-carcinogens을 사용하였다(Table 1).

데이터처리

슬라이드당 2000개의 세포를 계수하고 이 중 binucleated cell과 micronuclei가 형성된 세포 수를 측정하여 binucleated cell 중 소핵이 생성된 세포의 비율(% of micronuclei / binucleated cell / 2,000 cells)을 산출하였다. 세포독성은 MTT assay (Sigma, USA)를 실시하여 세포생존율을 측정하였다.
슬라이드당 2000개의 세포를 계수하고 이 중 binucleated cell과 micronuclei가 형성된 세포 수를 측정하여 binucleated cell 중 소핵이 생성된 세포의 비율(% of micronuclei / binucleated cell / 2,000 cells)을 산출하였다. 세포독성은 MTT assay (Sigma, USA)를 실시하여 세포생존율을 측정하였다.

성능/효과

마우스 소핵 유발 물질인 MMC, MMS는 인공피부모 델에 도포하였을 경우 농도의존적으로 소핵을 유발하는 것을 관찰하였고 소핵유발 빈도 등이 소핵판정에 용이한 것으로 사료된다. 이러한 결과를 바탕으로 시험물질의 세포생존율에 근거한 처치 농도 설정과 소핵 유발 빈도 증가에 대한 기준 설정 등 세부적인 시험 방법에 대한 지속적인 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

후속연구

마우스 소핵 유발 물질인 MMC, MMS는 인공피부모 델에 도포하였을 경우 농도의존적으로 소핵을 유발하는 것을 관찰하였고 소핵유발 빈도 등이 소핵판정에 용이한 것으로 사료된다. 이러한 결과를 바탕으로 시험물질의 세포생존율에 근거한 처치 농도 설정과 소핵 유발 빈도 증가에 대한 기준 설정 등 세부적인 시험 방법에 대한 지속적인 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	in vitro 소핵시험은 무엇인가?	소핵(micronucleus)은 세포의 주핵에서 분리된 작은 핵으로, in vitro 소핵시험은 포유류 배양세포의 세포 분열 단계의 세포질 내 소핵 형성 유무를 조사함으로써 이수체 유발원(aneuploidy)과 염색체이상 유발원 (clastogen)을 모두 선별하는 염색체 손상에 대한 포괄 적인 근거를 제공하는 시험법이다[7-10].
	동물실험 금지 조치에 따라 인공피부모델을 이용하기 위한 연구 현황은 어떠한가?	최근 화장품의 동물실험 금지 조치에 따라 기존의 동물실험을 대체할 수 있는 여러 동물대체시험법이 개발되고 있으며 특히 실제 인체 피부와 유사한 인공피부모델을 이용한 연구가 활발히 진행 중이다. 인공피부모델을 활용한 관련 연구로는 피부 흡수, 분포 및 피부자극 시험들이 보고되고 있으며 OECD 테스트 가이드라인으로는 TG 431, “In vitro skin corrosion: human skin model test” (adopted 2004.4.13.)와 TG 439, “In vitro skin irritation: human epidermis test method” (adopted 2010.7.22.) 시험법이 인정되었고 유럽연합 ECVAM (European center for validation of alternative method)에서도 여러 번의 타당성 검증을 통해 신뢰성 있는 결과 도출 시험으로 인정하였다[11-12]. 국내에서도 2007년부터 인공피부모델을 이용하여 피부자극시험에 활용 하고자 연구개발을 진행하여 KeraSkin TM 을 이용한 피부자극 동물대체시험법 검증연구를 수행 중에 있다 [13-16].
	현행 유전독성 표준조합 시험법으로는 어떤 것들이 있는가?	현행 유전독성 표준조합 시험법은 박테리아를 이용한 복귀돌연변이시험, 포유류 배양세포를 이용한 in vitro 염색체이상시험 또는 마우스 림포마 TK (thymidine kinase) 시험, 설치류 조혈모세포를 이용한 in vivo 소핵 시험이 전세계적으로 사용하고 있으며 OECD에서도 동일 가이드라인을 따르고 있다[1-4]. ICH에서는 기존의 유전독성 가이드라인에 in vitro 포유류 배양세포를 이용한 소핵시험과 in vivo 동물 조직에서의 유전자혜 성시험(comet assay)을 추가하여 유전독성 가이드라인 ICH S2R1을 수정하였으며[5], 국내 의약품 등의 독성 시험기준(식약처 고시 2014-136호)에서도 이와 같은 유전독성 표준조합 시험법을 권고하고 있다[6].

참고문헌 (23)

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식약처, 의약품등의 독성시험기준: 식품의약품안전처고시 제 2014-136호 (2014).
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원문보기 상세보기
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OECD, In vitro mammalian cell micronucleous test, OECD Test Guideline No. 487 (2014).
T. Hu, Y. Kaluzhny, G. C. Mun, B. Barnett, V. Karetsky, N. Wilt, M. Klausner, R. D. Curren, and M. J. Aardema, Intralaboratory and interlaboratory evaluation of the EpiDerm 3D human reconstructed skin micronucleus (RSMN) assay, Mutation Research, 673(2), 100 (2009).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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