[논문]전 암컷 3배체 넙치(Paralichthys olivaceus)에 대한 효율적인 세포유전학 분석법

고민균; 정효선; 이효빈; 김동수

doi:10.5657/kfas.2016.0671

문제 정의

이에 본 연구에서는 킹넙치의 불임화를 위해 수정란을 저온 처리하여 전 암컷 3배체를 유도한 후 양식현장에서 쉽고 간편한 3배체 분석법을 보급하고자 다양한 세포유전학적 분석 방법들을 비교 검토하였다.

가설 설정

1. 저온에서 마취시킨 어체로부터 적정량의 조직을 얻는다.

제안 방법

3분 후 2-4℃로 45분간 저온 처리하였다. 1회 실험 시 각 실험군별로 수정난 30-50 cc를 처리하여 각 실험군에서 110개의 난을 3회 추출하여 결과를 도출하였고, 이들 실험을 3회 반복 수행하였다. 각 실험군의 부화율과 부화 후 난황을 흡수하지 못하고 죽는 자어의 빈도를 측정한 후, 생존율을 확인하였다.
1회 실험 시 각 실험군별로 수정난 30-50 cc를 처리하여 각 실험군에서 110개의 난을 3회 추출하여 결과를 도출하였고, 이들 실험을 3회 반복 수행하였다. 각 실험군의 부화율과 부화 후 난황을 흡수하지 못하고 죽는 자어의 빈도를 측정한 후, 생존율을 확인하였다. 종자생산은 제주시 우도수산에서 18-21℃의 수온 조건으로 사육하였다.
종자생산은 제주시 우도수산에서 18-21℃의 수온 조건으로 사육하였다. 단순하며 경제적인 넙치의 3배체 분석방법을 비교 검토하기 위해 세포 및 핵의 크기, flow cytometry, 염색체 분석, Ag-NOR banding 및 지느러미 조직으로부터 solid tissue technique (Klingerman and Bloom, 1977)에 의해 얻어진 세포에 대하여 silver staining을 수행하였다.
전 암컷 3배체 킹넙치 유도를 위해 3-4년생 대조군 넙치 암컷을 손으로 복부를 압박하여 난을 확보하였으며, Kang (2016)의 방법으로 유도된 자성발생성 수컷 킹넙치의 4가계(0219, 0335, 1697 및 1788) 및 대조군 수컷 넙치의 복부를 압박, 채정하여 수정 3분 후 2-4℃로 45분간 저온 처리하였다. 1회 실험 시 각 실험군별로 수정난 30-50 cc를 처리하여 각 실험군에서 110개의 난을 3회 추출하여 결과를 도출하였고, 이들 실험을 3회 반복 수행하였다.

대상 데이터

각 실험군의 부화율과 부화 후 난황을 흡수하지 못하고 죽는 자어의 빈도를 측정한 후, 생존율을 확인하였다. 종자생산은 제주시 우도수산에서 18-21℃의 수온 조건으로 사육하였다. 단순하며 경제적인 넙치의 3배체 분석방법을 비교 검토하기 위해 세포 및 핵의 크기, flow cytometry, 염색체 분석, Ag-NOR banding 및 지느러미 조직으로부터 solid tissue technique (Klingerman and Bloom, 1977)에 의해 얻어진 세포에 대하여 silver staining을 수행하였다.

성능/효과

05). 2배체의 비정상 개체 발생률은 대조군과 전 암컷 킹넙치의 경우 0-20.4%로 사용한 수컷 가계에 따라 큰 차이를 보였다. 저온 처리군의 경우에는 대조군(1.
1d). 그러나 핵형 분석결과 모두 acrocentric 염색체로 구성되어 있어 쉽게 3배체를 판단할 수 있는 마커로 사용할 수 있는 염색체가 확인되지 않았다. 이에 NOR 염색체 band-ing을 실시하여 그 핵형을 분석한 결과, 유도된 3배체 킹넙치의 중기 염색체 상에서 가장 큰 acrocentric 염색체 3개에서 NOR band (Fig.
5%로 다양하게 나타나, 사용된 자성발생성 수컷 킹넙치의 유전 형질이 생존율에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 더욱이 난황이 흡수된 전 암컷 3배체 킹넙치 자어라도 ‘1697’과 ‘1788’ 가계의 경우 먹이활동을 전혀 하지 않아 부화 후 12일경에는 대다수의 개체가 폐사하는 것으로 관찰되었다. 그러나 ‘0219’ 가계는 대부분의 개체들이 종자 크기로 성장하였다.
, 1990). 본 연구에서도 Fig. 1c와 같이 2배체와 3배체의 구별이 뚜렷하게 나타나 효율적인 방법으로 인정되었다. 그러나 flow cytometry 분석을 위한 장비가 매우 고가임을 고려할 때 양식어민들이 현장에서 사용하기에는 적당하지 않은 것으로 보인다.
(1994a, 1994b)에 의해 넙치의 3배체의 염색체는 72개의 염색체로 구성되어 있음이 보고된 바 있다. 본 연구에서도 일반염색에 의한 염색체 분석결과, 염색체 수가 72개로 나타나 3배체 임이 확인되었다(Fig. 1d). 그러나 핵형 분석결과 모두 acrocentric 염색체로 구성되어 있어 쉽게 3배체를 판단할 수 있는 마커로 사용할 수 있는 염색체가 확인되지 않았다.
1f). 이 방법은 어체를 살려두고 최소한의 조직을 얻어 염색까지 60분 이내에 분석이 가능하며, 세포 및 핵의 크기 측정 방법과 달리 핵 내 3개의 점만을 확인하면 되므로 매우 단순하고 신속한 방법으로 현장에서 쉽게 3배체 킹넙치를 판별할 수 있는 효율적인 방법으로 확인되었다.
그러나 핵형 분석결과 모두 acrocentric 염색체로 구성되어 있어 쉽게 3배체를 판단할 수 있는 마커로 사용할 수 있는 염색체가 확인되지 않았다. 이에 NOR 염색체 band-ing을 실시하여 그 핵형을 분석한 결과, 유도된 3배체 킹넙치의 중기 염색체 상에서 가장 큰 acrocentric 염색체 3개에서 NOR band (Fig. 1e)가 확인되어, 효율적인 배수체 분석방법으로 판명되었다. 그러나 어류의 염색체 분석 및 banding을 위하여는 전문적 기술이 필요함을 고려할 때 양식어민들이 현장에서 사용하기에는 효율적인 방법이 아닌 것으로 판단된다.
4%로 사용한 수컷 가계에 따라 큰 차이를 보였다. 저온 처리군의 경우에는 대조군(1.6%)과 ‘0219’ 가계(3.6%)의 3배체 처리군이 ‘1697’ 가계(68.5%)와 ‘1788’ 가계(24.5%)의 처리군보다 유의하게 낮게 나타나는 것으로 확인되었으나, ‘0335’ 가계는 난황 흡수 전 모두 폐사하여 유도된 전 암컷 3배체는 동일 처리조건 임에도 불구하고 생존율이 0-43.5%로 다양하게 나타나, 사용된 자성발생성 수컷 킹넙치의 유전 형질이 생존율에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 더욱이 난황이 흡수된 전 암컷 3배체 킹넙치 자어라도 ‘1697’과 ‘1788’ 가계의 경우 먹이활동을 전혀 하지 않아 부화 후 12일경에는 대다수의 개체가 폐사하는 것으로 관찰되었다.
지느러미 조직의 일부를 잘라 세포를 분리한 후 silver staining(Goodpasture and Bloom, 1975)을 수행한 결과, 분석된 핵 내에서 3개의 진한 점(silver staining positive spot)이 확인되었다(Fig. 1f). 이 방법은 어체를 살려두고 최소한의 조직을 얻어 염색까지 60분 이내에 분석이 가능하며, 세포 및 핵의 크기 측정 방법과 달리 핵 내 3개의 점만을 확인하면 되므로 매우 단순하고 신속한 방법으로 현장에서 쉽게 3배체 킹넙치를 판별할 수 있는 효율적인 방법으로 확인되었다.
현장에서 빠르고 간편한 넙치의 3배체 분석 방법을 확인하기 위해 우선 2배체와 3배체의 세포 및 핵의 크기를 분석한 결과(Fig. 1a, 1b), 본 방법은 경제적이고 간편하나 Wolters et al. (1982)의 방법대로 100개 정도의 세포 및 핵의 크기를 측정하여 통계처리 해야 함으로 현장에서 사용하기에는 많은 시간을 요하는 것으로 나타났다.

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