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문제 정의
- 본 연구에서는 국내 돌기해삼(Stichopus japonicus)의 게놈 DNA에서 2 또는 3 염기 반복서열을 갖는 14개 microsatellite 좌위, AH075, AH204, AH025, AH198, AJ19270, AH028, AJ03, AJ78245, AJ08658, Psj2575, Psj2409, AJ14707, AJ19024 및 AH144를 한꺼번에 증폭시킬 수 있는 multiplex PCR 시스템을 개발하였으며, 이를 이용하여 서해안에서 채집된 해삼 286 개체의 유전자형을 조사하고, 이들의 법과학적 지표들을 분석함으로써 이 시스템의 해삼 개체식별 및 친자확인 검사 활용 가능성을 평가하였다.
제안 방법
- Multiplex PCR에 반응을 위해서 시료 DNA 약 10-30 ng, hot-start Taq polymerase (Genetbio, Korea) 1 unit, 10X PCR buffer 2 μL, dNTP 200 mM, MgCl 2 mM, 그리고 primer mix 2 μL를 혼합하여 최종 반응 용액이 15 μL가 되게 하였다.
- 반응물은 증류수로 20배 희석하고 0.2 μL를 취해 GeneScan™ 500 LIZ (Applied Biosystems, USA)와 Hi-Di™ Formamide (Thermo Fisher Scientific, USA)를 함께 혼합하여 98℃에서 1분간 변성시킨(denaturation) 다음, POP-7 ™ polymer (Thermo Fisher Scientific, USA)를 채운 36 cm 모세관을 장착한 Applied Biosystems 3130x1 자동염기서열분석장치(Applied Biosystems, USA)에서 60℃로 전기영동하였다.
- 유전자형(genotype) 분석은 GeneMapper® ID v3.1 (Applied Biosystems, USA)에서 500 LIZ size standard와 비교하여 대립유전자를 분석하였다.
- 2을 통해 dememorization number=10,000, number of batches=5,000 그리고 number of iterations per batch=10,000의 조건으로 수행하였다(Guo and Thompson, 1992). 정보력(polymorphism information content), 식별력(power of discrimination), 일치율(matching probability) 그리고 배제력(power of exclusion) 등과 같은 주요 법과학적 지표들은 PowerState v1.2 프로그램(Promega, USA)을 이용해 산출하였다(Tereba, 1999). 누적일치율은 ∏ni=1 (1-Pdi) 공식에 따라 산출하였고 누적부권배제력은 1-∏ni=1(1-PEi)공식으로 구하였다(Jones, 1972; Krüger et al.
대상 데이터
- 연구에 사용된 좌위는 Zhan et al. (2007), Chen et al. (2013), Kanno et al. (2005)이 보고한 돌기해삼의 microsatellite 좌위들 중에서 대립유전자 수가 8개 이상이고, multiplex 반응에서 증폭효율이 상대적으로 높으며, 대립유전자의 분포가 서로 겹치지 않는 좌위 14개를 선정하였다. Multiplex PCR에 반응을 위해서 시료 DNA 약 10-30 ng, hot-start Taq polymerase (Genetbio, Korea) 1 unit, 10X PCR buffer 2 μL, dNTP 200 mM, MgCl 2 mM, 그리고 primer mix 2 μL를 혼합하여 최종 반응 용액이 15 μL가 되게 하였다.
- 해삼 시료는 인천에서 70개체, 대천에서 70개체, 군산에서 74개체, 부안에서 72 개체를 수집하였다. DNA추출은 해삼돌기 끝부분 약 2 mm를 잘라 Ivanova et al.
데이터처리
- FSTAT 2.9.3 프로그램(Lausanne University, Switzerland)을 이용하여 각 좌위별 유전자다양성(gene diversity), 대립유전자 수(number of alleles)를 산출하였다(Goudet, 2001). 하디-와이버그 평형상태(hardy-weinberg equilibrium exact test, HWE) 검정은 GENEPOP v4.
- nA, Number of observed alleles; Heobs, Observed heterozygosity; GD, Gene diversity; PIC, Polymorphism information content; PD, Power of discrimination; MP, Matching probability; PE, Power of exclusion; HWE, Hardy-Weinberg equilibrium exact test.
이론/모형
- 해삼 시료는 인천에서 70개체, 대천에서 70개체, 군산에서 74개체, 부안에서 72 개체를 수집하였다. DNA추출은 해삼돌기 끝부분 약 2 mm를 잘라 Ivanova et al. (2006)의 방법에 따라 추출 하였다.
- 누적일치율은 ∏ni=1 (1-Pdi) 공식에 따라 산출하였고 누적부권배제력은 1-∏ni=1(1-PEi)공식으로 구하였다(Jones, 1972; Krüger et al., 1968).
- 3 프로그램(Lausanne University, Switzerland)을 이용하여 각 좌위별 유전자다양성(gene diversity), 대립유전자 수(number of alleles)를 산출하였다(Goudet, 2001). 하디-와이버그 평형상태(hardy-weinberg equilibrium exact test, HWE) 검정은 GENEPOP v4.2을 통해 dememorization number=10,000, number of batches=5,000 그리고 number of iterations per batch=10,000의 조건으로 수행하였다(Guo and Thompson, 1992). 정보력(polymorphism information content), 식별력(power of discrimination), 일치율(matching probability) 그리고 배제력(power of exclusion) 등과 같은 주요 법과학적 지표들은 PowerState v1.
성능/효과
- 14개 좌위의 누적일치율은 9.64×10-19 였으며, 누적부권배제력은 0.999995로 매우 높게 나타났다.
- 1). AH025, AH028, AJ19024 좌위의 이형접합자(heterozygote)중 반복횟수가 많은 일부 대립유전자에서 주 peak의 높이와 비교해 평균 10-30% 높이의 stutter peak가 관찰되었으나, 유전자형 분석 프로그램인 GeneMapper에서 대립유전자를 자동 지정하는 과정에 아무런 영향을 끼치지 않았다. 그 외의 좌위들에서는 stutter peak가 관찰되지 않거나 주 대립유전자 peak 높이와 비교해 평균 5% 이내로 나타났다.
- Microsatellite 14좌위의 multiplex PCR 결과 14좌위 모두 한번의 반응으로 안정적으로 증폭되었다(Fig. 1). AH025, AH028, AJ19024 좌위의 이형접합자(heterozygote)중 반복횟수가 많은 일부 대립유전자에서 주 peak의 높이와 비교해 평균 10-30% 높이의 stutter peak가 관찰되었으나, 유전자형 분석 프로그램인 GeneMapper에서 대립유전자를 자동 지정하는 과정에 아무런 영향을 끼치지 않았다.
- 999995로 확인되었는데, 이는 본 연구에서 개발한 multiplex PCR 시스템이 생물학적 부모개체를 정확히 찾아낼 수 있는 능력을 가지고 있음을 의미한다. 따라서 본 연구의 14좌위 microsatellite multiplex PCR 시스템은 기존 DNA분석법에 비해 소요 비용과 시간을 획기적으로 절감시킬 수 있기에 매우 경제적인 DNA분석법이라 할 수 있다. 또한 이 DNA분석 시스템이 가지는 고도의 개체식별력과 높은 부권배제력은 본 연구의 분석시스템이 돌기해삼의 개체식별과 친자확인에서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것임을 시사한다.
- 분석된 14개 microsatellite 좌위의 평균 식별력은 0.93으로 매우 높았으며, 14개 좌위를 multiplex PCR을 통해 한번에 분석하였을 때의 누적일치율은 9.64×10-19로써, 극도로 높은 개체식별력을 제공해준다고 할 수 있다.
- , 2004). 이런 연구 결과와 비교했을 때 본 연구에서 관찰된 stutter peak의 높이는 일반적인 평균 높이 보다는 낮은 stutter peak 높이를 보임을 알 수 있다. HWE 평형상태 검정에서는 AH204와 AH144를 제외한 모든 좌위에서 평형이탈을 나타냈다.
- 64×10-19로써, 극도로 높은 개체식별력을 제공해준다고 할 수 있다. 한편, 14개 좌위의 누적부권배제력(combined PE)은 0.999995로 확인되었는데, 이는 본 연구에서 개발한 multiplex PCR 시스템이 생물학적 부모개체를 정확히 찾아낼 수 있는 능력을 가지고 있음을 의미한다. 따라서 본 연구의 14좌위 microsatellite multiplex PCR 시스템은 기존 DNA분석법에 비해 소요 비용과 시간을 획기적으로 절감시킬 수 있기에 매우 경제적인 DNA분석법이라 할 수 있다.
- 해삼 286 개체 게놈 DNA상의 14개 microsatellite 좌위에서 확인된 대립유전자는 총 269개였으며, 그 중 AJ19024좌위는 46개로 대립유전자 숫자가 가장 많았으며, 관측이형접합률 0.89, 유전자다양성지수 0.95, 유전자정보력 0.95, 식별력 0.99, 부권배제력 0.76으로 14개 좌위 중 분석한 모든 법과학적 지표들이 가장 높게 나타났다(Table 2). 반면 Psj2575좌위는 8개의 대립유전자만 발견되었고 유전자다양성지수 0.
후속연구
- 따라서 본 연구의 14좌위 microsatellite multiplex PCR 시스템은 기존 DNA분석법에 비해 소요 비용과 시간을 획기적으로 절감시킬 수 있기에 매우 경제적인 DNA분석법이라 할 수 있다. 또한 이 DNA분석 시스템이 가지는 고도의 개체식별력과 높은 부권배제력은 본 연구의 분석시스템이 돌기해삼의 개체식별과 친자확인에서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것임을 시사한다.
- , 2002). 하지만 이 경우에는 수 많은 대립유전자들을 한번에 명확하게 구분할 수 있어야 하기에, 목적한 PCR 산물 이외의 비특이적 증폭 또는 stutter peak의 생성을 최소화하기 위한 최적 증폭시발체(primer)의 선발 및 다중중합효소연쇄반응의 최적 조건 확립 연구가 선행되어야 한다(Berg et al., 2000). 또한 자동염기서열분석장치 등 자동화 장치를 통해 분석의 재현성과 신뢰성을 극대화하여 결과의 과학적 안정성을 확보하여야 한다(Hill et al.
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