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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 대표적인 수변 식물인 갈대 추출물과 유산균을 이용하여 갈대 발효 추출물을 제조하고 그 발효물의 이화학적 특성 및 항산화, 미백, 주름개선 등의 생리 활성 증진 효과를 확인하고자 하였다.
- 본 연구는 대표적인 수변식물인 갈대(Phragmites communis Trinius) 뿌리 추출물을 발효 식품으로부터 분리한 유산균(L. rhamnosus)을 이용하여 발효를 진행하고 발효물의 피부 개선 관련 활성을 조사하였다. 고형분 함량 1%의 갈대 뿌리 추출물만을 이용하여 4일간 배양하였을 때 1.
제안 방법
- − 갈대 추출물의 유산균 배양에 의한 영향을 알아보기 위하여 고형분 함량 1%로 정량된 추출물에 유산균 L. rhamnosus를 1%가 되게 접종한 후 37℃에서 배양하면서 pH, 생균수, 총당 및 총페놀함량을 측정하였다(Fig. 1, Table I).
- Elastase 저해 활성은 시료 첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 표시하였고 양성 대조군으로는 100 µg/mL농도의 ursolic acid를 사용하여 시험을 진행하였다.
- Tyrosinase저해 활성은 시료 첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 표시하였고 양성 대조군으로는 기능성 미백 원료인 100 µg/mL 농도의 arbutin을 사용하여 시험을 진행하였다.
- 양성 대조군으로는 10 µg/mL 농도의 ascorbic acid를 사용하여 시험을 진행하였다.
- D.W. 에 녹인 7.4 mM 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothianoline-6- sulfonic acid(ABTS)와 2.6 mM potassium persulphate을 실온의 암소에서 하루동안 방치하여 ABTS+ radical를 형성시켰으며, 실험 직전에 ABTS+ 용액을 여러 단계로 희석시켜 O.D. 값을 0.8~0.9 사이로 조절하였다.
- − DPPH radical 소거능은 Blois15)의 방법을 변형하여 측정하였다.
- − 갈대는 2016년 2월 경북 상주시 낙동보 주변에서 채취하여 사용하였으며 발효에 사용한 유산균은 김치에서 분리한 Lactobacillus rhamnosus를 사용하여 실험을 진행 하였다. 채취한 갈대는 건조 후 근경을 1-3 cm로 잘게 분쇄 후 100 g의 갈대 근경을 70℃에서 물을 사용하여 24시간 추출하여 추출물을 제조하였다. 추출물의 농도를 고형분 함량 1%가 되게 희석 후 멸균하여 다른 성분은 첨가하지 않고 L.
- 배양 후 원심분리 및 감압 여과기를 사용하여 여과하여 균체를 제거한 후 rotary evaporate로 농축 후 동결건조하여 시료로 사용하였다. 유산균 균수의 측정은 채취된 시료를 멸균 생리식염수(0.9% NaCl)을 사용하여 10진 희석법에 따라 희석한 후 BCP첨가 평판 측정용 한천배지(0.5% peptone, 0.25% yeast extract, 0.1% dextrose, 0.1% polyoxyethylene sorbitan monooleate, 0.01% cysteine, 0.04% bromocresol purple, 1.5% agar)를 사용하여 37℃에서 배양한 후 생성된 집락을 3회 반복하여 측정하였다.
- 0 N Folin-Ciocalteu reagent 100 µL 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응한 후, microplate reader를 이용하여 720 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 총 페놀 함량을 계산하였다.
- 시료 50 µL에 희석된 ABTS+ 용액 1 mL를 가하여 상온의 암소에서 10분간 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. Reference는 시료 대신 D.W.를 사용하였으며, ABTS radical 소거능은 시료 첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 표시하였다. 양성 대조군으로는 10 µg/mL 농도의 ascorbic acid를 사용하여 시험을 진행하였다.
- − 발효 최적 조건을 설정하기 위하여 발효 시간별 시료를 이용하여 DPPH radical 소거능, tyrosinase 저해활성 및 elastase저해 활성을 측정하였다(Fig. 2).
- 3%로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 유산균 성장, 총페놀 함량, 항산화 활성 및 tyrosinase, elastase 저해활성을 감안하여 배양 일수를 4일로 선정하고 실험을 진행하였다. Lactobacillus sp.
- − 갈대 발효 시료의 항산화 활성을 알아보기 위해 발효 4일차 시료를 이용하여 DPPH 및 ABTS radical 소거능 확인하였다(Fig. 3).
- 27) 또한 elastase는 피부 조직에 탄력을 유지해주는 elastin 을 분해하여 피부 주름 생성의 하나의 원인으로 알려져 있어 이 두 가지 효소의 저해 활성 연구는 피부 개선에 유용한 평가법으로 알려져 있다.28) 갈대 발효 시료의 tyrosinase 및 elastase 저해 활성을 알아보기 위하여 갈대 뿌리 발효 시료에 대해 농도별로 시료를 제조하여 시험을 실시하였다(Fig. 4). 발효전 갈대 추출물의 tyrosinase 저해 활성은 500 µg/ mL의 시료 농도에서 11.
대상 데이터
- − 본 연구에서 사용된 microplate reader는 미국 Versa Max사의 제품을 rotary evaporate는 일본 Eyela사의 제품을 사용하여 연구를 진행하였다.
- − 갈대는 2016년 2월 경북 상주시 낙동보 주변에서 채취하여 사용하였으며 발효에 사용한 유산균은 김치에서 분리한 Lactobacillus rhamnosus를 사용하여 실험을 진행 하였다.
- 또한 일반성분 분석 및 생리활성 분석을 위해 사용한 Folin-Ciocalteu reagent, 1,1-diphenyl-2–picrylhydrazyl(DPPH), 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothianoline-6-sulfonic acid(ABTS), elastase, tyrosinase 및 기타 시약류는 sigma에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- − 실험결과는 SPSS(version 19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 분산분석(ANOVA)을 실시하였고 각 측정 평균값의 유의성(p＜0.05)은 Duncan’s multiple range test를 실시하여 검정하였다.
이론/모형
- − Elsatase 저해 활성은 James등18)의 방법에 따라 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0)에 1.0 mM N-succunyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide를 용해시킨 용액 180µL에 시료 20 µL를 첨가하여 5분간 상온에서 방치 후 2.5 unit/mL의 elastase 10 µL를 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- − Tyrosinase 저해 활성은 Jung 등17)의 방법에 따라 0.1 M phosphate buffer(pH 6.9) 100 µL에 시료 20 µL를 혼합하여 5분간 상온에서 방치 후 100 unit/mL의 mushroom tyrosinase 30 µL와 1.5 mM tyrosine 30 µL를 혼합하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- − 시료의 총 페놀 함량은 Singleton and Rossi method을 이용하여 Folin-Ciocalteu 시약이 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 분석하였다.
- 를 사용하였으며, DPPH radical 소거능은 시료 첨가구와 비첨가구(reference)의 흡광도 차이를 백분율(%)로 표시하였다. ABTS radical 소거능은 Pellegrin등16)의 ABTS+ cation decolorization assay 방법에 따라 측정하였다. D.
성능/효과
- 그 결과 총 균수는 배양 3일째 1.4×1010 CFU/mL 로 가장 높았다.
- 또한 tyrosinase와 elastase 저해 활성을 알아보기 위해 500 µg/mL의 시료 농도로 시험한 결과 발효전 시료의 tyrosinase와 elastase 저해활성이 각각 11.8, 1.2%에서 발효 2일차부터 저해 활성이 증가하기 시작하여 발효 4일차에 47.6, 83.3%로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 유산균 발효가 갈대 뿌리 추출물의 DPPH radical 소거능에 미치는 영향을 알아보기 위해 200 µg/mL의 시료 농도로 시험한 결과 발효전 시료의 DPPH radical 소거능은 29.5%였으나 발효 4일후 42.0%로 약 1.4배 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- 이는 유산균이 성장하면서 갈대 추출물의 유리당 및 cellulose등의 고분자 탄수화물이 가수분해 되어 유산균 증식의 탄소원으로 사용되어 그 양이 줄어든 것으로 생각되어진다. 반면 총페놀 함량은 배양 시간이 증가할수록 그 함량이 증가하여 배양 전 12.4 GAE mg/g에서 배양 4일째 25.5 GAE mg/g으로 약 2배 증가한 것으로 확인되었다. 식물 추출물 내의 페놀성 화합물은 당 또는 배당체 등과의 화합물 형태의 물질이 다량 존재하고 있어 발효 과정 중 미생물의 glycosidase의 가수분해에 의해 페놀성 화합물의 총 양이 증가한 것으로 생각되어진다.
- 그 결과 DPPH 및 ABTS radical 소거능은 농도 의존적으로 증가하는 것으로 확인되었고 발효전 DPPH 및 ABTS radical 소거능에 대한 IC50값은 각각 413.8, 413.6 µg/mL이었고 발효 후 시료의 IC50 값은 각각 303.3, 326.5 µg/mL로 확인되어 유산균 발효를 통한 radical 소거능이 유의적으로 증가했음을 확인할 수 있었다.
- 발효전 갈대 추출물의 tyrosinase 저해 활성은 500 µg/ mL의 시료 농도에서 11.8%의 저해 활성을 나타 내었으나 갈대 발효 시료 500 µg/mL의 시료 농도에서는 47.6%로 약 4배 증가하였고 발효 시료의 IC50 값은 528.7 µg/mL로 확인되었다.
- 발효 전 갈대 추출물의 elastase 저해 활성은 500 µg/mL의 시료 농도에서 1.2%의 저해 활성을 나타 내어 발효하기 전의 갈대 추출물은 elastase 저해 활성이 없는 것으로 생각되어지나 발효 시료 500µg/mL의 시료 농도에서는 83.3%의 높은 elastase저해 활성을 나타내었고 이때 발효 시료의 IC50값은 249.4 µg/mL로 확인되었다.
- 30) 갈대 추출물을 이용한 유산균 배양에서 L. rhamnosus는 발효 3일만에 1.4×1010 CFU/mL의 총 균수를 나타내어 고농도로 유산균이 배양되고 이는 갈대 발효 추출물의 총페놀 함량도 증가와 더불어 유산균 균체 및 유산균 대사산물의 영향으로 tyrosinase와 elastase 저해 활성이 크게 증가한 것으로 사료된다.
- 고형분 함량 1%의 갈대 뿌리 추출물만을 이용하여 4일간 배양하였을 때 1.0×1010 CFU/ mL 이상의 높은 농도의 유산균이 배양 되었고 총페놀 함량은 발효 전 12.4 GAE mg/g에서 발효 후 25.5 GAE mg/g으로 약 2배 증가한 것으로 확인되었다.
- 5 GAE mg/g으로 약 2배 증가한 것으로 확인되었다. 또한 DPPH, ABTS radical 소거능과 tyrosinase, elastase 저해활성 역시 발효 전과 비교하여 높게 나타났다. 이는 갈대 뿌리와 유산균 발효를 통해 천연 유래의 항산화 활성 및 피부개선 효능이 증가한 새로운 천연 발효 소재로의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
후속연구
- plantarum을 이용하여 금은화 추출물을 발효했을 경우 DPPH 및 ABTS radical 소거능에는 영향을 주지 않는다는 보고도 되어져 있다.24) 이는 발효 과정을 통해 추출물 성분의 생물 전환과 미생물의 2차 대사산물의 복합적인 영향을 받기 때문에 발효 소재 및 사용 균주에 따른 차이로 해석될 수 있을 것이다.
- 양성대조군으로 사용한 ursolic acid는 100 µg/ mL농도에서 약 53%의 저해 활성을 나타내어 발효 시료보다 높은 활성을 보이지만 갈대 추출물의 발효 과정을 통해 elastase 저해 활성이 새롭게 나타났고 단일 물질이 아닌 추출물의 활성으로는 높은 저해 활성을 보이기 때문에 향후 향장 소재로의 가능성이 높다고 할 수 있을 것이다.
- 다만 갈대 추출물 및 발효 시료의 생리활성에 관여하는 유효 물질, 지표 물질에 대한 분리·정제, 구조 동정 등에 대한 연구가 추가적으로 필요할 것으로 생각되어진다.
- 또한 DPPH, ABTS radical 소거능과 tyrosinase, elastase 저해활성 역시 발효 전과 비교하여 높게 나타났다. 이는 갈대 뿌리와 유산균 발효를 통해 천연 유래의 항산화 활성 및 피부개선 효능이 증가한 새로운 천연 발효 소재로의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다. 다만 발효에 의한 유효성분 변화, 성분 분석 및 피부 미백 관련 작용 기전에 대한 별도의 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이는 갈대 뿌리와 유산균 발효를 통해 천연 유래의 항산화 활성 및 피부개선 효능이 증가한 새로운 천연 발효 소재로의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다. 다만 발효에 의한 유효성분 변화, 성분 분석 및 피부 미백 관련 작용 기전에 대한 별도의 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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