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가설 설정
- 따라서, 추후에 보다 많은 수의 산모를 대상으로 한 연구를 통하여 보다 정확한 수유기간에 따른 단백의 변화를 연구하고, 한국인 산모의 대표성 있는 단백질 구성을 조사할 필요가 있다. 둘째로, 산모들의 식이를 조절할 수 없었다는 것이다. 비록, 일부 연구에서는 다른 주장을 하기도 하지만, 현재까지 일반적으로는 대부분의 영양 성분은 식이에 최소한의 영향만을 받는다고 알려져 있다.
제안 방법
- 1주, 3주, 6주가 경과된 산모의 모유 시료 중에서 시료 군마다 각각 2 개를 선정하였고, 이들을 합쳐서 총 3 개의 시료를 만들었다.
- 컬럼에 흐르는 용액의 유속은 200 nL/min, 컬럼의 오븐 온도는 40 o C, 질량의 측정 범위는 400~1600 m/z로 설정하였고, CID activation type에서 양이온(+) 모드로 측정하였으며, maximum missed cleavage는 2, dynamic exclusion은 30 초로 설정하여 분석하였다. MS/MS 방식으로 분석된 펩타이드는 uniprot의 human database (http://www.uniprot.org/) 2015, 11, 22 version 을 토대로 SEQUEST알고리즘을 이용하는 Proteome Discoverer 1.3으로 동정하였다. 펩타이드 동정 시 XCorr scores는 각각 +1가, +2가, +3가인 펩타이드에 대하여 각각 1.
- 05로 적용하였다. Spectral count 방법으로 각 단백질의 상대적인 발현량을 계산 하였다.
- Urea에 용해된 단백질은 2D-Protein Quant Kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)를 통해 농도를 측정 하였다. 이 중에 300 µg의 단백질을 5 mM TCEP (Tris (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)와 10 mM Iodoacetamide를 이용하여 reduction 및 carbamidomethylation 을 하였다.
- 각 단백질 별 NSpC 값은 Human database로부터 동정된 단백질들의 결과는 정규화된(Normalization) spectral count (NSpC)6-8 값을 얻기 위해 엑셀로 추출하였다. 각각의 단백질 k에 대해서 NSpC는 다음과 같다.
- 단백질 k에 속하는 펩타이드와 일치하는 모든 ms/ ms spectral count (SpC)를 단백질 k의 길이(L)로 나눈 값을 전체 결과 데이터에서 동정된 n개의 단백질의 SpC/L 합계로 나누었다.
- 동정된 전체 단백질에 대한 GO분석을 진행하였고,그 결과를 Table 2에 나타내었다. 통계분석을 통해 얻은 P-value 값에 따라서 나열하였다.
- 이 시료들을 다시 3 개의 튜브에 동일한 양을 담아 총 9 개의 시료를 준비하였 다. 모유의 대부분을 차지하는 casein을 제거하여 소 량으로 존재하는 단백질의 동정을 용이하게 하기 위 하여 단백질체 분석 전 시료 내의 casein 단백질을 제거하였다. 5 카제인 단백질의 제거 하는 실험 방법은 다음과 같다.
- 시료의 질량을 확인하기 위해 일자형 이온트랩(LTQ ion trap, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 을 이용해 electrospray 방식으로 이온화하여 분석하 였다. 준비된 시료는 C18이 들어있는 365 μm o.
- 이 연구의 목적은 출산 후 1, 3, 6주가 경과한 산모에서 얻은 모유의 단백체 발현 패턴과 과 발현 단백질을 검출하는 것으로 주로 단백질 대부분의 함량에 해당하는 casein 단백질을 제거하고 난 후 단백질들을 샷 건 단백체 분석방법 적용하였다. Spectra counting 방식으로 각 주의 모유에서 가장 많은 양에 해당하는 15개의 단백질을 동정할 수 있었으며, 시료당 최소 80개에서 109 개의 단백질을 동정하였다.
- 이 중에 300 µg의 단백질을 5 mM TCEP (Tris (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)와 10 mM Iodoacetamide를 이용하여 reduction 및 carbamidomethylation 을 하였다.
- 17 그러나, 잘 알려져 있는 것처럼, 생후 1개월 내에는 모유가 초유에서 이행유로 변화하면서 성분에 있어 큰 변화가 일어나는 것으로 알려져 있다. 이에 본 연구에서는 이 시기의 모유의 변화를 보다 자세히 알아보고자, 분만 후 2개월 내의 시기를 보다 세분화하여 분만 후 1, 3, 6주의 산모에게서 모유를 얻어, 단백체를 분석하였으며, 한국인 산모의 모유에서 단백 발현 패턴을 제시하고, 수유 시기에 따른 성분의 변화를 비교 분석하였다.
- 준비된 시료는 C18이 들어있는 365 μm o.d. × 100 μm i.d. fused-silica capillary 컬럼 (5 µm × 15 cm) 을 이용하여 역상크로마토그래피 방식으로 분리하였 다.
- 1 % formic acid를 사용하였고, 총 분석 시간은 170 분으로 125 분간 B용액을 5%에서 60 % 까지, 125 분부터 140 분까지는 80 %까지 기울기 용 리 조건을 주었으며, 140 분부터는 5 % B용액을 흘려 주었다. 컬럼에 흐르는 용액의 유속은 200 nL/min, 컬럼의 오븐 온도는 40 o C, 질량의 측정 범위는 400~1600 m/z로 설정하였고, CID activation type에서 양이온(+) 모드로 측정하였으며, maximum missed cleavage는 2, dynamic exclusion은 30 초로 설정하여 분석하였다. MS/MS 방식으로 분석된 펩타이드는 uniprot의 human database (http://www.
대상 데이터
- 1주, 3주, 6주가 경과된 산모의 모유 시료 중에서 시료 군마다 각각 2 개를 선정하였고, 이들을 합쳐서 총 3 개의 시료를 만들었다. 이 시료들을 다시 3 개의 튜브에 동일한 양을 담아 총 9 개의 시료를 준비하였 다. 모유의 대부분을 차지하는 casein을 제거하여 소 량으로 존재하는 단백질의 동정을 용이하게 하기 위 하여 단백질체 분석 전 시료 내의 casein 단백질을 제거하였다.
- fused-silica capillary 컬럼 (5 µm × 15 cm) 을 이용하여 역상크로마토그래피 방식으로 분리하였 다. 이동상은 (A) water with 0.1 % formic acid와 (B) ACN with 0.1 % formic acid를 사용하였고, 총 분석 시간은 170 분으로 125 분간 B용액을 5%에서 60 % 까지, 125 분부터 140 분까지는 80 %까지 기울기 용 리 조건을 주었으며, 140 분부터는 5 % B용액을 흘려 주었다. 컬럼에 흐르는 용액의 유속은 200 nL/min, 컬럼의 오븐 온도는 40 o C, 질량의 측정 범위는 400~1600 m/z로 설정하였고, CID activation type에서 양이온(+) 모드로 측정하였으며, maximum missed cleavage는 2, dynamic exclusion은 30 초로 설정하여 분석하였다.
- 3에 나타내었다. 총 8 개로 구분하였다. 그 중 (A) defense response, (B) immunoglobulin, (C) inflammatory,(G) glycoprotein 에서는 1주에서 6주로 갈수록 감소하는 경향을 보였는데, 감소하는 카테고리의 단백질들의 경우 공통적으로 당 단백질들이 포함이 되어 있다.
데이터처리
- 위의 식을 이용하여 동정된 각 단백질의 상대적인 발현량을 계산하였고, 1, 3, 6주차의 시료 각각 3반복에서 재현성있게 동정된 63 개의 단백질에 대하여 분산분석을 통하여 1, 3, 6주에서 통계적으로 유의하게 발현량의 차이를 보이는 25 개의 단백질을 검출하였다
성능/효과
- 11 또한 산모가 가지고 있는 면역성분들이 모유의 경우 유방상피세포를 통해 이동하고 유방 분비를 통해서 유방 밖으로 옮겨져 신생아에게 전달이 된다. 12 (D) vesicle, (F) duplication,(H) cerebrovascular disease에서는 1주차에서 3주 차로 가면서 감소하다가 3주 차에서 6주 차에는 증가하는 경향을 보였으며, (E) extracellular region 에서는 1주 차에서 3주 차로 가면서 증가하다가 3주 차에서 6주 차에는 감소하는 경향을 보였다.
- 4 이러한 PTM (post translational modification)은 단백질의 구조와 기능에 크게 영향을 줄 수 있고, 그것들을 분해하는 생화학 반응에도 영향을 줄 수 있다. 4 최근 본 연구자들은 분만 후 15일, 2개월, 6개월의 모유 샘플을 분석하여 한국인의 모유 내 단백체 구성이 2~6개월 사이에 유의하게 변화하는 것을 발견하였다. 17 그러나, 잘 알려져 있는 것처럼, 생후 1개월 내에는 모유가 초유에서 이행유로 변화하면서 성분에 있어 큰 변화가 일어나는 것으로 알려져 있다.
- 앞선 유전자의 기능의 카테고리별 단백질 패턴에서와 같이 lg lambda7 chain C region 단백질은 면역 기능에 중요한 역할을 하는 당 단백질 중 하나로 모유에 구성성분으로 알려져 있다. 5,13 tenascin 단백질의 경우도 시간이 경과함에 따라서 급격하게 감소하는 경향을 보였는데,tenascin단백질은 조직 복구에 역할을 하며, 상처치료에 관여하거나 태아의 발생에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며,14 Sallie R. Permar 논문에서는 tenascin단백질이 HIV에 어떻게 결합하여 신생아들의 감염으로 보호 해주는 지에 대한 연구결과를 보여주었다.15
- 이 연구의 목적은 출산 후 1, 3, 6주가 경과한 산모에서 얻은 모유의 단백체 발현 패턴과 과 발현 단백질을 검출하는 것으로 주로 단백질 대부분의 함량에 해당하는 casein 단백질을 제거하고 난 후 단백질들을 샷 건 단백체 분석방법 적용하였다. Spectra counting 방식으로 각 주의 모유에서 가장 많은 양에 해당하는 15개의 단백질을 동정할 수 있었으며, 시료당 최소 80개에서 109 개의 단백질을 동정하였다. 이 들 단백질 중 GO 분석을 통해 biological process 범주에서 regulationof mitochondrial membrane permeability 관련 단백질과, cellular component category에서 mitochondrion 관련 단백질이 높은 P-value 갑을 보여주었으며, 유전자의 기능 범주 별로 단백질 정량 패턴 또한 확인할 수 있었다.
- 4에 정리하였다. lg lambda-7 chain C region 단백질과 경우는 1주 차에서 3주 차로 시간에 따라서 정량 값이 현저하게 감소하는 경향을 보였으며, 6주 차에는 정량값이 0으로 줄어든 것을 확인하였다. 앞선 유전자의 기능의 카테고리별 단백질 패턴에서와 같이 lg lambda7 chain C region 단백질은 면역 기능에 중요한 역할을 하는 당 단백질 중 하나로 모유에 구성성분으로 알려져 있다.
- 셋째, 비록 영하 80도의 초저온 냉동고에서 실험이 이루어질 때까지 냉동보관을 하여 단백의 파괴를 최소화 하려고 노력하였으나, 보관 중 파괴되는 일정부분의 효과가 본 연구의 결과에 영향을 주었을 수도 있다. 그 중 lg lambda-7 chain C region 단백질과5 tenascin 단백질은 시간이 경과함에 따라서 급격하게 감소하는 경향의 결과를 얻어냈다. 시간이 지날수록 모유의 구성성분 들 중 중요한 역할을 하는 성분들이 감소하는 경향을 질량분석을 통해 확인 함으로써 산모의 모유를 보관하는 방법이나 처리하는 방법의 중요성이 대두될 것으로 예상하며, 시간이 경과하더라도 성분들의 변화를 최소화 하여 영양학적으로 균질 하게 보존이 되는 것이 중요하다.
- 2에 나타내었다. 동정된 단백질들의 pI 값은 6~7에서 가장 높게 나타났고, 대부분 5~10 사이에서 분포하는 것을 알 수 있었다. 또한, 질량 값의 경우는 10~20 kDa에 가장 많이 분포하고 있으며 대부분 10~70 kDa 사이에 분포하며, 특이적으로 150 kDa 이상의 질량 값을 가지는 단백질들도 확인할 수 있었다.
- 동정된 단백질들의 pI 값은 6~7에서 가장 높게 나타났고, 대부분 5~10 사이에서 분포하는 것을 알 수 있었다. 또한, 질량 값의 경우는 10~20 kDa에 가장 많이 분포하고 있으며 대부분 10~70 kDa 사이에 분포하며, 특이적으로 150 kDa 이상의 질량 값을 가지는 단백질들도 확인할 수 있었다.
- 시간이 지날수록 모유의 구성성분 들 중 중요한 역할을 하는 성분들이 감소하는 경향을 질량분석을 통해 확인 함으로써 산모의 모유를 보관하는 방법이나 처리하는 방법의 중요성이 대두될 것으로 예상하며, 시간이 경과하더라도 성분들의 변화를 최소화 하여 영양학적으로 균질 하게 보존이 되는 것이 중요하다. 본 결과를 통해서 샷건 단백체 분석방법을 모유시료에 적용 가능함을 확인 하였으며, 함량이 높은 casein 단백질을 제거하기 때문에, 상대적으로 분석이 어려웠던 적은 함량의 단백질을 동정 하였다. 또한 본 연구에서 사용된 분석방법을 이용하여, 다양한 조건의 모유시료에 적용하여,생물학적 의의를 찾고자 하는 추후연구를 진행 할 수있을 것으로 기대된다.
- Casein 단백질을 제거한 모유의 단백질에서는 최소 80 개의 단백질에서 108개의 단백질이 동정 되었다. 생물학적 반복실험을 통해서 시료마다, 1주 모유 시료는 107 개, 108개, 92 개가 동정 되었고, 3주 모유 시료는 80 개, 81 개, 88 개가 동정되었으며, 6주 모유 시료는 102 개, 80 개, 89 개의 단백질이 동정 되었다.
- 따라서, 이에 관한 추후 연구도 필요할 것으로 판단된다. 셋째, 비록 영하 80도의 초저온 냉동고에서 실험이 이루어질 때까지 냉동보관을 하여 단백의 파괴를 최소화 하려고 노력하였으나, 보관 중 파괴되는 일정부분의 효과가 본 연구의 결과에 영향을 주었을 수도 있다. 그 중 lg lambda-7 chain C region 단백질과5 tenascin 단백질은 시간이 경과함에 따라서 급격하게 감소하는 경향의 결과를 얻어냈다.
- Spectra counting 방식으로 각 주의 모유에서 가장 많은 양에 해당하는 15개의 단백질을 동정할 수 있었으며, 시료당 최소 80개에서 109 개의 단백질을 동정하였다. 이 들 단백질 중 GO 분석을 통해 biological process 범주에서 regulationof mitochondrial membrane permeability 관련 단백질과, cellular component category에서 mitochondrion 관련 단백질이 높은 P-value 갑을 보여주었으며, 유전자의 기능 범주 별로 단백질 정량 패턴 또한 확인할 수 있었다. 그러나, 본 연구에는 몇 가지 제한 점이 있다.
- 잘 알려진 단백질 중 Lactoferrin은 단백질, 철분, 콜레스테롤의 산화방지제 역할을 하는 항균성의 단백질로 알려져 있으며 또한 transferrin family에 속하는 당 단백질이다. 이외에도 carboxylic ester hydrolase, clusterin과 같은 glycoproteins, metabolic enzyme, chaperon enzyme 등도 동정된 것으로 확인되었다.
- 그러나, 본 연구에는 몇 가지 제한 점이 있다. 첫째로, 분석한 모유가 모두 세 명의 산모로부터 채취한 것으로, 결과를 일반화 하거나, 통계적으로 분석한 결과를 신뢰하기에 그 수가 작다. 하지만, 기술적으로 아직은 질량분석을 대규모로 시행하기에는 무리가 있었다.
후속연구
- 16 하지만, 총 단백질 양이 아닌 단백체에 미치는 영향은 아직 연구된 바는 없다. 따라서, 이에 관한 추후 연구도 필요할 것으로 판단된다. 셋째, 비록 영하 80도의 초저온 냉동고에서 실험이 이루어질 때까지 냉동보관을 하여 단백의 파괴를 최소화 하려고 노력하였으나, 보관 중 파괴되는 일정부분의 효과가 본 연구의 결과에 영향을 주었을 수도 있다.
- 하지만, 기술적으로 아직은 질량분석을 대규모로 시행하기에는 무리가 있었다. 따라서, 추후에 보다 많은 수의 산모를 대상으로 한 연구를 통하여 보다 정확한 수유기간에 따른 단백의 변화를 연구하고, 한국인 산모의 대표성 있는 단백질 구성을 조사할 필요가 있다. 둘째로, 산모들의 식이를 조절할 수 없었다는 것이다.
- 본 결과를 통해서 샷건 단백체 분석방법을 모유시료에 적용 가능함을 확인 하였으며, 함량이 높은 casein 단백질을 제거하기 때문에, 상대적으로 분석이 어려웠던 적은 함량의 단백질을 동정 하였다. 또한 본 연구에서 사용된 분석방법을 이용하여, 다양한 조건의 모유시료에 적용하여,생물학적 의의를 찾고자 하는 추후연구를 진행 할 수있을 것으로 기대된다.
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