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문제 정의
- 이전까지 상엽에 관한 연구로 桑葉 추출물이 세포 내 지방 축적 및 포도당 수송에 영향을 준다는 박 등7의 연구와 당뇨병 합병증에 관한 김 등8의 연구가 있었으나, 상엽의 항염증 작용에 초점을 맞춘 논문은 桑葉 단일 제제에 한해서는 박 등9의 연구 1편에 불과하다. 이에 저자는 비만에서 지방세포의 염증과정에 桑葉이 미치는 영향을 살펴보기 위해, 비만 실험동물 모델에 상엽추출물을 투여한 후, 인슐린 저항성 지수 및 지방세포 내 염증지표를 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 19~21 g의 C57BL/6 mouse(중앙실험동물, Korea)수컷을 12시간씩 낮과 밤이 교대되고, 40~70%의 습도가 유지되는 환경에서 먹이와 물은 자유롭게 먹도록 하면서 1주일간 적응기를 거쳤다. 그 후 정상군을 제외한 모든 실험군에 인슐린 저항성을 일으킨다고 알려진 60% fat diet(HFD, Research Diets, D12492)를 13주간 섭취시켜 비만을 유발하였다.
- 정상군을 제외한 나머지 3개 군들은 60% fat diet를 13주간 섭취시켜 비만과 제 2형 당뇨병을 유발 하였다. 고지방 식이 투여 8주 후, 정상군과 고지방식이군의 체중에 유의한 차이가 있음을 확인하고, 대조군에는 생리식염수를, 상엽 400 mg 투여군은 상엽추출물을 1일 400 mg/kg, 상엽 800 mg 투여군은 상엽추출물을 1일 800 mg/kg씩 5주간 경구 투여하였다(Table 1).
- 공복 혈당과 혈청 인슐린의 농도 그리고 그 두가지 수치로 계산되는 HOMA-IR은 내당능 진단이 가능한 대표적인 지표이지만17, 인슐린 분비결함과 인슐린 저항성이 공존하는 제 2형 당뇨병의 확진에는 OGTT가 더 정확하여18, 본 실험에서 각 실험군의 공복 혈당과 OGTT, 혈청 인슐린 농도, HOMA-IR을 모두 측정하였다. 공복 혈당에서 상엽 400 mg 투여군은 대조군에 비해 혈당 상승이 억제되었으나 유의성이 없었고, 상엽 800 mg은 혈당 상승을 유의하게 억제하였다.
- 따라서 본 연구에서는 면역반응의 정도를 알아보기 위해 CD11c, CD206, CD45가 발현 정도를 분석하였고, FACS을 통해 ATM과 CD45+cell, 대식세포와 반응하는 수용체의 퍼센티지를 측정하여 대식세포의 침착량과 염증반응의 정도를 측정하였다. 그 결과, 지방조직내 대식세포의 숫자와 CD45가 발현된 세포수는 대조군에서 정상군에 비해 유의하게 증가하였으며, 상엽 400 mg 투여군과 상엽 800 mg 투여군은 대조군에 비해 유의하게 감소하였다.
- 수컷 C57BL/6 mouse를 6마리씩 정상군(normal), 고지방 식이를 유발한 대조군(HFD), 상엽 400 mg 투여군(mori 400), 상엽 800 mg 투여군(mori 800)으로 나누었다. 정상군을 제외한 나머지 3개 군들은 60% fat diet를 13주간 섭취시켜 비만과 제 2형 당뇨병을 유발 하였다.
대상 데이터
- 상엽(Mori Folium)은 ◯◯대학교 한방병원에서 구입한 후 정선하였다. 상엽 1,000 g을 각각 80% 에탄올 1,500 ml에 넣고 heating mantle에서 2시간 동안 가열하여 추출하고 여과한 여액을 filter로 걸러냈다.
이론/모형
- Advantage RT for PCR Kit(Clontech, USA)를 이용하여 cDNA를 제작하였고, 실시간 정량 역전사 연쇄중합반응(quantitative real time-polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 이용하여 TNF-α, IFN-γ, IL-6 유전자의 발현을 측정하였다.
성능/효과
- 실험 12주째에 생쥐를 희생시킨 후, 개복하여 부고환 지방 조직을 채취하였고, phosphate buffered saline(PBS, Gibco, USA)에 2% bovine serum albumin(BSA, Gibco, USA)이 들어간 용액에 지방조직을 넣은 후, 가위를 이용하여 1~2 mm 크기의 작은 조각으로 잘랐다. 여기에 collagenase(Sigma, USA)와 DNase I(Roche, USA)를 넣고 37 ℃에서 20~25분간 흔들어 조직이 분쇄되도록 한 다음, 2% BSA/PBS에 5 mM EDTA를 넣은 용액을 각 tube에 넣고 섞은 후, 100 uM 필터(BD biosciences, USA)로 분쇄되지 않은 지방조직을 걸러내고, 1,000 rpm으로 3분간 원심 분리하였다.
- 역전사를 통해 얻어진 각각의 complementary DNA(cDNA)에 2x SYBR Reaction buffer, primers, dH2O를 혼합하여 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems®, USA)을 이용하여 연쇄중합반응을 시행하였다. 연쇄중합반응에 사용된 각각의 primer의 염기 서열은 TNF-α의 경우 5’-TTCTG TCTAC TGAAC TTCGG GGTGA TCGGT CC-3’과 5’-GTATG AGATA GCAAA TCGGC TGACG GTGTG GG-3’을, IFN-γ의 경우 5’-ACTGGCAAAAGGATGGTGAC-3’과 5’-TGAG CTCATTGAATGCTTGG-3’을, Il-6의 경우 5’-AACG ATGATGCACTTGCAGA-3’과 5’-GAGCATTGGAA ATTGGGGTA-3’을, housekeeping gene으로는 GAPDH의 경우 5'-AGTCCATGCCAT CACTGCCACC-3'과 5'-CCAGTGAGCTTCCCGT TCAGC-3'을 각각 사용하였다. 유전자 발현 분석은 SDS Software 2.
- 고지방 식이 투여 11주째에 생쥐의 tail vein에서 혈액을 BD microtainer serum separator tubes에 채취한 다음 실온에서 2,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하고, ultra sensitive mouse insulin ELISA kit(Crystal Chem INC, USA)를 이용하여 혈청 인슐린 농도를 측정하였다. 이 과정에서 96well antibody-coated microoxlate에 insulin standards 및 샘플을 5 μl씩 분주한 다음 4 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이를 5차례 세척 후, anti-insulin enzyme conjugate를 각 well에 분주하고 30분간 실온에서 반응시켰다.
- 따라서 본 연구에서는 면역반응의 정도를 알아보기 위해 CD11c, CD206, CD45가 발현 정도를 분석하였고, FACS을 통해 ATM과 CD45+cell, 대식세포와 반응하는 수용체의 퍼센티지를 측정하여 대식세포의 침착량과 염증반응의 정도를 측정하였다. 그 결과, 지방조직내 대식세포의 숫자와 CD45가 발현된 세포수는 대조군에서 정상군에 비해 유의하게 증가하였으며, 상엽 400 mg 투여군과 상엽 800 mg 투여군은 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 대식세포 중 CD45 세포의 비율은 대조군에서 정상군에 비해 유의하게 증가하였고, 상엽 800 mg 투여군에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다.
- 그 결과, 지방조직내 대식세포의 숫자와 CD45가 발현된 세포수는 대조군에서 정상군에 비해 유의하게 증가하였으며, 상엽 400 mg 투여군과 상엽 800 mg 투여군은 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 대식세포 중 CD45 세포의 비율은 대조군에서 정상군에 비해 유의하게 증가하였고, 상엽 800 mg 투여군에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. CD206가 발현된 세포의 수는 대조군에서 정상군에 비해 유의하게 증가하였고, 상엽 800 mg 투여군에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다.
- 본 연구 결과를 종합하면, 상엽은 비만이 유발된 동물모델에서 유의한 체중감소 효과를 보이지 않았지만, 간의 지방 침착과 지방 조직에서 대식세포의 증가와 침착을 억제하였다. 지방조직 내 대식세포의 활성을 감소시켜 염증매개인자를 억제하여 염증 반응이 억제되었고, 그로 인해 인슐린 저항성이 개선되었으며, 결과적으로 혈당 개선효과를 나타냈다.
- 본 연구에서 TNF-α는 대조군에서 정상군에 비해 유의하게 증가하였다. 상엽 400 mg 투여군은 대조군에 비해 감소하는 경향성을 보였으나 유의성은 없었고, 상엽 800 mg 투여군은 대조군에 비해 유의하게 감소하였다.
- 3. 상엽 400 mg 투여군과 桑葉 800 mg 투여군에서 HOMA-IR이 유의하게 감소하였다.
- 4. 상엽 400 mg 투여군과 桑葉 800 mg 투여군에서 경구 당부하 혈당 수치가 30분 후 유의하게 감소하였다.
- 2. 상엽 400 mg 투여군과 桑葉 800 mg 투여군에서 혈청 인슐린 농도가 유의하게 감소하였다.
- 6. 상엽 400 mg 투여군에서 adipose tissue macrophage(ATM)와 CD45+cells 그리고 CD11c+에 반응하는 ATM이 유의하게 감소하였다.
- 7. 상엽 800 mg 투여군에서 adipose tissue macrophage(ATM)와 CD45+cells 및 ATM과 CD45+ cells의 비율이 감소하였으며, CD206+와 CD11c+에 반응하는 ATM이 유의하게 감소하였다.
- 5. 상엽 800 mg 투여군에서 간의 무게가 유의하게 감소하였다.
- 1. 상엽 800 mg 투여군에서 공복 시 혈당이 유의하게 감소하였다.
- 8. 상엽 800 mg 투여군에서 지방세포의 TNF-α 유전자 발현이 유의하게 감소하였다.
- 실험군과 대조군에서 체내 지방조직 증가와 염증상태를 판별하는 중요한 지표19인 부고환 지방의 무게와 간 조직의 무게를 측정하였는데, 부고환 지방 조직의 무게는 대조군에서 정상군에 비해 유의 하게 증가하였고, 상엽 400 mg 투여군과 상엽 800 mg 투여군은 대조군에 비해 무게는 감소하는 경향성을 보였으나 유의성이 없었다. 간의 무게는 대조군에서 정상군에 비해 유의성 있는 무게 증가가 있었다.
- 이는 상엽이 염증 매개 인자인 TNF-α의 분비를 억제하는 효과가 있어, 인슐린 신호 전달 체계를 개선시키고 결과적으로 인슐린 저항성을 감소시킨다는 것을 의미한다. 앞서 언급한 HOMA-IR의 감소효과와 함께, 염증성 사이토카인의 증감과 인슐린 저항성의 정도가 비례하여 감소되었으며, 상엽이 항염증 효과와 인슐린 저항성 개선효과를 동시에 나타내는 기전을 설명해준다. 다만 추후 다른 염증매개인자에 대한 연구와 염증매개인자의 분비와 인슐린 저항성과의 관계에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
- 또한 IL-6 발현은 대조군에서 정상군에 비해 유의하게 증가하였지만, 상엽 400 mg 투여군과 상엽 800 mg 투여군에서는 대조군에 비해 유의한 변화는 없었다. 이는 상엽이 염증 매개 인자인 TNF-α의 분비를 억제하는 효과가 있어, 인슐린 신호 전달 체계를 개선시키고 결과적으로 인슐린 저항성을 감소시킨다는 것을 의미한다. 앞서 언급한 HOMA-IR의 감소효과와 함께, 염증성 사이토카인의 증감과 인슐린 저항성의 정도가 비례하여 감소되었으며, 상엽이 항염증 효과와 인슐린 저항성 개선효과를 동시에 나타내는 기전을 설명해준다.
- 본 연구 결과를 종합하면, 상엽은 비만이 유발된 동물모델에서 유의한 체중감소 효과를 보이지 않았지만, 간의 지방 침착과 지방 조직에서 대식세포의 증가와 침착을 억제하였다. 지방조직 내 대식세포의 활성을 감소시켜 염증매개인자를 억제하여 염증 반응이 억제되었고, 그로 인해 인슐린 저항성이 개선되었으며, 결과적으로 혈당 개선효과를 나타냈다. 따라서 상엽은 당대사를 정상화하고 만성염증상태를 개선하는 효과를 가지고 있어, 비만으로 인해 유발되는 대사 질환의 예방 및 치료에 중요하게 활용될 수 있을 것으로 생각한다.
후속연구
- 앞서 언급한 HOMA-IR의 감소효과와 함께, 염증성 사이토카인의 증감과 인슐린 저항성의 정도가 비례하여 감소되었으며, 상엽이 항염증 효과와 인슐린 저항성 개선효과를 동시에 나타내는 기전을 설명해준다. 다만 추후 다른 염증매개인자에 대한 연구와 염증매개인자의 분비와 인슐린 저항성과의 관계에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
- 지방조직 내 대식세포의 활성을 감소시켜 염증매개인자를 억제하여 염증 반응이 억제되었고, 그로 인해 인슐린 저항성이 개선되었으며, 결과적으로 혈당 개선효과를 나타냈다. 따라서 상엽은 당대사를 정상화하고 만성염증상태를 개선하는 효과를 가지고 있어, 비만으로 인해 유발되는 대사 질환의 예방 및 치료에 중요하게 활용될 수 있을 것으로 생각한다.
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