미토콘드리아는 산화적 인산화와 연결된 전자전달을 통하여 에너지 생산에 중추적인 역할을 갖는다. 이 외에도 미토콘드리아는 신진대사, 세포자멸, 신호전달 그리고 활성산소 생성 등의 다양한 기능을 수행한다. 따라서, 미토콘드리아의 기능장애는 여러 인체질환에 영향을 준다는 것이 명백하다. 또한, 미토콘드리아 DNA의 돌연변이는 에너지 신진대사에 결함이 있는 여러 유전성 질환의 원인을 제공한다. 불행하게도 아직 이러한 유전성 미토콘드리아 DNA 질환의 치료법은 전무한 상태이다. 이러한 관점에서, 결함 미토콘드리아를 정상 미토콘드리아로 치환하는 최근의 시도는 큰 주목을 받고 있다. 본 연구에서는 녹색형광단백질로 표지된 미토콘드리아를 원심분리에 기반하여 생화학적으로 분리하고, 분리된 미토콘드리아를 동물복제에 쓰이는 미세주입 기법으로 소 난자에 전달 하였다. 이러한 미토콘드리아가 미세주입된 난자에서 단위발생을 유도하여 배반포 단계까지의 초기 발생과정에서 미토콘드리아 미세주입의 영향을 분석하였다. 미토콘드리아에 표지된 녹색형광단백질을 형광현미경으로 분석함으로써 미세주입으로 난자에 전달된 미토콘드리아는 빠르게 세포질에서 분산되고, 이 후 발생되는 딸세포에게 전달됨이 확인되었다. 따라서, 본 연구에서 수행된, 미세주입을 이용한 미토콘드리아의 전달은 최근 활발히 연구되는 미토콘드리아 치환 기법, 유전성 미토콘드리아 DNA 질환 치료법 및 동물복제 등에 유용한 모델로의 기여가 기대된다.
미토콘드리아는 산화적 인산화와 연결된 전자전달을 통하여 에너지 생산에 중추적인 역할을 갖는다. 이 외에도 미토콘드리아는 신진대사, 세포자멸, 신호전달 그리고 활성산소 생성 등의 다양한 기능을 수행한다. 따라서, 미토콘드리아의 기능장애는 여러 인체질환에 영향을 준다는 것이 명백하다. 또한, 미토콘드리아 DNA의 돌연변이는 에너지 신진대사에 결함이 있는 여러 유전성 질환의 원인을 제공한다. 불행하게도 아직 이러한 유전성 미토콘드리아 DNA 질환의 치료법은 전무한 상태이다. 이러한 관점에서, 결함 미토콘드리아를 정상 미토콘드리아로 치환하는 최근의 시도는 큰 주목을 받고 있다. 본 연구에서는 녹색형광단백질로 표지된 미토콘드리아를 원심분리에 기반하여 생화학적으로 분리하고, 분리된 미토콘드리아를 동물복제에 쓰이는 미세주입 기법으로 소 난자에 전달 하였다. 이러한 미토콘드리아가 미세주입된 난자에서 단위발생을 유도하여 배반포 단계까지의 초기 발생과정에서 미토콘드리아 미세주입의 영향을 분석하였다. 미토콘드리아에 표지된 녹색형광단백질을 형광현미경으로 분석함으로써 미세주입으로 난자에 전달된 미토콘드리아는 빠르게 세포질에서 분산되고, 이 후 발생되는 딸세포에게 전달됨이 확인되었다. 따라서, 본 연구에서 수행된, 미세주입을 이용한 미토콘드리아의 전달은 최근 활발히 연구되는 미토콘드리아 치환 기법, 유전성 미토콘드리아 DNA 질환 치료법 및 동물복제 등에 유용한 모델로의 기여가 기대된다.
Mitochondria play a central role in energy generation by using electron transport coupled with oxidative phosphorylation. They also participate in other important cellular functions including metabolism, apoptosis, signaling, and reactive oxygen species production. Therefore, mitochondrial dysfuncti...
Mitochondria play a central role in energy generation by using electron transport coupled with oxidative phosphorylation. They also participate in other important cellular functions including metabolism, apoptosis, signaling, and reactive oxygen species production. Therefore, mitochondrial dysfunction is known to contribute to a variety of human diseases. Furthermore, there are various inherited diseases of energy metabolism due to mitochondrial DNA (mtDNA) mutations. Unfortunately, therapeutic options for these inherited mtDNA diseases are extremely limited. In this regard, mitochondrial replacement techniques are taking on increased importance in developing a clinical approach to inherited mtDNA diseases. In this study, green fluorescence protein (GFP)-tagged mitochondria were isolated by differential centrifugation from a mammalian cell line. Using microinjection technique, the isolated GFP-tagged mitochondria were then transferred to bovine oocytes that were triggered for early development. During the early developmental period from bovine oocytes to blastocysts, the transferred mitochondria were observed using fluorescent microscopy. The microinjected mitochondria were dispersed rapidly into the cytoplasm of oocytes and were passed down to subsequent cells of 2-cell, 4-cell, 8-cell, morula, and blastocyst stages. Together, these results demonstrate a successful in vitro transfer of isolated mitochondria to oocytes and provide a model for mitochondrial replacement implicated in inherited mtDNA diseases and animal cloning.
Mitochondria play a central role in energy generation by using electron transport coupled with oxidative phosphorylation. They also participate in other important cellular functions including metabolism, apoptosis, signaling, and reactive oxygen species production. Therefore, mitochondrial dysfunction is known to contribute to a variety of human diseases. Furthermore, there are various inherited diseases of energy metabolism due to mitochondrial DNA (mtDNA) mutations. Unfortunately, therapeutic options for these inherited mtDNA diseases are extremely limited. In this regard, mitochondrial replacement techniques are taking on increased importance in developing a clinical approach to inherited mtDNA diseases. In this study, green fluorescence protein (GFP)-tagged mitochondria were isolated by differential centrifugation from a mammalian cell line. Using microinjection technique, the isolated GFP-tagged mitochondria were then transferred to bovine oocytes that were triggered for early development. During the early developmental period from bovine oocytes to blastocysts, the transferred mitochondria were observed using fluorescent microscopy. The microinjected mitochondria were dispersed rapidly into the cytoplasm of oocytes and were passed down to subsequent cells of 2-cell, 4-cell, 8-cell, morula, and blastocyst stages. Together, these results demonstrate a successful in vitro transfer of isolated mitochondria to oocytes and provide a model for mitochondrial replacement implicated in inherited mtDNA diseases and animal cloning.
본 연구에서는 차별적 원심분리(differential centrifugation) 기법[3]을 이용하여 동물세포에서 미토콘드리아를 분리하고, 분리된 미토콘드리아를 소의 난자에 미세주입(microinjection) 기법을 통해 전달하였다. 분리하여 전달된 미토콘드리아는 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP)로 표지되어 있어, 전달된 미토콘드리아를 보유한 난자가 배반포(blastocyst) 단계까지의 초기 발생 단계를 거치는 동안 미세주입된 미토콘드리아를 형광현미경으로 관찰하였다.
본 연구에서는 차별적 원심분리(differential centrifugation) 기법[3]을 이용하여 동물세포에서 미토콘드리아를 분리하고, 분리된 미토콘드리아를 소의 난자에 미세주입(microinjection) 기법을 통해 전달하였다. 분리하여 전달된 미토콘드리아는 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP)로 표지되어 있어, 전달된 미토콘드리아를 보유한 난자가 배반포(blastocyst) 단계까지의 초기 발생 단계를 거치는 동안 미세주입된 미토콘드리아를 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과로 미세주입된 미토콘드리아가 초기 발생과정에서 생성되는 여러 세포에게 전달됨을 확인할 수 있었다.
대상 데이터
도축장에서 회수한 소 난소를 39℃의 PBS가 담겨 있는 보온병에 넣어 실험실로 운반하였다. PBS로 3~4차례 세척을 한 후 18 gauge 주사침이 부착된 10 ml 주사기의 압력을 이용하여 2~5 mm의 난포로부터 난포액 및 난자/난구세포복합체를 회수하였다.
본 실험에 사용된 HeLa/mito-GFP 세포주[16]는 GFP가 미토콘드리아에 과발현된 동물세포주이며 조동형 박사(경희대학교)로부터 제공받았다. 세포배양은 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 배양액(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 사용하여 통상적인 37℃, 5% CO2의 배양조건에서 이루어졌다.
데이터처리
또한, 세포의 핵은 Hoechst 33342 형광염색으로 관찰하였다. 미토콘드리아 미세주입이 초기 발생 과정의 분할과 상실배/배반포 형성에 미치는 영향에 대한 통계분석은 Prism 7 software (GraphPad, La Jolla, USA)를 이용한 One-way ANOVA로 검정하였으며, 사후검증으로는 Tukey test를 실시하였다. p<0.
이론/모형
세포배양은 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 배양액(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 사용하여 통상적인 37℃, 5% CO2의 배양조건에서 이루어졌다. 미토콘드리아 분리는 아래 간략히 기술된 전통적인 differential centrifugation 기법[3]을 사용하였다. 80~90% confluency를 보이는 세포배양에서 scraper를 이용하여 세포를 수집한 후, 원심분리하여 세포를 침전시켰다.
성능/효과
분리하여 전달된 미토콘드리아는 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP)로 표지되어 있어, 전달된 미토콘드리아를 보유한 난자가 배반포(blastocyst) 단계까지의 초기 발생 단계를 거치는 동안 미세주입된 미토콘드리아를 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과로 미세주입된 미토콘드리아가 초기 발생과정에서 생성되는 여러 세포에게 전달됨을 확인할 수 있었다. 이러한 미세전달을 이용한, 분리된 미토콘드리아의 세포내 전달은 향후 mitochondrial replacement를 응용한 새로운 질환 치료법이나 동물복제에 활용될 것으로 기대된다.
마지막으로, 미토콘드리아 미세주입은 단위발생이 유도된 난자의 분할과정이나 상실배/배반포 형성과정을 크게 방해하지 않았다(Fig. 5). 미세주입이 없었던 경우 그리고 완충액을 미세주입한 경우를 미토콘드리아를 미세주입한 경우와 비교하였을 때, 이들 사이에서 분할율과 상실배/배반포 형성율에 대한 통계적인 차이는 없었다.
4). 이러한 형광현미경 관찰 결과는 미세주입으로 미토콘드리아가 체외에서(in vitro) 전달될 수 있음을 분명히 보여주며, 또한 이러한 최초 미세주입된 미토콘드리아가 배반포 형성 단계까지의 초기 발생과정에서 생성되는 딸세포에게 전달될 수 있음을 제시한다.
후속연구
이러한 연구결과는 미토콘드리아 전달이 실제로 체내에서 이루어지며, 최소한 세포간의 에너지대사 복구에 필요함을 시사한다. 따라서, 본 연구에서 제시된, 분리된 미토콘드리아를 미세주입을 통하여 난자로 전달하는 시스템은 향후 유전성 mtDNA 질환의 제어나 동물복제에 기여될 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
미토콘드리아의 역할은 무엇인가?
미토콘드리아는 산화적 인산화와 연결된 전자전달을 통하여 에너지 생산에 중추적인 역할을 갖는다. 이 외에도 미토콘드리아는 신진대사, 세포자멸, 신호전달 그리고 활성산소 생성 등의 다양한 기능을 수행한다.
미토콘드리아는 산화적 인산화를 제외하고 세포내에서 어떤 기능들을 수행하는가?
미토콘드리아는 산화적 인산화와 연결된 전자전달을 통하여 에너지 생산에 중추적인 역할을 갖는다. 이 외에도 미토콘드리아는 신진대사, 세포자멸, 신호전달 그리고 활성산소 생성 등의 다양한 기능을 수행한다. 따라서, 미토콘드리아의 기능장애는 여러 인체질환에 영향을 준다는 것이 명백하다.
미토콘드리아 DNA의 돌연변이에 의한 질병의 치료현황은 어떠한가?
또한, 미토콘드리아 DNA의 돌연변이는 에너지 신진대사에 결함이 있는 여러 유전성 질환의 원인을 제공한다. 불행하게도 아직 이러한 유전성 미토콘드리아 DNA 질환의 치료법은 전무한 상태이다. 이러한 관점에서, 결함 미토콘드리아를 정상 미토콘드리아로 치환하는 최근의 시도는 큰 주목을 받고 있다.
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