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문제 정의
- 미세아교세포에서 진뇌산 추출물의 항염증 효능을평가하기 위해, 먼저 LPS에 의해 유도되는 염증 매개 물질인 NO의 생성과 iNOS 단백질의 발현 증가에영향을 미치는지 알아보았다.
- . 뇌에서 항염증 효과는퇴행성 뇌질환의 주요 원인이 되는 만성 신경계 염증을 억제함으로써 다양한 신경계 질환으로부터 신경을 보호할 것으로 예상되므로, 본 연구에서도 파킨슨병의 예방 및 치료를 위해 진뇌산의 신경보호 효과에 추가적으로 과학적인 증거를 제시하기 위하여 LPS로 자극된 BV2 생쥐 미세아교세포의 염증반응에서의 효능을 평가하였다. 본 연구 결과에 따르면, 진뇌산은 미세아교세포에 독성을 일으키지 않는 농도 범위에서 LPS로 인한 NO와 PGE2와 같은 염증 매개인자들의 생성을 억제하였으며, 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생성도 억제하였다.
- 본 연구는 진뇌산의 신경세포 보호효능 및 그 기전에 대한 연구로서 SH-SY5Y 세포에서 MPP+에 의하여 유발되는 신경독성으로부터 방어하는 효과를 보이는데, 주로 Akt와 ERK 신호전달경로를 통하여 세포를 보호한다는 사실을 처음으로 보여주고 있다.
- 의 독성으로부터 보호 효능을 가지며, 미세아교세포에서는 LPS로 유도된 ERK 신호전달경로의 활성을 억제함으로써 강력한 항염증 효능을 보였다. 본 연구를 통하여 진뇌산의 파킨슨병 예방 및 치료제로서의 가능성과 효용성을 두 가지 세포모델을 통하여 증명하였다.
- 저자는 임상에서 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환의예방 및 치료 목적으로 사용 중인 한약재 중에 원지(遠志, Polygalae Radix), 하고초(夏枯草, PrunellaeSpica), 자소엽(紫蘇葉, Perillae Herba), 화피(樺皮, Betulae Cortex), 금은화(金銀花, Lonicerae Flos)등이 신경계에 작용하여 신경세포 손상으로부터 보호효과를 나타낼 것으로 예상되어 새로운 처방을 구성하였다. 본 연구에서는 새 처방을 진뇌산(鎭腦散, Jinnoe-san, JNS)이라 명명하고, MPP+에 의해 신경독성이 유도된 SH-SY5Y 세포와 LPS에 의해 염증반응이 유도된 BV2 생쥐 미세아교세포에서 신경독성보호효능과 항염 효능을 각각 평가하고, 그 기전을연구함으로써 파킨슨병의 예방, 개선 및 치료 후보제로서의 가능성을 확인하였기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- MPP+ 처리에 따른 SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아 기능 손상 및 진뇌산 추출물의 효과를 평가하기위하여 MMP 값 변화 정도를 측정하고자 준비된 세포들에 막투과성 양이온 형광 dye인 Rh123을 0.05 μg/ml로 처리하여 30분 동안 염색하였다.
- SH-SY5Y에서 세포보호 효능 연구를 위해, 먼저진뇌산 추출물의 농도 범위를 설정하고자MTT 분석법을 이용하여 세포 생존율을 측정해 보았다.
- 세포 내 ROS 생성 변화를 확인하기 위하여 SH-SY5Y세포에 1 mM의 MPP+를 단독으로 처리하거나, 100 μg/ml의 진뇌산 추출물을 1시간 전처리 후 MPP+를 재처리하였다.
- 진뇌산 추출물 처리가 세포생존율에 미치는 영향과MPP+ 처리에 따른 세포 손상 보호효과를 확인하기위하여 MTT assay를 이용하였다.
- 진뇌산 추출물이 BV2 생쥐 미세아교세포의 증식에영향을 미치는지 알아보기 위해 MTT 분석법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
- 24시간 배양 후, MTT 시약을 최종농도 0.2 mg/ml로 처리하여 37℃에서 2시간 동안반응시킨 다음 배지를 제거하고 DMSO 100 μl를 첨가하여 각 well에 생성된 formazan crystals을 모두녹인 후, GENios-basic microplate reader (TecanAustria GmbH, Grödig, Austria)로 540 nm에서흡광도를 측정하였다.
- 30분후, 세포들을 모아 H2DCF-DA 5 μM로20분간 반응시킨 후, 원심분리하여 상층액을 제거하고 PBS를 첨가하여 세포를 부유시킨 다음, CytoFLEXflow cytometer (Beckman Coulter)에 적용시켜ROS 값의 변화를 분석하였다.
- MPP+ 1 mM로 유도된 세포독성으로부터 진뇌산추출물의 신경세포 보호 효과를 나타내는 농도를 결정하기 위하여 진뇌산 추출물을 10, 50 및 100 μg/ml의농도로 1시간 동안 전처리하고, 1 mM의 MPP+를 처리하여 24시간 후 MTT 분석법으로 확인하였다.
- 분리된 단백질을polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Millipore,Billerica, MA, USA)으로 전이시킨 다음, 5% skimmilk를 1시간 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한blocking을 실시하였다. PARP, caspase-3, Bcl2,iNOS, COX-2, ERK, JNK, p38에 대한 1차 항체들을 4℃에서 over night 반응시키고, PBST (PBSwith Tween 20)로 3회 세척한 후, 뒤이어 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시킨 다음 PBST로 3회 세척후, 암실에서 enhanced chemiluminoescence (ECL)solution (Amersham, Piscataway, NJ, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의발현 변화를 분석하였다.
- 다음으로 SH-SY5Y cell에 100 µg/ml진뇌산을 전처리한 후, MPP+가 있거나 없는 상태에서 인산화된 형태의 Akt 발현양상을 살펴보았다.
- 다음으로 진뇌산 추출물의 신경세포 보호효과가 산화적 스트레스로 인한 미토콘드리아 기능 손상의 방어와 연관이 있는지 알아보기 위해 SH-SY5Y 세포에서 미토콘드리아의 막전위 변화를 flow cytometry로측정하였다. 그 결과, 1 mM의 MPP+ 처리군은 control군에 비해 형광의 강도가 현저하게 감소하여 미토콘드리아의 기능이 손상된 세포가 38.
- , Newtown, CT, USA)로 세포를 균질화시킨 후, 13,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액에 있는 단백질을 분리하였다. 단백질의 농도는 bicinchoninicacid (BCA) protein assay kit (Thermo Scientific)를 이용하여 정량한 다음, Laemmli sample buffer(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)와 혼합하여, 동량의단백질을 sodium dodecyl sulphfate (SDS)-polyacrylamidegel에서 전기영동을 실시하였다. 분리된 단백질을polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Millipore,Billerica, MA, USA)으로 전이시킨 다음, 5% skimmilk를 1시간 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한blocking을 실시하였다.
- . 따라서, LPS로 활성화된 BV2 세포의 염증반응을 진뇌산 추출물이 MAPK 신호전달경로을 통하여억제하는지 western blot을 통하여 확인해 보았다. 그 결과, MAPK의 주요 kinase인 extracellular signal-regulatedkinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK)및 p38 MAPK의 인산화가 LPS 처리에 의해 강하게유도된 반면, 진뇌산 추출물의 전처리는 100, 300,500 μg/ml에서 농도 의존적으로 ERK 인산화가 억제되고, JNK와 p38 MAPK의 인산화에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(Figure 10).
- 따라서, 향후 실험에서는 진뇌산 추출물의 처리를 최고 500 μg/ml 농도까지 처리하는 것으로 실험을 진행하였다.
- 05 μg/ml로 처리하여 30분 동안 염색하였다. 반응이 끝난 후상층액을 제거하고 trypsin으로 세포를 회수한 후, 1% FBS가 함유된 PBS를 첨가하여 세포를 부유시킨다음 CytoFlex flow cytometer (Beckman Coulter,Brea, CA, USA)에 적용시켜 MMP의 변화를 측정하였다.
- 단백질의 농도는 bicinchoninicacid (BCA) protein assay kit (Thermo Scientific)를 이용하여 정량한 다음, Laemmli sample buffer(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)와 혼합하여, 동량의단백질을 sodium dodecyl sulphfate (SDS)-polyacrylamidegel에서 전기영동을 실시하였다. 분리된 단백질을polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Millipore,Billerica, MA, USA)으로 전이시킨 다음, 5% skimmilk를 1시간 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한blocking을 실시하였다. PARP, caspase-3, Bcl2,iNOS, COX-2, ERK, JNK, p38에 대한 1차 항체들을 4℃에서 over night 반응시키고, PBST (PBSwith Tween 20)로 3회 세척한 후, 뒤이어 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시킨 다음 PBST로 3회 세척후, 암실에서 enhanced chemiluminoescence (ECL)solution (Amersham, Piscataway, NJ, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의발현 변화를 분석하였다.
- 파킨슨병의 치료는 현재 약물요법과 수술로 증상을 완화하고 질병의 진행을 늦추는 수준으로 근본적인 치료제는 아직 없는 실정이므로, 새로운 치료법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 근래에는예방 및 뇌기능 향상을 목적으로 또는 양방의 표준치료법과 병행하여 치료의 상승작용 및 부작용 감소를 목표로 전통의학 및 보완대체요법에 근거를 둔 새로운 약물 치료제 개발 연구가 활발하다. 이러한 연구동향에 발맞추어 파킨슨병의 예방 및 치료를 위한새로운 한약 처방 개발을 위해 신경세포 및 미세아교세포 를 이용하여 진뇌산 추출물의 신경세포 보호 효능 및 미세아교세포의 염증 억제효능을 평가하였다.
- 이를 바탕으로 진뇌산 추출물이 신경세포를 보호하는 최적의 농도를 100 μg/ml로 결정하고, 향후 다양한 실험을 진행하였다.
- Apoptosis는 미토콘드리아의 기능이상이 중요한 작용을 하는데, 미토콘드리아 막투과성의 변화가 유발되면, 미토콘드리아내에 존재하는 cytochrome C와 같은 apoptosis 유발 인자들을 세포질로 방출시키면서 apoptosis 과정을 개시한다26). 이를 바탕으로, MPP+가 세포내 미토콘드리아에 손상을 일으키는지 또는 산화적 스트레스를 유발하는지를 미토콘드리아의 막전위가 떨어지고ROS 생성이 증가되는 것을 flow cytometry로 보여줌으로써 확인하였다. 반면, 100 μg/ml 농도의 진뇌산 추출물의 처리는 MPP+로 인한 미토콘드리아 막전위하강과 ROS 생성 증가를 유의하게 억제시키는 것을 확인함으로써 MPP+로 인한 미토콘드리아 기능이상 및 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호한다는것을 알 수 있었다.
- 이를 위하여 세포배양용 96 well plate에 해당 세포를 6×103 cells/well로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후 다양한 농도의 진뇌산 추출물을 1시간 전처리한 후 MPP+ 1 mM을 처리하였다.
- 이후 배양 배지를 원심분리하여 상층액 100 μl씩 취한 다음, PGE2 parameter assay kit (R&D Systems, Minneapolis,MN, USA)와 TNF-α ELISA kits (Ab Frontier,Seoul, Korea)를 이용하여 PGE2와 TNF-α의 양을측정하였다.
- 저자는 임상에서 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환의예방 및 치료 목적으로 사용 중인 한약재 중에 원지(遠志, Polygalae Radix), 하고초(夏枯草, PrunellaeSpica), 자소엽(紫蘇葉, Perillae Herba), 화피(樺皮, Betulae Cortex), 금은화(金銀花, Lonicerae Flos)등이 신경계에 작용하여 신경세포 손상으로부터 보호효과를 나타낼 것으로 예상되어 새로운 처방을 구성하였다. 본 연구에서는 새 처방을 진뇌산(鎭腦散, Jinnoe-san, JNS)이라 명명하고, MPP+에 의해 신경독성이 유도된 SH-SY5Y 세포와 LPS에 의해 염증반응이 유도된 BV2 생쥐 미세아교세포에서 신경독성보호효능과 항염 효능을 각각 평가하고, 그 기전을연구함으로써 파킨슨병의 예방, 개선 및 치료 후보제로서의 가능성을 확인하였기에 보고하는 바이다.
- Figure6B에서 보여주는 바와 같이, 1 mM의 MPP+를 처리시, Akt의 인산화는 현저하게 감소하였고, 진뇌산의전처리는 MPP+로 인한 Akt 인산화의 감소를 억제하였다. 진뇌산 추출물 처리에 의한 Akt와 ERK 활성화가 MPP+로 인한 미토콘드리아 기능의 손상을 보호하는데 직접적으로 영향을 미치는지 확인하기 위하여, Akt 억제제인 LY294002와 ERK 억제제인 PD98059를 전처리한 후, 미토콘드리아 막전위 변화를 관찰하였다. 그 결과, LY294002와 PD98059 각각의 전처리는 MPP+로 인한 미토콘드리아의 기능 손상을 억제하였던 진뇌산 추출물의 보호효능을 거의 완벽하게막는 것을 확인하였다(Figure 6C).
- 진뇌산 추출물의 신경독성 보호 효과 기전을 살펴보기 위하여 세포 생존과 관련된 신호전달경로인 Akt와 ERK 신호경로를 western blot을 통하여 확인해보았다. SH-SY5Y 세포에 100 µg/ml 진뇌산을 10분에서 12시간까지 시간에 따라 처리해본 결과, 진뇌산추출물은 Akt의 인산화가 10분부터 유도되어 1시간째 최고의 발현량에 달한 뒤, 서서히 감소하며 12시간까지 인산화가 강하게 유지되는 것을 확인하였다(Figure 6A).
- 진뇌산 추출물의 신경세포 보호효과가 산화적 스트레스 억제에 의한 것인지 알아보기 위해 SH-SY5Y세포에서 활성산소의 생성 정도를 DCFH가 활성산소에 의해 산화되어 형광을 띄는 DCF로 전환되는 원리를 이용하여 flow cytometry로 측정하였다. 그 결과, 1 mM의 MPP+ 처리는 ROS의 생성이 현저히 증가된 반면, 진뇌산 100 µg/ml을 전처리한 경우는 MPP+ 로 유도되는 ROS 생성을 억제하는 것으로 나타났다(Figure 3).
- 진뇌산 추출물이 LPS로 자극된 BV2 세포로부터 생성되는 또 다른 염증매개 물질인 PGE2와 염증성사이토카인인 TNF-α에 영향을 미치는지 알아보기 위해 각각의 ELISA kit를 이용하여 분비량을 측정하였다.
- 본 연구에 사용된 遠志(Polygalae Radix), 夏枯草(Prunellae Spica), 紫蘇葉(Perillae Herba), 樺皮(Betulae Cortex), 金銀花(Lonicerae Flos)는 ㈜옴니허브(Daegu, Korea)에서 구입하여 선별하고 정선한후 사용하였고, 처방의 구성 비율은 다음과 같다(Table 1). 진뇌산의 약재 무게의 8배에 해당하는 증류수를 가하여 열탕 추출기(100℃)에서 4시간 동안추출한 후, 여과지(Whatman No. 3 filter paper, WhatmanInternational Ltd., Maidstone, England)로 두 번 여과하고, 감압 증류장치(rotary vaccum evaporator,EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하고, 동결건조기(freeze dryer, EYELA)로 동결건조하여 분말화하였다. 추출물의 수율은 14.
- 파킨슨병과 관련된 연구들은 주로 도파민계 신경세포주인 SH-SY5Y 세포에 신경독성 물질로 잘 알려진MPP+, 6-OHDA 또는 rotenone 등을 처리하여 파킨슨병의 시험관 모델로 흔히 사용하는데,1,22-24) 본 연구는 SH-SY5Y 세포에 MPP+를 이용하여 신경독성을 유발하는 모델을 이용하였다. 예비실험으로 MPP+ 가 SH-SY5Y 세포에 미치는 독성을 확인하고자MPP+를 0.
대상 데이터
- Anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), anticaspase-3및 anti-Bcl2 항체는 Cell SignalingTechnology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였고, anti-COX-2, anti-iNOS, anti-β-actin 항체, horseradishperoxidase-conjugated goat anti-mouse IgG,horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbitIgG는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 遠志(Polygalae Radix), 夏枯草(Prunellae Spica), 紫蘇葉(Perillae Herba), 樺皮(Betulae Cortex), 金銀花(Lonicerae Flos)는 ㈜옴니허브(Daegu, Korea)에서 구입하여 선별하고 정선한후 사용하였고, 처방의 구성 비율은 다음과 같다(Table 1).
- 실험에 사용된 인간 신경세포주인 SH-SY5Y 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였고, 생쥐 신경소교세포주인 BV2 세포는 전남대학교 의과대학 해부학교실에서 분양받아 사용하였으며, 세포의 배양을 위해 10% 우태아혈청(fetal bovineserum, FBS, WELGENE, Daegu, Korea) 및 1%의 penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco's ModifiedEagle's Medium (DMEM, WELGENE) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
데이터처리
- 05 수준에서 Tukey’smultiple comparison test를 실시하였다. 모든 통계분석은 GraphPad Prism software (GraphPad SoftwareInc., San Diego, CA, USA)를 사용하였으며, P값이0.05 미만인 것을 유의한 것으로 판정하였다.
- 실험 결과들은 평균(mean) ± 표준편차(standarddeviation, SD)로 나타냈으며, 유의성을 검정하기 위하여 일원분산분석(one way analysis of variance,ANOVA)을 실시한 후 p < 0.05 수준에서 Tukey’smultiple comparison test를 실시하였다.
이론/모형
- Cells were treated with various concentrations of JNS extract(10, 50, 100, 300, or 500 µg/ml) for24 h. Cell viability was determined by MTT assay. Values were expressed as percentages of the non-treated control.
- Cells were treated with various concentrations of JNS (50, 100, 300, or 500 µg/ml) for 24 h. Cell viability was determined by an MTT assay. Values were expressed as percentages of the non-treated control.
- SH-SY5Y cells were treated with JNS(10, 50, 100 μg/ml) in the absence or presence of 1 mM MPP+for 24 h. The cell viability was measured using an MTT assay. (Significant vs.
성능/효과
- 본 연구의 결과를 요약해보면, 진뇌산 추출물이 신경세포에서 Akt와 ERK 신호전달경로의 활성을 통하여 MPP+의 독성으로부터 보호 효능을 가지며, 미세아교세포에서는 LPS로 유도된 ERK 신호전달경로의 활성을 억제함으로써 강력한 항염증 효능을 보였다.
- 따라서 진뇌산 (100 µg/ml)의 전처리가 MPP+ 로 유발된 apoptosis를 억제하는지 apoptosis와 연관된 단백질인 PARP, caspase-3 및 Bcl2를 westernblot을 통해 확인하였다. Control군과 비교하였을 때MPP+를 처리한 경우, PARP와 caspase-3의 proformband가 현저히 줄어들었고, Bcl2 band 역시 희미해진 것으로 보아 apoptosis가 진행된 것을 알 수 있었다(Figure 5). 반면 진뇌산 100 µg/ml 전처리 후MPP+를 처리하였을 때, PARP, caspase-3 및 Bcl2모두 발현이 감소되지 않고 control군과 유사하게 강한 발현을 보였다(Figure 5).
- LPS 처리는 BV2 세포가 배양액 속으로 분비한 PGE2의 양이 현저히 증가된 반면, 진뇌산 추출물을 100, 300 또는 500 μg/ml 농도로 전처리시, 농도 의존적으로 PGE2의 생성이 현저하게 억제되었다(Figure 9A).
- SH-SY5Y 세포에 100 µg/ml 진뇌산을 10분에서 12시간까지 시간에 따라 처리해본 결과, 진뇌산추출물은 Akt의 인산화가 10분부터 유도되어 1시간째 최고의 발현량에 달한 뒤, 서서히 감소하며 12시간까지 인산화가 강하게 유지되는 것을 확인하였다(Figure 6A).
- 그 결과, 1 mM의 MPP+ 처리군은 control군에 비해 형광의 강도가 현저하게 감소하여 미토콘드리아의 기능이 손상된 세포가 38.93%로 관찰되었으나, 진뇌산(100 µg/ml) 전처리군은 16.5%를 나타내며 MPP+ 처리군에 비해 형광의 강도가 통계학적으로유의하게 증가하였다(Figure 4).
- 그 결과, 1 mM의 MPP+ 처리는 ROS의 생성이 현저히 증가된 반면, 진뇌산 100 µg/ml을 전처리한 경우는 MPP+ 로 유도되는 ROS 생성을 억제하는 것으로 나타났다(Figure 3).
- 진뇌산 추출물 처리에 의한 Akt와 ERK 활성화가 MPP+로 인한 미토콘드리아 기능의 손상을 보호하는데 직접적으로 영향을 미치는지 확인하기 위하여, Akt 억제제인 LY294002와 ERK 억제제인 PD98059를 전처리한 후, 미토콘드리아 막전위 변화를 관찰하였다. 그 결과, LY294002와 PD98059 각각의 전처리는 MPP+로 인한 미토콘드리아의 기능 손상을 억제하였던 진뇌산 추출물의 보호효능을 거의 완벽하게막는 것을 확인하였다(Figure 6C). 이를 통하여 진뇌산의 신경세포 보호 효능에 Akt와 ERK의 활성화가직접적으로 관여한다는 것을 알 수 있었다.
- 그 결과, MAPK의 주요 kinase인 extracellular signal-regulatedkinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK)및 p38 MAPK의 인산화가 LPS 처리에 의해 강하게유도된 반면, 진뇌산 추출물의 전처리는 100, 300,500 μg/ml에서 농도 의존적으로 ERK 인산화가 억제되고, JNK와 p38 MAPK의 인산화에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(Figure 10).
- 그 결과, 진뇌산 추출물을 0~500 μg/ml 농도의 범위로 처리하였을때, BV2 생쥐 미세아교세포의 세포 생존율에는 영향을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있었다(Figure7).
- 다른 여러 연구 결과들과 마찬가지로 본 연구에서도 진뇌산 추출물이 apoptosis로부터 신경세포 보호효과를 가진다는 것을 여러 실험방법들을 통하여 증명하였고, 이 효과는 Akt와 ERK신호전달경로를 통하여 MPP+에 의한 신경독성을 억제한다는 것을 확인하였으므로, 신경세포를 보호할 수 있는 새로운 처방 개발과 그 효능의 기전을 밝힌것에 큰 의의가 있다.
- 따라서, 진뇌산의항염증 효능의 기전을 확인하고자 LPS로 자극된 BV2세포에서 ERK, JNK, p38을 western blot으로 분석해 본 결과, BV2 세포에서 LPS에 의해 ERK,JNK, p38 모두 인산화가 증가되었으나, 진뇌산 추출물의 전처리는 ERK의 인산화는 억제되었으나, JNK와 p38에는 큰 영향을 미치지 못하였다. 따라서 미세아교세포에서 진뇌산이 LPS에 의한 ERK의 활성화를 억제시킴으로써 항염증 효능을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
- 따라서 진뇌산 (100 µg/ml)의 전처리가 MPP+ 로 유발된 apoptosis를 억제하는지 apoptosis와 연관된 단백질인 PARP, caspase-3 및 Bcl2를 westernblot을 통해 확인하였다.
- 따라서 진뇌산 추출물의 신경세포 보호 효능의 기전연구를 위하여, Akt와 ERK 그리고 이들의 인산화된형태의 단백질들을 western blot으로 확인해 본 결과, MPP+에 의해 감소되었던 Akt의 인산화가 진뇌산 추출물의 전처리에 의해 복구되는 것을 확인할 수있었고, 진뇌산 추출물을 시간 의존적으로 100 μg/ml을처리시, Akt와 ERK의 인산화가 잘 유도되는 것을 알 수 있었다.
- 또한, 미토콘드리아 막전위 변화를 통한 신경세포 독성측정에서 Akt와 ERK 억제제인 LY294002와 PD98059의 전처리로 진뇌산 추출물의처리에 의한 Akt와 ERK 활성화를 미리 억제시킨 다음, 약물의 효능을 확인해 본 결과, LY294002와 PD98059의 처리에 의해 진뇌산 추출물의 미토콘드리아 기능손상에 대한 보호 효능이 없어지는 것을 알 수 있었다. 따라서, 이 결과는 진뇌산 추출물이MPP+의 신경독성으로부터 Akt와 ERK 신호전달경로를 통하여 신경보호효과가 있다는 기전을 뒷받침해주었다. 최근 황백(黃柏, Phellodendri Cortex), 봉독약침액 및 소속명탕(小續命湯)과 같이 생약 또는한약 처방들을 이용한 신경세포 보호효과에 대한 연구들이 보고되고 있으며, 한의학 고서에 나오는 처방과 한약재를 활용한 치료제 Hepad가 MPP+로 인한SH-SY5Y 세포의 apoptosis를 억제하고, 6-OHDA로 유발된 파킨슨병 동물 모델에서도 치료 효과가 있다고 보고되었다30-33).
- 대표적인 염증성 매개인자로 잘 알려져 염증 반응에서 발열 및 통증의 매개체로 작용하는 PGE2의 합성에 관여하는 COX-2 단백질의 발현 또한 분석해 본 결과, 진뇌산 추출물의전처리가 LPS로 유도된 COX-2 단백질의 발현 증가양상에 어떠한 영향도 미치지 않았다(Figure 8B). 따라서, 진뇌산 추출물은 LPS로 활성화된 microglia에서 iNOS 단백질의 발현 억제를 통하여 염증 반응에중요한 매개체로 작용하는 NO의 생성을 효과적으로차단하는 것을 확인하였다.
- 반면 진뇌산 100 µg/ml 전처리 후MPP+를 처리하였을 때, PARP, caspase-3 및 Bcl2모두 발현이 감소되지 않고 control군과 유사하게 강한 발현을 보였다(Figure 5). 따라서, 진뇌산 추출물의 전처리는 MPP+로 유발된 apoptosis로부터 세포보호 효과가 있음을 확인하였다.
- MAPK (Mitogen-activated protein kinases)는ERK, JNK, p38 등의 세 종류가 포함되며, 이들은면역 및 염증반응의 신호전달경로를 매개하거나, 세포 분화 및 세포 증식을 조절한다. 따라서, 진뇌산의항염증 효능의 기전을 확인하고자 LPS로 자극된 BV2세포에서 ERK, JNK, p38을 western blot으로 분석해 본 결과, BV2 세포에서 LPS에 의해 ERK,JNK, p38 모두 인산화가 증가되었으나, 진뇌산 추출물의 전처리는 ERK의 인산화는 억제되었으나, JNK와 p38에는 큰 영향을 미치지 못하였다. 따라서 미세아교세포에서 진뇌산이 LPS에 의한 ERK의 활성화를 억제시킴으로써 항염증 효능을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
- 따라서 진뇌산 추출물의 신경세포 보호 효능의 기전연구를 위하여, Akt와 ERK 그리고 이들의 인산화된형태의 단백질들을 western blot으로 확인해 본 결과, MPP+에 의해 감소되었던 Akt의 인산화가 진뇌산 추출물의 전처리에 의해 복구되는 것을 확인할 수있었고, 진뇌산 추출물을 시간 의존적으로 100 μg/ml을처리시, Akt와 ERK의 인산화가 잘 유도되는 것을 알 수 있었다. 또한, 미토콘드리아 막전위 변화를 통한 신경세포 독성측정에서 Akt와 ERK 억제제인 LY294002와 PD98059의 전처리로 진뇌산 추출물의처리에 의한 Akt와 ERK 활성화를 미리 억제시킨 다음, 약물의 효능을 확인해 본 결과, LY294002와 PD98059의 처리에 의해 진뇌산 추출물의 미토콘드리아 기능손상에 대한 보호 효능이 없어지는 것을 알 수 있었다. 따라서, 이 결과는 진뇌산 추출물이MPP+의 신경독성으로부터 Akt와 ERK 신호전달경로를 통하여 신경보호효과가 있다는 기전을 뒷받침해주었다.
- 반면, 100 μg/ml 농도의 진뇌산 추출물의 처리는 MPP+로 인한 미토콘드리아 막전위하강과 ROS 생성 증가를 유의하게 억제시키는 것을 확인함으로써 MPP+로 인한 미토콘드리아 기능이상 및 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호한다는것을 알 수 있었다.
- 진뇌산 추출물이 MPP+로유도된 apoptosis를 억제할 수 있는지 apoptosis와관련된 단백질들을 western blot으로 분석한 결과, MPP+가 미토콘드리아 막에 존재하는 Bcl-2 family중 anti-apoptotic protein인 Bcl-2를 감소시키고, caspase cascade 경로의 가장 하위단계인 caspase-3의 proform이 감소되고, 이것의 표적단백질인 PARP의 proform도 감소되는 것으로 보아 활성화가 일어나 미토콘드리아 의존적인 내인성 경로의 apoptosis가잘 유도된 것을 알 수 있었다. 반면, 진뇌산 추출물의 처리는 MPP+에 의한 Bcl-2와 caspase-3 및PARP의 proform들의 감소를 억제시켜 control군의 발현량과 거의 비슷한 것을 확인할 수 있었다.
- 본 연구 결과에 따르면, 진뇌산은 미세아교세포에 독성을 일으키지 않는 농도 범위에서 LPS로 인한 NO와 PGE2와 같은 염증 매개인자들의 생성을 억제하였으며, 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생성도 억제하였다.
- COX는 지속적으로 발현하여 정상적인 생리적 기능을 담당하는 COX-1과 면역 및 염증신호들에 반응하여 만들어지는 COX-2로 나뉘어진다36). 본 연구에서는 LPS로 자극된 BV2 세포에서 iNOS의 발현 증가가 진뇌산 추출물 처리에 의해 감소되었으나, PGE2의 생성과 연관이 있는 COX-2의발현에는 영향을 미치지 않았다. PGE2의 분비량은 COX-2 유래의 PGE2 합성과 15-hydroxyprostagladindehydrogenase (15-PGDH)에 의한 PGE2 분해의 정도에 따라 결정되는데35,36), 진뇌산 추출물이 COX-2에 영향을 미치지 않는 것으로 보아 15-PGDH의 활성화로 인해 PGE2의 생성을 억제하는 것으로 사료된다.
- 를 이용하여 신경독성을 유발하는 모델을 이용하였다. 예비실험으로 MPP+ 가 SH-SY5Y 세포에 미치는 독성을 확인하고자MPP+를 0.5 ~ 2.5 mM로 24시간동안 처리한 후MTT 분석법으로 세포생존율을 측정하였으며, 그 결과 MPP+에 의해 농도 의존적으로 SH-SY5Y 세포의생존율을 감소시켰고, 특히 1 mM에서 약 60%의 세포생존율을 보여 신약개발과정의 후보약물 스크리닝단계에서 신경세포 보호효능을 평가할 수 있는 적절한 농도로 결정하였다. 이를 이용하여 신처방 진뇌산추출물의 신경세포 보호 효능을 평가해 본 결과, 10,50, 100 μg/ml에서 농도 의존적으로 세포생존율을 증가시켰고, 이보다 더 고농도(300 μg/ml)에서는 오히려 생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 이를 이용하여 신처방 진뇌산추출물의 신경세포 보호 효능을 평가해 본 결과, 10,50, 100 μg/ml에서 농도 의존적으로 세포생존율을 증가시켰고, 이보다 더 고농도(300 μg/ml)에서는 오히려 생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과, LY294002와 PD98059 각각의 전처리는 MPP+로 인한 미토콘드리아의 기능 손상을 억제하였던 진뇌산 추출물의 보호효능을 거의 완벽하게막는 것을 확인하였다(Figure 6C). 이를 통하여 진뇌산의 신경세포 보호 효능에 Akt와 ERK의 활성화가직접적으로 관여한다는 것을 알 수 있었다.
- Apoptosis 과정에서 caspases도중요한 역할을 하는데, 세포의 정상 상태에서는 핵과 미토콘드리아 외막에 불활성 상태인 pro-enzyme 형태로 존재하다가, 세포 내부 또는 외부의 다양한 자극에 의하여 분해됨으로써 활성화되어 caspase cascade의 순서대로 다양한 표적 단백질들을 활성화시켜 apoptosis를 유발한다27). 진뇌산 추출물이 MPP+로유도된 apoptosis를 억제할 수 있는지 apoptosis와관련된 단백질들을 western blot으로 분석한 결과, MPP+가 미토콘드리아 막에 존재하는 Bcl-2 family중 anti-apoptotic protein인 Bcl-2를 감소시키고, caspase cascade 경로의 가장 하위단계인 caspase-3의 proform이 감소되고, 이것의 표적단백질인 PARP의 proform도 감소되는 것으로 보아 활성화가 일어나 미토콘드리아 의존적인 내인성 경로의 apoptosis가잘 유도된 것을 알 수 있었다. 반면, 진뇌산 추출물의 처리는 MPP+에 의한 Bcl-2와 caspase-3 및PARP의 proform들의 감소를 억제시켜 control군의 발현량과 거의 비슷한 것을 확인할 수 있었다.
- 를 처리하여 24시간 후 MTT 분석법으로 확인하였다. 측정한 결과 1 mM의 MPP+를 처리한 대조군과 비교하였을 때, 진뇌산 추출물의 전처리는 농도 의존적으로세포생존율이 증가하는 것을 알 수 있었다(Figure 2).
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